SNP-array分析在超聲波檢測頸項透明層增厚胎兒的遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用 *

歐陽魯平，劉文慧，覃秀云，王 錦，孫惟佳

(1.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室，南寧 530001；2.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科，廣西桂林 541100；3.南寧市第四人民醫(yī)院超聲影像科，南寧 530023)

頸項透明層(nuchal translucency，NT)指妊娠11～13+6周胎兒頸后皮下液體積聚的厚度，在超聲影像上是胎兒頸后皮下的無回聲帶，為妊娠早期篩查胎兒染色體非整倍體異常的重要指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用于臨床。研究報道，NT增厚不僅與胎兒染色體異常有關(guān)，還與胎兒嚴(yán)重心臟畸形、某些胎兒遺傳疾病等密切相關(guān)[1]。單核苷酸多態(tài)芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)技術(shù)是新興的分子核型檢測技術(shù)，具有眾多優(yōu)勢：如高分辨率、高通量、高敏感性和高準(zhǔn)確性等，優(yōu)于傳統(tǒng)的G顯帶檢測方法。本文對130例NT≥3.0 mm的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，在染色體核型分析基礎(chǔ)上加上SNP-array芯片技術(shù)檢測，并隨訪其妊娠結(jié)局，探討SNP-array芯片技術(shù)檢測對胎兒NT增厚胎兒產(chǎn)前診斷的臨床意義，為臨床決策、預(yù)后評估和遺傳咨詢提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 取自2017年1月～2018年6月，在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳門診就診的孕婦，行早孕期超聲篩查的130例11～13+6周NT增厚(NT≥3.0 mm)胎兒，行介入性產(chǎn)前診斷，絨毛取樣活檢術(shù)。行染色體核型及SNP-array檢測，孕婦簽署知情同意書后，隨訪記錄妊娠結(jié)局。

1.2 儀器與方法

1.2.1 儀器：應(yīng)用GE Voluson E8，Philips iu22，Siemens ACUSON Sequoia 512及S200彩色多普勒超聲診斷儀，經(jīng)腹部超聲檢查探頭頻率2.0～6.0 MHz，經(jīng)陰道超聲檢查探頭頻率5.0～8.0 MHz；超凈工作臺，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，定時烘箱，醫(yī)用低速離心機(jī)，高速離心機(jī)(Labnet，美國)，PCR擴(kuò)增儀(ABI，美國)，iScan(illumina，美國)，高速冷凍離心機(jī)(Thermo，美國)，Lab-Aid 820核酸提取儀(廈門至善，中國)等。

1.2.2 超聲篩查NT測量方法：檢查前向孕婦告知孕11～13+6周胎兒超聲篩查的重要性與局限性，并簽署知情同意書。NT測量在正中矢狀切面上進(jìn)行，胎體自然屈曲，盡可能放大圖像，僅顯示胎頭和上胸部，使游標(biāo)尺的輕微移動只改變測量結(jié)果的0.1 mm。測量時注意辨別胎兒皮膚及羊膜。測量頸后皮下無回聲帶的最大厚度，至少測量3次，取最大值。

1.2.3 介入性產(chǎn)前診斷：130例孕婦于孕早期11～13周經(jīng)腹行胎兒絨毛活檢術(shù)，抽取絨毛組織25 mg。

1.2.4 絨毛DNA提?。翰捎肣IAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國)試劑盒來提取基因組DNA，并運用SNP-array檢測；NanoDrop2000(Thermo Fisher scientific INC，美國)測定DNA濃度，需要保證DNA濃度大于50 ng/L，A260nm/A280nm處在1.8～2.0范圍。

1.2.5 絨毛染色體核型分析步驟：倒置解剖鏡按照本實驗室制定絨毛分離法[2]，分離出干凈的絨毛標(biāo)本，常規(guī)培養(yǎng)，觀察，收獲標(biāo)本，適宜環(huán)境下滴片，80℃烤6h，采用G顯帶，顯微鏡下計數(shù)與分析。顯微鏡下計數(shù)20個核型，分析5個核型，遇到嵌合體加倍計數(shù)。

1.2.7 SNP-array檢測：應(yīng)用美國Affymetrix CytoScan 750K芯片平臺對這些樣本進(jìn)行基因拷貝數(shù)變異(CNVs)分析。實驗操作嚴(yán)格按照Affymetrix公司提供的操作流程。用Affymetrix 7G掃描儀掃描芯片，掃描信號圖經(jīng)過Affymetrix的Chas軟件分析和計算。

1.2.8 SNP-array檢測的判斷和評價：數(shù)據(jù)分析參照本實驗室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫以及DGV，DECIPHER，UCSC，OMIM等公共官網(wǎng)數(shù)據(jù)庫。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 根據(jù)NT值統(tǒng)計所有入選病例的染色體核型與SNP-array檢測結(jié)果，隨訪胎兒異常情況及妊娠結(jié)局。應(yīng)用SSPS19.0軟件進(jìn)行分析，資料分析采用卡方檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析 130例胎兒NT增厚病例行絨毛膜取樣活檢。95例染色體核型正常，35例染色體核型異常(26.9%)，其中13-三體5例；18-三體8例；21-三體10例；45，X：3例，47，XXX：1例；47，XYY：1例；嵌合體3例；46，XY，inv(9)(p12q13)：2例；46，XY，der(11)t(4；11)(q28.1；q24.3)：1例；46，XY，der(14；21)(q10；q10)，+21：1例。

2.2 SNP-array檢測結(jié)果 130例胎兒NT增厚病例行絨毛膜取樣活檢，提取DNA行SNP-array檢測。86例基因芯片拷貝數(shù)正常，44例基因芯片拷貝數(shù)異常(33.8%)。

2.3 基因芯片與核型分析對絨毛標(biāo)本檢出異常情況 核型分析檢出遺傳異常35例，基因芯片檢出異常44例，兩種技術(shù)檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.23P<0.05)；同時染色體核型分析結(jié)果與基因芯片結(jié)果不一致以及隨訪結(jié)果。11例超聲波指征為：NT增厚，結(jié)果見表1。

表1 11例SNP部分微缺失、微重復(fù)的陽性結(jié)果

3 討論

NT測量是早孕期最簡單有效的提示胎兒染色體異常的篩查方法之一。2004年，英國胎兒基金會建議早孕期產(chǎn)前篩查內(nèi)容包括孕婦年齡、NT三項、血清學(xué)篩查，可使21-三體綜合征的篩查率高達(dá)80%～90%之間。最近幾年國內(nèi)對于NT檢查在染色體非整倍體的篩查作用也給予了肯定[3]。此外，NT異常與心臟畸形、不良妊娠結(jié)局、發(fā)育遲緩等也有相關(guān)性[4]。對于NT增厚的具體生理機(jī)制目前尚無明確的理論解釋，主要有以下觀點[5]：與胎兒染色體的異常、貧血及低蛋白血癥、淋巴系統(tǒng)異常和回流受阻、頸部淋巴回流障礙，過多的淋巴液積聚于頸后胎兒心臟畸形繼發(fā)心力衰竭有關(guān)。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) NT增厚的胎兒中14.2%并發(fā)染色體異常[6]。NT增厚染色體正常的胎兒，其不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率隨著NT測量值的增高而增高，主要表現(xiàn)為先天性心臟病[7-9]。

傳統(tǒng)的染色體核型分析需要經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)、制片、染色等復(fù)雜手段，且其分辨率一般為5M～10M。但小于5M的小片段的拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNV)，常規(guī)核型分析技術(shù)難以發(fā)現(xiàn)。并且染色體培養(yǎng)的過程較困難，存在一定的細(xì)胞培養(yǎng)失敗概率，為后期的分析和發(fā)報告造成困難?；蛐酒瑱z測是近年發(fā)展起來的分子生物學(xué)檢測方法，其特點是分辨率高、檢測速度快、檢測通量高，可分辨出100K以內(nèi)的染色體片段變異。由于該基因芯片檢測不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，因此其適用于細(xì)胞培養(yǎng)較難成功的檢測樣本，或者有明顯癥狀但常規(guī)核型分析未檢出異常的樣本。染色體微陣列分析技術(shù)包括基于微陣列的比較基因組雜交(array based Comparative Genomic Hibridization，aCGH)技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)，能夠在全基因組水平進(jìn)行檢測染色體不平衡的拷貝數(shù)變異，且較染色體核型分析具有更高的分辨率和敏感度，目前廣泛應(yīng)用于胎兒異常的產(chǎn)前診斷。單核苷酸多態(tài)芯片(array single nucleotide polymorphism，array-SNP)技術(shù)是一項新興的分子分析技術(shù)，能夠在全基因組水平進(jìn)行掃描，檢出100kb以下的基因拷貝數(shù)變異，除了能檢出非整倍體異常，還能檢測核型分析無法發(fā)現(xiàn)的低水平拷貝數(shù)變異、染色體雜合性缺失等拷貝數(shù)正常的染色體異常，進(jìn)一步檢測出染色體微缺失或微重復(fù)所涉及的基因、發(fā)生的位置以及片段大小，優(yōu)于傳統(tǒng)的G顯帶檢測方法。但目前基因芯片無法分析染色體的結(jié)構(gòu)變異[10]，本文中染色體核型除了檢出13-三體5例，18-三體8例，21-三體10例，45，X：3例，47，XXX：1例，47，XYY：1例，嵌合體3例，還檢出2例46，XN，inv(9)(p12q13)，這是芯片檢測技術(shù)不能檢出的，因此在產(chǎn)前診斷時基因芯片檢測與常規(guī)染色體分析同時實施檢測。SNP-array檢測技術(shù)能提高致病性CNVs的檢出率，建議NT增厚胎兒應(yīng)同時行傳統(tǒng)染色體核型和SNP-array檢測分析。

本研究通過檢測130例胎兒NT增厚的胎兒樣本，染色體核型異常檢出35例，檢出率26.9%(35/130)，SNP-array檢出44例異常，檢出率33.8%(44/130)，SNP-array異常檢出率明顯高于染色體核型異常檢出率，并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對彩色多譜勒胎兒NT增厚的胎兒樣本，SNP-array檢測有助于發(fā)現(xiàn)染色體核型分析無法檢出的染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常，SNP-array有利于提高對NT增厚胎兒遺傳病因的診斷。應(yīng)用SNP-array檢測胎兒NT增厚樣本進(jìn)行檢測，異常檢出率提高了6.9%，稍微低于楊鑫等[11]人報道的7.69%，但SNP-array技術(shù)可明顯提高疾病的診斷率。SNP-array檢測不經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，少量胎兒組織的基因組DNA就達(dá)到檢測目的，有助于排除致病性染色體微缺失/微重復(fù)綜合征，避免患兒出生，得以減少出生缺陷率。本文中共計有9例絨毛染色體核型結(jié)果未見異常，而芯片檢出染色體微缺失、微重復(fù)，4例為染色體微缺失，其中2例涉及16號染色體上微缺失，檢測為α-珠蛋白生成障礙性貧血，有研究稱，NT增厚對胎兒染色體異常、心臟畸形和重型α-珠蛋白生成障礙性貧血等多種異常有較好預(yù)測價值[12]；4例為染色體微重復(fù)，以及1例父源性9號染色體單親二倍體。故在核型分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行SNP-array檢測除了能避免胎兒染色體平衡重組、以及低比例嵌合及多倍體的漏診風(fēng)險，對染色體核型明確診斷出來的非整倍體異常樣本，則需再行SNP-array檢測分析，為患者減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。王敏等[13]發(fā)現(xiàn)，對NT異常的胎兒產(chǎn)前診斷可使用染色體核型分析聯(lián)合染色體微陣列檢測形式，可覆蓋染色體微缺失微重復(fù)，對產(chǎn)前診斷具有重要指導(dǎo)意義。NT增厚易致圍生兒死亡，有研究稱NT增厚的病例可預(yù)后不良，但仍有近一半NT增厚的病例在后期的隨訪消失，當(dāng)排除胎兒染色體方面異常及結(jié)構(gòu)異常，單純NT增厚仍然可健康存活[14-15]。

綜上所述，通過核型分析與SNP-array檢測能覆蓋大部分染色體的異常，SNP技術(shù)則對致病性CNV檢出有明顯優(yōu)勢。但仍存不足，在染色體平衡易位、染色體倒位的檢測中具有不可替代的作用[16]。NT增厚作為產(chǎn)前檢測的重要指征，行常規(guī)染色體核型分析并行SNP分析，以獲得更多的遺傳學(xué)信息，為NT增厚預(yù)后評估及遺傳咨詢提供更優(yōu)的臨床決策。