回溫抑制鮮切馬鈴薯褐變及影響游離氨基酸代謝的研究

徐 鑫，姚 堯，王慶國，劉 佩

（山東農業(yè)大學食品科學與工程學院/山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東 泰安 271018）

0 引言

馬鈴薯營養(yǎng)全面豐富，是繼水稻、小麥、玉米后中國第四大糧食作物，被稱為“能源植物”、“地下蘋果”、“第二面包”等[1]。馬鈴薯鮮切產品薯條、薯片、薯塊等越來越受到人們的喜愛，市場消費量較大。但是鮮切馬鈴薯由于切割所造成的機械傷會引發(fā)一系列的生理生化變化，如褐變、失水、腐爛、異味等，其中褐變是影響鮮切產品質量的主要問題[2-3]。

多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)是鮮切馬鈴薯褐變的關鍵酶，研究表明通過人工合成小RNA的方法 沉 默 PPO 基 因 (StuPPO1、StuPPO2、StuPPO3、StuPPO4)能有效抑制馬鈴薯的褐變[4]。PPO和過氧化物酶(peroxidase，POD)能夠氧化植物組織中酚類及氨基酸底物形成鄰醌，醌自身的聚合以及與蛋白質、氨基酸等物質間的聚合可促進組織褐變的加重[5-6]。研究表明，馬鈴薯中游離酪氨酸是PPO 催化的主要底物[7]。然而，目前關于馬鈴薯其他內源性的游離氨基酸變化與酶促褐變之間關聯性的研究還較少。Thybo[8]研究表明，游離天冬氨酸含量高的馬鈴薯品種鮮切后易褐變；Ali等[5]對鮮切馬鈴薯進行外源氨基酸涂抹實驗，研究表明高濃度纈氨酸可與醌類形成褐色加合物加重褐變，半胱氨酸則與醌類形成無色加合物而減輕褐變[9]。

馬鈴薯采收后通常于2～4℃下低溫貯藏，以減輕失水、發(fā)芽和腐爛從而延長馬鈴薯銷售期。但經長時間低溫貯藏的馬鈴薯，在鮮切加工過程中，表面更易發(fā)生褐變[10]。回溫處理適用于經冷庫低溫貯藏的馬鈴薯，并具有諸多優(yōu)勢，如安全、高效、能減少低溫貯藏導致的還原糖積累，減輕馬鈴薯在高溫烘焙、油炸過程中與游離氨基酸發(fā)生美拉德反應，產生類黑素[11-12]等。前人研究發(fā)現回溫處理對抑制鮮切蘋果、洋姜和馬鈴薯褐變有較好的效果[13-15]，但褐變機理的相關研究并不深入，且馬鈴薯中游離氨基酸的變化與褐變之間的關聯并不明確。

筆者針對低溫貯藏后的馬鈴薯，采用20℃回溫處理20 天，研究在回溫及鮮切后低溫貯藏過程中，馬鈴薯PPO 和POD 酶活性、游離氨基酸及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的變化，探究回溫處理對鮮切馬鈴薯褐變控制的生理機制，旨在為鮮切馬鈴薯的貯藏保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用馬鈴薯品種為‘荷蘭15號’，于2017年2月購于萊蕪市楊莊鎮(zhèn)聚富食品有限公司，已于2℃冷庫貯藏8個月，紙箱內襯保鮮袋網套包裝，運至山東省泰安市山東農業(yè)大學食品科學與工程學院2～4℃冷庫。

1.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱，濟南科達爾實業(yè)有限公司；紫外分光光度計T6 新世紀，北京普析通用儀器有限責任公司；2004-21(501)超級恒溫水浴鍋，國華儀器有限公司；Beckman Allegra 64R 高速冷凍離心機，美國Beckman公司；-80℃超低溫冰箱，中科美菱；超聲波振蕩器，上海生析超聲儀器有限公司；微型冷庫，濟南科達爾實業(yè)有限公司；CR-400 色差計，日本柯尼卡美能達儀器有限公司；液氮研磨儀，德國IKA 公司；高效液相色譜儀，日本島津LC-20AT；C18液相色譜柱，日本島津。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備 挑選180個大小一致、形狀均勻、無機械損傷、無發(fā)芽、無綠變、無病蟲害的馬鈴薯，將氯苯胺靈（質量濃度為30 mg/kg）溶于乙醇，與1 kg 細沙混勻后均勻地撒施于馬鈴薯表面，用于抑制馬鈴薯發(fā)芽。將馬鈴薯每10 個裝入一個聚乙烯袋（尺寸為240 mm×350 mm）中，均分為2 組（每組9 袋馬鈴薯），一組為對照，于2～4℃冷庫20 天；一組為回溫處理組，于20℃恒溫箱中處理20天；

每組9 袋馬鈴薯，其中6 袋用于回溫處理前后取樣，3袋馬鈴薯用于鮮切后觀測及取樣。

回溫前、回溫后2個取樣點進行取樣，每個取樣點3個重復，取樣后用液氮速凍，置于超低溫冰箱(-80℃)中備用，樣品用于PPO活性、POD活性、游離氨基酸和MDA含量的測定。

鮮切過程如下：將馬鈴薯用清水洗凈，紗布擦干后，次氯酸鈉溶液(200 μL/L)中消毒5 min；去皮，切成3～5 mm的薄片，放入50 μL/L的次氯酸鈉溶液中消毒約15 s后用紗布吸干表面水分。將馬鈴薯切片隨機混勻，分別裝入13 個聚乙烯袋中（尺寸為175 mm×250 mm），每袋10 片馬鈴薯，袋口折疊，于2～4℃冷庫中貯藏。

鮮切后觀測及取樣過程如下：對照和處理各7袋，在切后0、1、2、4、6、8、12 天分別進行拍照和色差測定。其余6袋在切后0、0.5、1、2、4、6天取樣，每個取樣點3個重復，用液氮冷凍并放入-80℃超低溫冰箱，分別用于PPO活性、POD活性、游離氨基酸和MDA含量的測定。

1.3.2 褐變度等級評定與標準制定 將不同褐變程度的馬鈴薯片進行比較，制定了馬鈴薯褐變程度的等級標準。1=無褐變；2=輕微褐變（面積≤5%）；3=中度褐變（5%＜面積≤20%）；4=褐變較嚴重（20%＜面積≤50%）；5=褐變嚴重（面積＞50%）。

1.3.3 色差測定 對不同褐變程度的馬鈴薯片進行色差測定。每個重復隨機取8片，每個處理3個重復。使用柯尼卡美能達公司的CR-400 色差計測定馬鈴薯切片粗糙面的顏色值(L*、a*)，每次測定前以標準白度(L*=97.06，a*=0.04)對色差計進行校準。

1.3.4 PPO 活性測定 粗酶液的提取及PPO 酶活性測定參考Baltacio?lu等[16]的方法并加以改進。依次向試管中加入2 mL pH 6.8 的磷酸緩沖液、20 mmol/L 鄰苯二酚溶液1 mL、粗酶液0.4 mL，混勻后，立即測定在420 nm 下的吸光值每30 s 的變化，測定連續(xù)6 組數據。以1 g 馬鈴薯樣品（鮮重）每分鐘吸光度值變化0.01為1個酶活性單位(U)。

1.3.5 POD 活性測定 采用愈創(chuàng)木酚比色法[17]測定POD酶活性。以1 g馬鈴薯樣品（鮮重）每分鐘內吸光度變化為1 個酶活性單位(U)。POD 活性的測定波長為470 nm。

1.3.6 游離氨基酸含量測定 馬鈴薯游離氨基酸的提取參考Kumar 等[18]的方法，分別配制16 種游離氨基酸（酪氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸）標準樣品(0.1 mg/mL)。游離氨基酸樣品的分析采用日本島津LC-20AT 高效液相色譜，色譜柱型號為Inertsil ODS-3 5020-01731，方法參照輕工行業(yè)標準QB/T 4356—2012[19]。

1.3.7 MDA含量測定 稱取1 g馬鈴薯樣品，加入4 mL 10%三氯乙酸，勻漿后4℃、10000 r/min 離心15 min 得到上清待測液。MDA 含量參照硫代巴比妥酸煮沸法測定[20]。

圖1 鮮切馬鈴薯褐變等級

表1 褐變等級標準及相關色差值

1.4 數據分析

所有實驗均重復3 次，不同處理方法間的數據使用SPSS 17 軟件的鄧肯法進行顯著性差異分析，顯著性水平為0.05，使用Excel 2010軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 鮮切馬鈴薯褐變等級標準的制定

馬鈴薯經低溫貯藏后，鮮切加工過程易發(fā)生褐變，在開發(fā)馬鈴薯褐變抑制方法的過程中，為了更好地對馬鈴薯褐變進行觀察記錄，首先制定了鮮切馬鈴薯褐變等級標準，并測定了相應的馬鈴薯片表面的L*和a*值，如圖1、表1所示，后續(xù)實驗過程中鮮切馬鈴薯的褐變均嚴格參照此標準進行評定。

2.2 回溫處理對鮮切馬鈴薯褐變程度及L*、a*值的影響

低溫貯藏后的馬鈴薯塊莖于20℃回溫20天，鮮切后低溫貯藏期間，進行觀察并拍照（圖2）。由圖2 可知，對照2天即出現較嚴重褐變，而回溫處理的馬鈴薯鮮切后8天仍具有較好的色澤，未發(fā)生褐變，貨架期延長了6天。

分別在鮮切0、1、2、4、6、8、12 天進行了色差L*、a*值測定。如圖3所示，鮮切后低溫貯藏期間，對照組馬鈴薯片2 天內L*值快速下降，而經回溫處理后的馬鈴薯鮮切片L*值8 天內均下降緩慢，并一直維持在70 以上，顯著高于對照組(P＜0.05)；由圖3B可知，與對照相比，回溫處理顯著降低了馬鈴薯片a*值的上升(P＜0.05)。

由圖2～3 可知，回溫處理顯著提高了鮮切馬鈴薯L*值，降低了a*值，顯著抑制了表面褐變的發(fā)生，有利于保持鮮切馬鈴薯表面原有的色澤和亮度，延長貨架期。

2.3 回溫處理對馬鈴薯PPO酶和POD酶活性的影響

在有氧條件下，PPO 可催化內源性酚類底物生成醌，醌類物質聚合產生黑色素，是引起馬鈴薯褐變的主要因素[21-22]；POD 亦是參與酚氧化的主要酶類之一[6]。分別測定了馬鈴薯回溫過程中以及鮮切后的PPO 和POD 酶活。如圖4A 所示，與對照相比，回溫前后PPO酶活性變化并不顯著；但鮮切后低溫貯藏期間，經回溫處理的馬鈴薯片PPO 酶活性均一直顯著低于對照(P＜0.05)。由圖4B 可見，與對照相比，回溫前后POD酶活性并無顯著變化；但鮮切后，經回溫處理的馬鈴薯片POD活性始終低于對照(P＜0.05)。

2.4 回溫處理對馬鈴薯游離氨基酸含量的影響

在馬鈴薯中，游離酪氨酸是PPO催化的主要酚類底物[7]，酪氨酸的氧化往往造成鮮切馬鈴薯表面紅褐色以至黑色褐變的形成。而不同氨基酸對馬鈴薯鮮切褐變的影響并不相同[5]，為了探究馬鈴薯中內源性游離氨基酸與酶促褐變的關系，用高效液相色譜法測定了鮮切馬鈴薯中16種游離氨基酸的含量，并對總游離氨基酸含量及發(fā)生顯著變化的7種游離氨基酸進行了分析。

圖2 回溫處理對鮮切馬鈴薯褐變的影響

圖3 回溫處理對鮮切馬鈴薯L*和a*值的影響

圖4 回溫處理對馬鈴薯PPO酶和POD酶活性的影響

對照在低溫貯藏20天過程中，總游離氨基酸含量呈下降趨勢，如圖5 所示，而經回溫處理的馬鈴薯，回溫后總游離氨基酸的含量降低更為顯著；因此，經回溫后的馬鈴薯，鮮切時初始游離總氨基酸的含量顯著低于對照組。

如圖6A～E所示，經回溫處理的馬鈴薯，鮮切初始的（即鮮切0 天）游離酪氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、丙氨酸的含量均顯著低于對照組。在鮮切后貯藏期間，回溫處理組馬鈴薯游離酪氨酸含量，除第4 天，均顯著低于對照組(P＜0.05)；游離絲氨酸含量一直顯著低于對照組(P＜0.05)；鮮切后2天內，游離天冬氨酸含量顯著低于對照(P＜0.05)；鮮切后3天內，游離丙氨酸含量顯著低于對照(P＜0.05)。如圖6F 所示，回溫后，處理組與對照組馬鈴薯游離甘氨酸含量并無顯著差異；但從鮮切后12 h到4天間，回溫處理提高了馬鈴薯游離甘氨酸的含量。其余8 種游離氨基酸，包括游離蘇氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等，在回溫后以及鮮切過程中與對照相比均無顯著性差異(P＞0.05)。游離半胱氨酸在處理組和對照組馬鈴薯中均未檢出。

圖5 回溫處理對馬鈴薯總游離氨基酸含量的影響

2.5 回溫處理對馬鈴薯游離脯氨酸和MDA含量的影響

在對單一游離氨基酸進行分析的過程中發(fā)現，經回溫處理的馬鈴薯回溫后及鮮切過程中，游離脯氨酸含量呈上升趨勢，且顯著高于對照(P＜0.05)，如圖7A。植物脯氨酸含量的增加往往會影響植物抗氧化能力[23]。對馬鈴薯MDA 含量測定如圖7B 所示，結果表明對照馬鈴薯鮮切后，短時間內MDA 含量快速上升，但經回溫處理的馬鈴薯鮮切后，MDA 含量增速緩慢，并在整個鮮切后貯藏期間，始終顯著低于對照組。

3 結論

回溫處理能有效抑制鮮切馬鈴薯褐變，顯著降低PPO和POD酶活性，降低鮮切初始游離總氨基酸的含量，主要包括游離酪氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、丙氨酸等；增加了鮮切過程中游離甘氨酸含量；游離脯氨酸的含量在回溫和鮮切后均顯著上升；此外，回溫顯著降低了鮮切后馬鈴薯MDA含量。因此回溫處理通過降低PPO和POD酶活性，減少了褐變底物游離酪氨酸及其他游離氨基酸（包括游離纈氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、丙氨酸）含量，提高了游離甘氨酸的含量，增強了游離脯氨酸以及降低MDA 含量，從而更好地保護細胞膜完整性，抑制了低溫貯藏后馬鈴薯的鮮切褐變。

圖6 回溫處理對馬鈴薯6種游離氨基酸含量的影響

圖7 回溫處理對馬鈴薯游離脯氨酸和MDA含量的影響

4 討論

4.1 回溫處理可以有效地抑制鮮切馬鈴薯表面褐變

低溫貯藏的馬鈴薯鮮切后表面易發(fā)生褐變，且隨著貯藏時間的延長褐變加重[10]。張兵兵等[15]的研究結果表明，對‘荷蘭15 號’馬鈴薯進行不同溫度的回溫，均能有效抑制鮮切馬鈴薯表面的褐變。本研究中，對低溫貯藏8個月的‘荷蘭15號’馬鈴薯進行20℃回溫處理20天后鮮切，回溫處理顯著提高了鮮切馬鈴薯片L*值、降低了a*值，鮮切后8天仍具有較好的色澤。針對于低溫貯藏馬鈴薯，在鮮切加工過程褐變顯著的問題，回溫處理可以有效地減緩鮮切后馬鈴薯的褐變，更好地延長貨架期。然而曹裕[24]的研究表明，低溫貯藏大于10個月的‘荷蘭7號’馬鈴薯，經回溫處理并沒有顯著抑制鮮切馬鈴薯表面的褐變。也進一步說明，20℃條件下長時間的回溫處理，往往需要在使用前進行抑芽劑處理，且低溫貯藏期過長，貯藏過程中發(fā)生霉變、發(fā)芽、失水、萎蔫等較嚴重的馬鈴薯并不適宜。

4.2 回溫處理有效地抑制鮮切馬鈴薯PPO、POD酶活性并降低部分游離氨基酸的積累

PPO 氧化組織中內源性底物形成鄰醌，鄰醌再相互聚合或與蛋白質、氨基酸等作用生成高分子絡合物而使組織發(fā)生褐變[5]，而回溫處理降低了鮮切馬鈴薯PPO酶活性，顯著地抑制了褐變的發(fā)生；回溫處理還可以抑制切后馬鈴薯POD活性，可能是因為回溫處理減少了機械傷產生的自由基尤其是活性氧的產生和積累，從而減輕了體內自由基對POD酶的催化作用[25]。

游離酪氨酸作為主要酚類底物，往往會在PPO催化下直接參與馬鈴薯鮮切褐變[7]；Thybo[8]研究發(fā)現，天冬氨酸含量高的馬鈴薯品種鮮切后更易褐變；Ali等[5]用外源氨基酸處理鮮切馬鈴薯，研究結果表明1 mol/L纈氨酸溶液加重褐變而10 mmol/L的甘氨酸溶液能輕微地減輕褐變。然而馬鈴薯中諸多游離氨基酸與褐變的關系并不明確。本研究中，回溫處理減少了鮮切后馬鈴薯褐變底物游離酪氨酸的積累，游離天冬氨酸含量顯著降低，并在鮮切后貯藏2天前顯著低于對照；游離纈氨酸的含量在回溫后及切后貯藏期間，均顯著低于對照，說明回溫處理減少了馬鈴薯中內源性的游離纈氨酸的含量，進而有效減少了與醌類結合生成褐色物質；游離甘氨酸含量回溫后中無顯著變化，但在鮮切貯藏前期，游離甘氨酸的含量顯著高于對照(P＜0.05)。另有游離絲氨酸在回溫后及切后貯藏期間，均顯著低于對照(P＜0.05)；游離丙氨酸在鮮切貯藏前期顯著低于對照組。通過研究回溫對游離氨基酸代謝的影響，初步探討了游離氨基酸與鮮切馬鈴薯褐變之間的關聯。后期筆者可針對回溫處理過程中變化顯著的氨基酸，應用外源氨基酸處理鮮切馬鈴薯，探討其對鮮切馬鈴薯褐變的影響；另一方面可從馬鈴薯內源游離氨基酸的代謝通路著手，分析回溫對氨基酸代謝通路影響的分子機制。

4.3 回溫處理可以有效地增加脯氨酸、抑制MDA的積累

脯氨酸積累可以提高植物抗性，有效清除細胞損傷產生的活性氧，增強細胞的抗氧化能力[23]。蘇貝貝等[26]研究表明，外源脯氨酸處理可以提高半夏的抗氧能力，提高細胞對活性氧的清除能力。Toivonen 等[13]研究表明經過回溫處理的蘋果可以減少鮮切后細胞膜的損傷。研究表明，回溫處理顯著提高了馬鈴薯中滲透物質游離脯氨酸的積累，有利于增強細胞抗氧化能力，提高馬鈴薯抵御脅迫、機械傷害的能力。回溫處理后，脯氨酸含量的提高，MDA含量的降低，使得馬鈴薯在鮮切或遭遇機械傷害的時候，更有利于維持細胞膜結構的完整性，減少鮮切造成的細胞膜損傷，有效地抑制褐變的發(fā)生。后期通過分析并研究回溫對脯氨酸合成、降解基因表達的影響，對抗氧化體系防護酶基因表達及活性的影響，對細胞膜穩(wěn)定相關蛋白基因表達的影響，進一步探討回溫抑制鮮切馬鈴薯褐變的分子機制。