碳氮源對植物乳桿菌L69發(fā)酵羊奶產(chǎn)ACE抑制肽的影響

陳 合, 張秋紅, 田 悅, 王 娟, 舒國偉

(陜西科技大學 生命科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

乳桿菌屬細菌是一類廣泛應用于食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸生產(chǎn)及醫(yī)療保健等領域，與人類生活密切相關的有益微生物[1,2].植物乳桿菌(L.plantannn)是乳酸桿菌中的一種，因多數(shù)從植物中分離得到而得名.最適生長溫度為30 ℃～35 ℃，兼性厭氧，最適pH值6．5左右.植物乳桿菌無論是在食品發(fā)酵，還是工業(yè)乳酸發(fā)酵以及民療保健等領域中均有著廣泛的應用[3].

ACE抑制肽即血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，是一類由蛋白質(zhì)經(jīng)酶解而產(chǎn)生的具有ACE抑制活性的多肽類物質(zhì)，通常含有3～10個氨基酸殘基，分子量通常在300～10 000之間[4]，可以快速通過消化粘膜進入血液循環(huán)，與ACE強效結合從而抑制其活性，具有降壓的作用.ACE是一種膜結合的二肽羧基多功能酶，是一種糖蛋白，含有維持其活性所必需的Zn2+和Cl-，廣泛存在于人體組織及血漿中，在肺毛細管內(nèi)皮細胞的含量最為豐富[5-7].ACE作用于體內(nèi)的腎素——血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin System，RAS)和激肽釋放酶——激肽系統(tǒng)(Kallikrein-Kinin System，KKS)，對血壓的調(diào)節(jié)起著重要的作用[8].

近年來，國外有許多關于發(fā)酵法制備乳源ACE 抑制肽的研究報道，最早Yamamoto[9]等研究得出瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中的ACE 抑制肽含量及活性高于其它乳酸菌.本研究主要以植物乳桿菌在復原羊乳中發(fā)酵，通過在羊乳中添加不同的酪蛋白、乳糖、葡萄糖和大豆蛋白胨等確定LactobacillusPlantarumL69發(fā)酵羊奶產(chǎn)ACE抑制肽的4種物質(zhì)的最佳添加量，為研制高ACE抑制活性的乳產(chǎn)品提供理論依據(jù)和技術支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

植物乳桿菌，分離自內(nèi)蒙古酸奶樣品，陜西科技大學生命科學與工程學院1C-419研究室保存.

MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母浸粉4，蛋白胨10，牛肉膏8，乙酸鈉5，檸檬酸二銨2，磷酸氫二鉀2， MgSO42，MnSO44，吐溫-80 1 mL.118 ℃滅菌15 min.

1.1.2 主要試劑與儀器

蔗糖，乳糖、脫脂乳粉和抗壞血酸鈉及MRS培養(yǎng)基中的試劑均為生化試劑.恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；鼓風干燥箱： 天津泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-1F 無菌操作臺：蘇州凈化；DH5000AB 電手提式蒸汽壓力滅菌器：江陰濱江醫(yī)療器械廠；LG10-2.4離心機：北京醫(yī)用離心機廠；UV-5300PC型紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；PB-10酸度計：賽多利斯(北京)科技有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 植物乳桿菌的活化及發(fā)酵劑的制備

將植物乳桿菌5%接種于MRS培養(yǎng)基中，連續(xù)活化三次，活化好的菌種5%轉(zhuǎn)接到14% 的滅菌復原羊乳中，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接三次，制成發(fā)酵劑.

1.2.2 植物乳桿菌發(fā)酵乳的制備

將復原羊奶配置成14%濃度，分別添加上述物質(zhì)，按5%(v/v)接種量接入發(fā)酵劑，37 ℃下培養(yǎng)16 h，取樣測定其生物量(活菌數(shù))、酸度、pH以及ACE抑制率.

1.3 測定方法

1.3.1 活菌數(shù)測定

平板涂布法，將樣品震蕩混勻，用稀釋液依次做10倍遞增稀釋至10-8，選擇適宜的稀釋度，稀釋后取0.1 mL稀釋液均勻接種在MRS固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后于37 ℃培養(yǎng)48 h，選菌落數(shù)為30～300個之間的平板，每個樣品選兩個稀釋度，每個稀釋度做兩個復本求均值，計算活菌數(shù)(CFU/mL表示).

1.3.2 酸度測定

氫氧化鈉滴定法，以吉爾涅爾度(°T)表示[10].取5 mL發(fā)酵液注入容量為100 mL的三角瓶中，用10 mL蒸餾水稀釋，加入2～3滴1%酚酞指示劑，用0.l mol/L NaOH標準溶液滴定.

1.3.3 pH值的測定

pHs-3c酸度計室溫下測定[11].

1.3.4 ACE抑制率測定

Cushman和Cheung的方法[12].

用含有0.3 mol/L NaCl的0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH8.3)將HHL(Hip-His-Leu)配成5.0 mmol/L的溶液.在10 mL試管中分別加入200μL的5 mmol Hip-His-Leu溶液和100μL的發(fā)酵乳上清液，于37 ℃下保溫5 min后，再加入20μL ACE溶液(溶解于蒸餾水中，活力為0.1 U/mL)，混勻后37 ℃下保溫30 min，加入250μL 1 mol/L HCl終止反應，再加入1.7 mL醋酸乙酯，經(jīng)15 s振蕩混勻后，靜置5 min，用移液管吸取1.0 mL 的醋酸乙酯層于另一干凈小瓶，于120 ℃環(huán)境中烘干30 min后，取出加入2.0 mL蒸餾水，混勻后于228 nm處測定吸光度.測定過程有三次平行實驗，ACE抑制肽對ACE的抑制率用以下面公式計算.

ACE抑制率=[(B-A)/(B-C)] ×100%

(1)

式中：A—a組的吸光度值，a組中，發(fā)酵羊乳乳清樣品與ACE、HHL同時反應；B—b組的吸光度值，b組在反應中不加入發(fā)酵羊乳乳清樣品， ACE與HHL完全反應；C—c組的吸光度值，c組在反應前先使ACE失活，作為ACE與HHL反應的空白組.

2 結果與討論

2.1 酪蛋白對植物乳桿菌L69發(fā)酵羊乳生產(chǎn)ACE抑制肽的影響

將酪蛋白分別以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的添加量加入到14%的復原羊乳中，90 ℃殺菌15 min，再以5%的接種量接入植物乳桿菌，混勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，測定其滴定酸度、pH值、ACE抑制率和活菌數(shù).結果如圖1及圖2所示.

從圖1、2中可以看出，在0.1%～0.5%酪蛋白濃度范圍內(nèi)，發(fā)酵羊乳pH逐漸下降，滴定酸度逐漸上升.當酪蛋白濃度達到0.4%時，pH值和滴定酸度變化趨勢趨于平緩；隨著酪蛋白濃度的增大，活菌數(shù)和ACE抑制率的變化呈現(xiàn)出相反趨勢.在0.1%～0.4%的酪蛋白濃度范圍內(nèi)，植物乳桿菌的活菌數(shù)呈緩慢上升趨勢，在酪蛋白質(zhì)量濃度0.4%時達到最大值.而ACE抑制率在0.2%～0.5%酪蛋白質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈下降趨勢，0.2%時處于ACE抑制率最大值，此時發(fā)酵產(chǎn)物中的小肽作為底物可能被植物乳桿菌重新利用，導致發(fā)酵產(chǎn)物中的小肽含量降低，從而導致了ACE抑制率的降低.姜瞻梅等[13]研究發(fā)現(xiàn)隨著添加酪蛋白量的增加，ACE抑制活性逐漸增強，原因在于發(fā)酵菌株和牛羊奶中酪蛋白含量的不同造成的差異.

圖1 酪蛋白對酸度和pH的影響

圖2 酪蛋白對ACE抑制活性的影響

2.2 乳糖對植物乳桿菌L69發(fā)酵羊乳生產(chǎn)ACE抑制肽的影響

將乳糖分別以0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的添加量加入到復原羊乳中，其它條件同2.1.結果如圖3及圖4所示.

圖3 乳糖對酸度和pH的影響

可以看出，活菌數(shù)隨著乳糖濃度的升高先增大后減小，在0.5%濃度處達到最大值.發(fā)酵羊乳的ACE抑制率先緩慢上升，自0.7%濃度處緩慢下降，表明乳糖濃度變化對植物乳桿菌發(fā)酵羊乳產(chǎn)生ACE抑制肽無明顯的促進作用.

圖4 乳糖對ACE抑制活性的影響

2.3 葡萄糖對植物乳桿菌L69發(fā)酵羊乳生產(chǎn)ACE抑制肽的影響

將葡萄糖分別以0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的添加量加入到14%的復原羊乳中，其它條件同2.1.結果如圖5及圖6所示.

圖5 葡萄糖對酸度和pH的影響

圖6 葡糖糖對ACE抑制活性的影響

從圖5、6得知，植物乳桿菌的活菌數(shù)隨葡萄糖濃度的增加而呈現(xiàn)增大的趨勢，在0.7%濃度處達到最高值，之后趨于穩(wěn)定.表明葡萄糖濃度的逐漸升高對植物乳桿菌的生長有一定的促進作用，發(fā)酵羊乳的ACE抑制率隨著葡萄糖濃度的增大也相應提高，表明葡萄糖濃度的變化對菌體的糖代謝作用產(chǎn)生了影響，進而促進了蛋白酶的水解.

2.4 大豆蛋白胨對植物乳桿菌L69發(fā)酵羊乳生產(chǎn)ACE抑制肽的影響

將大豆蛋白胨分別以0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的添加量加入到14%的復原羊乳中，其它條件同2.1.結果如圖7及圖8所示.

圖7 大豆蛋白胨對酸度和pH的影響

圖8 大豆蛋白胨對ACE抑制活性的影響

可以看出，發(fā)酵羊乳的酸度隨著大豆蛋白胨濃度的增大而增大，表明大豆蛋白胨濃度的提高對植物乳桿菌的產(chǎn)酸有促進作用；發(fā)酵羊乳中的活菌數(shù)隨著大豆蛋白胨濃度的增大而增大.ACE抑制率先增大后減小，在0.5%濃度處達到最大值88.7%.表明加入大豆蛋白胨增加了可被水解生成ACE抑制肽的蛋白含量，使得ACE抑制率在一定范圍內(nèi)呈上升趨勢，而在0.5%濃度之后ACE抑制率呈下降趨勢，此時羊乳中蛋白質(zhì)總量的增加，蛋白酶水解蛋白質(zhì)不完全所致.

3 結束語

植物乳桿菌L69發(fā)酵羊乳制備ACE抑制肽的碳氮物最適濃度分別為酪蛋白0.2%、乳糖0.7%、葡萄糖0.9%、大豆蛋白胨0.5%.ACE抑制率可分別達74.5%、76.36%、89.12%、88.70%，對照組為68.38%，添加酪蛋白、乳糖、葡萄糖和大豆蛋白胨對植物乳桿菌產(chǎn)ACE抑制肽均有較為顯著的影響；活菌數(shù)和ACE抑制肽抑制率之間沒有相關性.

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