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    β-谷甾醇乙酸酯對脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

    2019-10-15 08:23:04侯麗芬宗珊盈張海臣王宏雁谷克仁
    食品與機械 2019年9期
    關(guān)鍵詞:甾醇冷凍干燥脂質(zhì)體

    侯麗芬 - 宗珊盈 - 張海臣 -潘 麗 王宏雁 - 谷克仁, -,

    (1. 河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院,河南 鄭州 450001;2. 鄭州旅游職業(yè)學(xué)院烹飪食品系,河南 鄭州 450009;3. 中檢集團中原農(nóng)食產(chǎn)品檢測〔河南〕有限公司,河南 鄭州 450003;4. 吉林工程職業(yè)學(xué)院糧油食品學(xué)院,吉林 四平 136001;5. 河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)糧油食品學(xué)院,河南 鄭州 450001)

    近年來,納米脂質(zhì)體用于食品中生物活性物質(zhì)的包封和控釋已成為一種有效的手段。脂質(zhì)體已成功應(yīng)用于包覆抗菌肽[1]、兒茶素[2]、乳鐵蛋白[3]、抗壞血酸[4]、VE[5]和ω-3脂肪酸[6]等生物活性物質(zhì)。脂質(zhì)體通常是由一個或多個磷脂雙分子層包裹一定體積的水相構(gòu)成的囊泡[1, 7],主要由兩親性物質(zhì)(如磷脂和甾醇等)制備[8]。膽固醇影響天然或合成膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)膜的剛性、厚度、穩(wěn)定性和流動性[9-11]。盡管膽固醇可以改善脂質(zhì)體膜的特性,但患有高膽固醇血癥患者應(yīng)避免食用含膽固醇的食物。

    植物甾醇有降低膽固醇作用,其結(jié)構(gòu)與膽固醇類似,也含有環(huán)戊烷全氫菲骨架,僅在支鏈甲基和雙鍵上存在差別。目前已有很多研究[12-14]發(fā)現(xiàn)植物甾醇能夠代替膽固醇來構(gòu)建穩(wěn)定的脂質(zhì)體。與植物甾醇相比,植物甾醇酯具有較高的脂溶性,同等或更優(yōu)的生物活性[15-16],而對于植物甾醇酯摻入脂質(zhì)體中的研究較少。Alexander等[17]采用植物甾醇酯制備大豆磷脂脂質(zhì)體提高了水溶性制劑抗壞血酸的包封率。Wang等[18]采用高壓均質(zhì)法制備植物甾醇和植物甾醇酯大豆磷脂脂質(zhì)體,為傳遞生物活性成分提供了一種實用的方法。然而,關(guān)于植物甾醇酯作為輔助膜材對脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的研究尚未見報道。試驗擬通過薄膜—超聲法制備β-谷甾醇乙酸酯(β-Sitosterol Acetate Ester,SAE)脂質(zhì)體,考察其不同摻入濃度對脂質(zhì)體粒徑、PDI、電位及儲藏穩(wěn)定性的影響,并探究SAE與磷脂在膜中的相互作用,以期為相關(guān)研究提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    大豆磷脂(SPC):純度98%,沈陽天峰生物制藥有限公司;

    β-谷甾醇(β-Sitosterol,Sito):純度98%,上海依赫生物科技有限公司;

    β-谷甾醇乙酸酯(SAE):純度97%,實驗室自制;

    磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯仿、甲醇等:分析純。

    1.2 儀器

    超聲波信號發(fā)生器:HN-500型,上海超聲漢諾儀器有限公司;

    旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:RE52-AA型,上海亞榮生化儀器廠;

    真空冷凍干燥機:VFD-2000型,上海比朗儀器制造有限公司;

    傅立葉變換紅外光譜儀:PerkinElmer Spectrum TWO型,美國鉑金埃爾默股份有限公司;

    激光納米粒度儀:Zetasizer Nano ZS90型,英國馬爾文儀器有限公司;

    熱重儀:TGA Q50型,美國TA儀器公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 脂質(zhì)體的制備 分別精密稱取一定量的SPC(80 mg)、tween-80(60 mg)和SAE(Sito)(2,4,6,8 mg),置于圓底燒瓶中,加入10 mL有機溶劑(體積比為2∶1的三氯甲烷—甲醇溶液,)常溫溶解,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑(控制真空度0.06 MPa,水浴溫度50 ℃),使壁材在圓底燒瓶壁形成一層均勻透明的薄膜,在真空度0.1 MPa下繼續(xù)旋蒸30 min,注入0.02 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS,pH 7.4,0.15 mol/L NaCl)10 mL水化脂質(zhì)薄膜10 min。所得乳液在冰浴條件下,探頭超聲(200 W,8 min,脈沖1 s/1 s),得到呈現(xiàn)淡藍(lán)色乳光的脂質(zhì)體,4 ℃冷藏保存待分析。按相同方法制備不含SAE(Sito)的空白脂質(zhì)體。

    1.3.2 脂質(zhì)體的粒徑、多分散指數(shù)(PDI)和電位的測定

    用高純水稀釋脂質(zhì)體100倍,采用 Zetasizer Nano ZS90(DLS)測定其平均粒徑、PDI和電位。PDI反映的是脂質(zhì)體粒徑分布情況,范圍為0~1。PDI<0.3,說明脂質(zhì)體呈現(xiàn)較好的單一性分散[19]。樣品測量前,25 ℃下平衡20 s,每個樣品測量3次,每次至少運行10次,數(shù)據(jù)表示為(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。

    1.3.3 脂質(zhì)體乳液的儲藏穩(wěn)定性 將制備好的脂質(zhì)體放置于冰箱4 ℃左右,分別選取貯藏0,7,15,21,30 d的樣品,按照1.3.2方法采用DLS測定其粒徑、PDI和電位。

    1.3.4 脂質(zhì)體的冷凍干燥 取1.3.1制備的脂質(zhì)體10 mL 于50 mL燒杯中,移入冷凍干燥機,首先在-20 ℃ 預(yù)冷凍4 h,然后在真空度1.0 MPa下,程序控溫保持38 h,得到脂質(zhì)體冷凍產(chǎn)品。

    1.3.5 紅外光譜分析 取少量1.3.4制備的冷凍干燥樣品,采用PerkinElmer UATR TWO傅立葉紅外光譜儀,全反射光譜測定法進(jìn)行測定。光譜測定范圍4 000~400 cm-1,儀器分辨率4 cm-1,掃描次數(shù)16。

    1.3.6 熱重(TGA)分析 TGA分析脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性。冷凍干燥樣品加熱溫度范圍40~600 ℃,升溫速率10 ℃/min,氮氣流速60 mL/min。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用Origin 8.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)分析,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 粒徑與PDI

    采用薄膜—超聲法制備小單室脂質(zhì)體,SAE的不同摻入量對脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響如圖1所示。由圖1可知,隨著SAE摻入量的增加,保持其他成分不變,加入0~6 mg SAE的脂質(zhì)體粒徑無顯著差別(P<0.05),增加至8 mg時,粒徑顯著增大。PDI隨著SAE摻入量的增加而逐漸增大,其中2 mg和4 mg的PDI無明顯差異,分別為0.22和0.23。試驗中SAE最大添加量8 mg,但是此時得到的脂質(zhì)體粒徑和PDI與對照樣品相比均明顯增大,可能是因為超出了其溶解度而破壞了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。甾醇酯在磷脂膜中的溶解度很低,Zajicek等[20]報道膽固醇酯在完全水化的磷脂雙層膜中溶解度非常有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于膽固醇。同時,Salmon等[21]研究表明膽固醇酯的最大摻入量隨鏈長的增加而降低,例如蛋黃卵磷脂構(gòu)成的多層膜中膽固醇酯的摻入量從膽固醇辛酸酯摩爾分?jǐn)?shù)的5%到硬脂酸酯摩爾分?jǐn)?shù)的1.4%,但是小單室脂質(zhì)體的最大摻入量比多層膜高1.2~2.0倍。

    圖1 SAE摻入量對脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響

    Figure 1 The effects of SAE incorporation on particle size and polydispersity index of liposome

    Sito的不同摻入量對脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響如圖2 所示。由圖2可知,隨著Sito摻入量的增加對粒徑無明顯影響,而對PDI值有緩慢增加的趨勢。已有研究[22]表明少量加入Sito對粒徑影響不大,可能是少量Sito的加入填補了磷脂分子間的空隙,而對粒徑無顯著影響。同時Samar等[23]研究得出膽固醇在低濃度下(摩爾分?jǐn)?shù)<5%)未顯現(xiàn)出增強DPPC膜有序性的作用。Sito與膽固醇結(jié)構(gòu)相似,在脂質(zhì)體膜中有相似的作用。

    圖2 Sito摻入量對脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響

    通過對比得出,在添加量為2,4 mg時,SAE和Sito有相似的粒徑和PDI。

    試驗中摻入SAE的脂質(zhì)體電位與對照樣品無顯著差異,為-19.1~-20.5 mV。Monica等[24]同樣采用薄膜—超聲法制備了含有膽固醇硬脂酸酯的脂質(zhì)體,發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體電位有稍微的降低。這一點在試驗中不明顯。

    2.2 儲藏穩(wěn)定性

    SAE和Sito不同摻入量脂質(zhì)體在4 ℃下放置不同時間的粒徑變化如圖3所示。由圖3(a)看出,在4 ℃下0~15 d,2~4 mg SAE脂質(zhì)體粒徑先增加后減小;15 d后粒徑緩慢增大。而對于6~8 mg SAE脂質(zhì)體來說,放置不同時間后,粒徑均比0 d小,而且無明顯規(guī)律性;這主要是由于此濃度下的脂質(zhì)體在放置過程中出現(xiàn)不同程度的絮狀沉淀(試驗過程中肉眼觀察),導(dǎo)致樣品取樣不均勻,同時也反映出其儲藏穩(wěn)定性較差。由圖3(b)可知,2~4 mg Sito脂質(zhì)體與相同摻入量的SAE脂質(zhì)體變化一致。而6~8 mg Sito脂質(zhì)體隨著放置時間的延長,粒徑緩慢增大,但無沉淀出現(xiàn),與楊斌等[25]的研究結(jié)果相一致。

    SAE和Sito不同摻入量脂質(zhì)體在4 ℃下放置不同時間的PDI變化如圖4所示。SAE摻入量為2,4 mg的脂質(zhì)體PDI變化與Sito摻入量為2~8 mg的脂質(zhì)體PDI變化一致,呈現(xiàn)先降低然后增加的趨勢;且放置21 d后,均低于未摻入SAE和Sito的脂質(zhì)體。而6~8 mg SAE脂質(zhì)體的PDI由于放置過程中出現(xiàn)沉淀導(dǎo)致檢測樣品不均勻,因此無參考價值。

    在4 ℃下儲藏,與Sito脂質(zhì)體相比較,SAE脂質(zhì)體摻入量為2,4 mg的粒徑變化較小,在30 d內(nèi)可以保持較好的粒度分布性,說明其具有較好的儲藏穩(wěn)定性。

    2.3 紅外光譜分析

    經(jīng)過冷凍干燥的SAE和Sito脂質(zhì)體紅外光譜見圖5。波數(shù)2 925 cm-1和2 850 cm-1分別與CH2不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動有關(guān),表明脂質(zhì)膜雙層?;湹淖兓痆26]。由表1可知,少量SAE和Sito的摻入并未與酰基鏈發(fā)生明顯作用,同時與膜的界面羰基水化狀態(tài)有關(guān)的C═O對稱伸縮振動峰(V C═O)也未發(fā)生明顯變化。但是,空白脂質(zhì)體的P═O反對稱伸縮振動峰(Vas P═O)為1 246 cm-1,而SAE脂質(zhì)體遷移至1 241(2 mg),1 245(4 mg) cm-1,Sito脂質(zhì)體遷移至1 243(2 mg),1 245(4 mg)cm-1。同時,可以看到P═O對稱伸縮振動峰(Vs P═O),從空白脂質(zhì)體的1 096 cm-1移至SAE脂質(zhì)體的1 088,1 094 cm-1,Sito脂質(zhì)體移至1 089,1 092 cm-1,且相應(yīng)的峰強度也發(fā)生了變化。Vas P═O和Vs P═O降低說明脂質(zhì)體與外來物質(zhì)間的氫鍵增強了[27]。與Sito脂質(zhì)體不同的是 (CH3)3N對稱伸縮峰[V(CH3)3N],SAE脂質(zhì)體由968 cm-1變?yōu)?70 cm-1(2 mg)和965 cm-1(4 mg);而Sito脂質(zhì)體無明顯變化,丁武孝等[28]也研究發(fā)現(xiàn)膽固醇的羥基與季銨基團無靜電作用。

    圖3 SAE和Sito摻入脂質(zhì)體在4 ℃下放置

    Figure 3 The effects of incorporation of SAE and Sito on particle size of liposomes at 4 ℃ at different times

    圖4 SAE和Sito摻入脂質(zhì)體在4 ℃下放置

    Figure 4 The effects of SAE and Sito incorporation on polydispersity index of liposomes placed at 4 ℃ at different times

    由上可知,SAE摻入脂質(zhì)體中與磷脂的P═O和(CH3)3N之間有明顯相互作用,而Sito僅與磷脂的P═O產(chǎn)生氫鍵。氫鍵的形成說明摻入物質(zhì)與磷脂在脂質(zhì)膜中結(jié)合緊密,有利于膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[29]。

    圖5 SAE摻入脂質(zhì)體的紅外圖譜

    圖6 Sito摻入脂質(zhì)體的紅外圖譜

    表1 不同脂質(zhì)體對應(yīng)的紅外特征峰的波數(shù)

    2.4 熱重分析

    采用熱重法(TGA)測定冷凍干燥后SAE、Sito和未摻入脂質(zhì)體經(jīng)歷高溫的物理化學(xué)變化,如圖7所示。熱重分析結(jié)果顯示,未摻入脂質(zhì)體最后剩余質(zhì)量的48.0%;2,4 mg SAE脂質(zhì)體分別為46.4%和46.7%;Sito脂質(zhì)體為47.1%,無顯著差異(P<0.05)。圖7中顯示了不同脂質(zhì)體的降解曲線,第一階段重量的減少主要與樣品中含有水分和揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān)[30-31],未摻入脂質(zhì)體減少2.5%、2 mg SAE和4 mg SAE脂質(zhì)體分別減少為3.4%和3.7%、4 mg Sito脂質(zhì)體減少1.8%。在較高速率降解階段,2,4 mg SAE脂質(zhì)體分別在187~358,218~337 ℃時,穩(wěn)定性高于未摻入脂質(zhì)體;4 mg Sito脂質(zhì)體在183~314 ℃時,穩(wěn)定性高于未摻入脂質(zhì)體。這是由于摻入SAE和Sito能使脂質(zhì)體極性基團的氫鍵增強。張繼芬等[29]也發(fā)現(xiàn)外來物質(zhì)與磷脂形成氫鍵后會一定程度提高脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性。

    圖7 SAE、Sito和未摻入脂質(zhì)體的TGA分析

    3 結(jié)論

    試驗將SAE摻入大豆磷脂脂質(zhì)體中,考察其對所構(gòu)建的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。研究證明低摻入量的SAE脂質(zhì)體粒度分布均勻,微觀形貌較好,且具有較好的儲藏穩(wěn)定性。少量添加SAE與膜中磷脂分子極性頭基形成氫鍵,提高了脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性,起到了與Sito相似的穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)的作用。SAE保留了Sito大部分的官能團,摻入脂質(zhì)體中還可能會引起脂質(zhì)體的抗氧化性、包埋和釋放性能的改變,因此,需要進(jìn)一步開展相關(guān)的研究。

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