巴斯德畢赤酵母鼠李糖代謝基因LRA3功能及其啟動(dòng)子順式作用元件的研究

梁明麗, 劉 波, 張 偉

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，由于其具有遺傳操作簡(jiǎn)單、胞外分泌表達(dá)、高密度發(fā)酵及特有的翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)而成為常用的真核表達(dá)宿主[1]。啟動(dòng)子作為表達(dá)系統(tǒng)必需且重要的元件顯著影響著畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的外源蛋白表達(dá)水平[2]?；趩?dòng)子PGAP的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)組成型調(diào)控外源基因表達(dá)，細(xì)胞快速生長(zhǎng)即表達(dá)目的蛋白，使得細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和生物量相對(duì)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子較差，進(jìn)而降低目的蛋白表達(dá)量；此外，當(dāng)所表達(dá)的目的蛋白對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)有損害時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和生物量更低，無(wú)法高效表達(dá)目的蛋白。目前，基于甲醇誘導(dǎo)的甲醇氧化酶基因啟動(dòng)子PAOX1的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)得以廣泛應(yīng)用，然而在大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中需要使用易燃的甲醇，存在極大的安全隱患[3]；而且，甲醇為有毒物質(zhì)，不能滿足食品及生物醫(yī)藥等安全性要求極高的重組蛋白生產(chǎn)。因此，挖掘以無(wú)毒物質(zhì)為誘導(dǎo)劑的強(qiáng)啟動(dòng)子是完善畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的有效途徑。

L-鼠李糖(L-6-脫氧甘露糖)是一種天然六碳糖，是植物果膠和細(xì)菌細(xì)胞壁的常見組成成分，許多微生物可以利用其作為碳源和能源[4]。目前發(fā)現(xiàn)L-鼠李糖代謝主要通過(guò)2種途徑：磷酸化途徑和非磷酸化途徑。磷酸化途徑存在于如Escherichiacoli、Clostridiumacetobutylicum、Rhizobiumleguminosarum等大多數(shù)細(xì)菌中；而非磷酸化途徑則存在于真菌和少數(shù)細(xì)菌中,完整的代謝途徑基因僅在酵母Scheffersomycesstipitis和Debaryomyceshansenii中闡明[5]。S.stipitis通過(guò)4種相關(guān)代謝基因(RHA1、LRA2、LRA3、LRA4)編碼的酶將鼠李糖依次轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-鼠李素-Y-內(nèi)酯、L-鼠李糖酸、3,6-雙脫氧-L-赤式古洛糖，最后轉(zhuǎn)化為丙酮酸和L-乳醛，二者進(jìn)入中樞代謝途徑。

研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母在以鼠李糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上可以正常生長(zhǎng)[6]，本實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)測(cè)了畢赤酵母鼠李糖代謝途徑相關(guān)基因，挖掘了2個(gè)鼠李糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PLRA3和PLRA4，其中PLRA3在以鼠李糖為碳源時(shí)，轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度可達(dá)PGAP的80%，是基于鼠李糖的強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[6]。由于PLRA3是以無(wú)毒鼠李糖為誘導(dǎo)物的強(qiáng)啟動(dòng)子，因此有望替代PAOX1和PGAP應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。為進(jìn)一步提高基于PLRA3的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)效果，需要對(duì)表達(dá)宿主和表達(dá)載體進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中通過(guò)菌株改造工程獲得了一株鼠李糖代謝流降低的菌株，在此菌株中PLRA3調(diào)控目的蛋白表達(dá)量提高了1～2倍[7]。在表達(dá)載體優(yōu)化方面，可以通過(guò)PLRA3改良工作提高其轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度進(jìn)而增強(qiáng)目的蛋白表達(dá)效果。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，未誘導(dǎo)狀態(tài)下，PLRA3表達(dá)的毒性蛋白對(duì)宿主生長(zhǎng)有一定程度的抑制作用，故PLRA3在無(wú)鼠李糖誘導(dǎo)時(shí)存在微弱的滲漏表達(dá)[8]。綜上所述，需要對(duì)PLRA3進(jìn)行理性改造以提高PLRA3誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平、降低滲漏表達(dá)，進(jìn)而提高目的蛋白表達(dá)量。基于此，本研究通過(guò)基因敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)探究LRA3基因與畢赤酵母鼠李糖代謝的相關(guān)性；另一方面，本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作初步確定了PLRA3全長(zhǎng)約210 bp，但轉(zhuǎn)錄元件未能精確鑒定，本研究應(yīng)用簡(jiǎn)單易行的CRRT-PCR方法及生物信息學(xué)分析鑒定并預(yù)測(cè)PLRA3轉(zhuǎn)錄相關(guān)元件，以期為PLRA3下一步理性改造提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒 巴斯德畢赤酵母菌株P(guān).pastorisGS115為本實(shí)驗(yàn)室保存；pPICZαA質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；pEASY-Blunt載體及大腸桿菌E.coliTrans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2試劑與儀器 FastPfu DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自莫納生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker(DM8000)購(gòu)自北京匯百惠生物科技中心；Trizol試劑和Zeocin抗生素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；限制型內(nèi)切酶(AscⅠ、PacⅠ及SwaⅠ)和DNaseⅠ購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司；RNA 5′焦磷酸水解酶(RNA pyrophosphohydrolase，RppH)、10×Thermopol Buffer、T4 RNA ligase 1及RNase抑制劑均購(gòu)自美國(guó)NEB公司；5×All-In-One RT MasterMix購(gòu)自加拿大ABM公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

PCR儀器及電穿孔完全系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；立式冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司)；電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)；恒溫金屬浴(金銀杏生物科技(北京)有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.1.3培養(yǎng)基 YPR培養(yǎng)基：2%鼠李糖，2%蛋白胨，1%酵母膏。MD固體培養(yǎng)基：2%葡萄糖，2%瓊脂糖，1.34%酵母無(wú)氨基氮源(yeast nitrogen base without amino acids，YNB)，4×10-5%生物素。MDH固體培養(yǎng)基：2%葡萄糖，2%瓊脂糖，1.34% YNB，4×10-5%生物素，4×10-3%組氨酸。MRH固體培養(yǎng)基：2%鼠李糖，2%瓊脂糖，1.34% YNB，4×10-5%生物素，4×10-3%組氨酸。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1LRA3基因的敲除菌株構(gòu)建 以GS115基因組為模板，利用引物KO0075-FF/KO0075-FR和KO0075-RF/KO0075-RR(引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)分別PCR擴(kuò)增LRA3基因的上、下游約500 bp片段作為同源重組臂。PCR體系A(chǔ)如下：GS115基因組 1 μL，5×TansStart FastPfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 6 μL，F(xiàn)astPfu 1μL，10 μmol/L上、下游引物各2.5 μL，以ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR程序A為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，共28個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收。

以pPICZαA質(zhì)粒為模板，用引物zeocin-F/zeocin-R(表1)擴(kuò)增zeocin抗性基因表達(dá)盒。PCR體系及程序同程序A。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study.

以LRA3基因上、下游同源臂及zeocin表達(dá)盒片段為模板，利用引物對(duì)KO0075-FF/KO0075-RR(表1)進(jìn)行重疊延伸PCR連接3個(gè)片段，PCR體系B如下：LRA3上、下游同源臂及zeocin表達(dá)盒片段各1 μL，5×TansStart FastPfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 6 μL，F(xiàn)astPfu 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.5 μL，以ddH2O 補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件B為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸75 s，共4個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸75 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定正確后，加入0.8倍體積的異丙醇及0.2倍的3 mol/L醋酸鈉，將以上體系混勻于-20℃靜止0.5 h后，4℃、12 000 r/min離心10 min，輕輕去除上清后加入同體積75%乙醇清洗2次，晾干后加入15 μL ddH2O，取適量回收產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞制備參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]。將10 μg線性化DNA加入80 μL感受態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，放入預(yù)冷電擊杯中電擊轉(zhuǎn)化，電擊完成后將轉(zhuǎn)化體系涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPD平板，28℃培養(yǎng)36 h。

提取轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，2對(duì)驗(yàn)證引物為KO0075-VF/zeocin-R(400)及zeocin-F(400)/KO0075-VR(表1)，PCR體系及程序同程序A，PCR延伸時(shí)間為1 min。

將PCR驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子及野生型GS115劃線于MRH平板，觀察其生長(zhǎng)情況，將LRA3基因敲除酵母菌株命名為GS115-ΔLRA3。

1.2.2LRA3基因的回補(bǔ) 構(gòu)建LRA3基因回補(bǔ)的同源重組載體pUCSH-LRA3。通過(guò)引物HB-F/HB-R(表1)擴(kuò)增LRA3基因上、下游基因之間片段，PCR體系及程序同程序A，PCR延伸時(shí)間為1 min。AscⅠ、PacⅠ雙酶切pUCSH載體及PCR產(chǎn)物，利用T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株Trans1-T1感受態(tài)，以HB-F/HB-R為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR體系及程序同程序A，PCR延伸時(shí)間為1 min。PCR驗(yàn)證正確后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，選擇測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行回補(bǔ)。

質(zhì)粒經(jīng)SwaⅠ內(nèi)切酶線性化后異丙醇醇沉回收。制作GS115-ΔLRA3菌株感受態(tài)細(xì)胞，將10 μg線性化DNA加入80 μL感受態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，放入預(yù)冷電擊杯中電擊轉(zhuǎn)化，電擊完成后涂布于MD培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)36 h。

提取轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，通過(guò)HB-F/HB-R(表1)驗(yàn)證，PCR體系及程序同程序A，PCR延伸時(shí)間為1 min。將PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子及GS115劃線于MRH平板，觀察其生長(zhǎng)情況。將LRA3基因回補(bǔ)菌株命名為GS115-LRA3。

1.2.3GS115、GS115-ΔLRA3及GS115-LRA3菌株生長(zhǎng)情況對(duì)比 將GS115、GS115-ΔLRA3及GS115-LRA3劃線于MDH、MRH平板，觀察3種菌株在以葡萄糖或鼠李糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況差異。

1.2.4RNA提取、去帽、環(huán)化和反轉(zhuǎn)錄 挑取GS115單菌落接種于20 mL YPD培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)36 h；以1%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL YPR培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)36 h，離心收集菌體。

GS115總RNA的提?。翰捎肨rizol法抽提畢赤酵母總RNA。用RNase-free的DNase I消化樣品中的DNA，以通用的5′-AOX和3′-AOX為引物驗(yàn)證基因組DNA完全去除，PCR體系及程序同程序A，PCR延伸時(shí)間為1 min。

RNA去帽：使用RNA 5′焦磷酸水解酶去掉總RNA的帽子結(jié)構(gòu)。反應(yīng)體系為：10×Thermopol Buffer 5 μL，RNA 8 μL，RppH 5 μL，以RNase-free ddH2O補(bǔ)至50 μL。上下顛倒混勻(或者輕輕吹吸混勻)后，37℃反應(yīng)2 h，65℃ 5 min終止反應(yīng)，異丙醇醇沉回收RNA。

RNA環(huán)化：使用T4 RNA ligase 1進(jìn)行RNA環(huán)化。反應(yīng)體系為：10×buffer 2 μL， RNA 500 ng，T4 RNA ligase1 2 μL，RNase抑制劑 1 μL，50% PEG 8000 4 μL，10 mmol/L ATP 3 μL，以RNase-free ddH2O補(bǔ)至20 μL。上下顛倒混勻(或者輕輕吹吸混勻)后16℃溫育12 h，65℃ 5 min終止反應(yīng)。

RNA反轉(zhuǎn)錄：用5×All-In-One RT MasterMix進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：環(huán)化RNA 50 ng，5×All-In-One RT MasterMix 2 μL，以RNase-free ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)體系混勻后，25℃退火10 min，42℃反應(yīng)1 h，85℃ 5 min終止反應(yīng)。

1.2.5嵌套PCR及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)確定 第一輪PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 100 ng，5×TansStart FastPfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 6 μL，F(xiàn)astPfu 1 μL，10 μmol/L引物ⅠF/ⅠR(表1)各2.5 μL，以ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共28個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。

第二輪PCR反應(yīng)以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，引物為ⅡF/ⅡR(表1)，PCR體系及程序同第一輪PCR。

將第二輪PCR產(chǎn)物連接至pEASY-Blunt載體后轉(zhuǎn)化E.coliTrans1-T1。以通用引物M13F/M13R進(jìn)行菌液PCR，PCR體系及程序同嵌套PCR。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定選取較長(zhǎng)PCR產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)的克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Vector NIT軟件分析，確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

1.2.6生物信息學(xué)分析PLRA3利用啟動(dòng)子在線分析工具：Promoter Scan(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)、CpGFinder(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?group=programs&subgroup=promoter&topic=cpgfinder)、EMBOSS Cpgplot(https://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)和Nsite (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=nsite&group=programs&subgroup=promoter)分析預(yù)測(cè)PLRA3的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、CpG島及可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 LRA3基因敲除同源片段的擴(kuò)增及菌株構(gòu)建

以GS115基因組為模板進(jìn)行PCR，分別擴(kuò)增LRA3基因的上、下游作為敲除同源臂，同源臂長(zhǎng)度約為500 bp；以pPICZαA質(zhì)粒為模板擴(kuò)增zeocin抗性基因表達(dá)盒，片段大小約為1.2 kb。通過(guò)重疊延伸PCR將三者連接構(gòu)建LRA3基因敲除片段(圖1)。

圖1 LRA3基因敲除相關(guān)DNA片段Fig.1 DNA fragmentation involved in knocking out LRA3 gene.注：M：8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker；1：敲除片段上游同源臂；2：敲除片段下游同源臂；3：zeocin表達(dá)盒；4：LRA3基因敲除片段。

通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化將基因敲除片段導(dǎo)入細(xì)胞，畢赤酵母的DNA同源重組機(jī)制將LRA3基因替換為zeocin抗性表達(dá)盒，經(jīng)Zeocin抗性篩選后再進(jìn)行基因組水平鑒定(圖2)。敲除菌株通過(guò)2套引物進(jìn)行PCR鑒定，上游引物驗(yàn)證結(jié)果見圖2A，對(duì)應(yīng)菌株的下游引物驗(yàn)證結(jié)果見圖2B。陽(yáng)性菌株的上游引物擴(kuò)增片段大小約為1.2 kb，下游約為1.6 kb，故4號(hào)為敲除菌株。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子及野生型GS115劃線于MRH平板，發(fā)現(xiàn)其幾乎不生長(zhǎng)，將LRA3基因敲除酵母菌株命名為GS115-ΔLRA3。

2.2 LRA3基因回補(bǔ)載體及菌株構(gòu)建

以GS115基因組為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增LRA3基因上、下游基因之間片段，AscⅠ、PacⅠ雙酶切連接至pUCSH載體構(gòu)建回補(bǔ)載體，PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆大小約為2.2 kb(圖3A)。線性化DNA電擊轉(zhuǎn)化GS115-ΔLRA3感受態(tài)，通過(guò)缺乏組氨酸的平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行PCR鑒定(圖3B)。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子及野生型GS115劃線于MRH平板，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子恢復(fù)生長(zhǎng)，將LRA3基因回補(bǔ)酵母菌株命名為GS115-LRA3。

2.3 GS115、GS115-ΔLRA3及GS115-LRA3菌株生長(zhǎng)情況

將GS115、GS115-ΔLRA3及GS115-LRA3劃線于MDH、MRH平板。當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，3種菌株均能正常生長(zhǎng)；當(dāng)以鼠李糖為碳源時(shí)，GS115和GS115-LRA3正常生長(zhǎng)，而GS115-ΔLRA3未見生長(zhǎng)(圖4)，表明LRA3基因參與畢赤酵母鼠李糖代謝過(guò)程。

圖2 LRA3基因敲除菌株驗(yàn)證Fig.2 Verification of LRA3-disrupted strain.注：A：LRA3基因敲除菌株驗(yàn)證(上游引物)；M：8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker；1：GS115基因組；2：陰性對(duì)照；3～8：轉(zhuǎn)化子。B：LRA3基因敲除菌株驗(yàn)證(下游引物)；M：8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker；1：GS115基因組；2：陰性對(duì)照；3～8：對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化子。

圖3 LRA3基因回補(bǔ)載體及菌株驗(yàn)證Fig.3 Verification of the vector for complementing LRA3 gene and LRA3-complemented strain.注：A：LRA3基因回補(bǔ)載體驗(yàn)證；M：8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker；1：GS115基因組；2～9：轉(zhuǎn)化子。B：LRA3基因回補(bǔ)菌株驗(yàn)證；M：8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker；1：回補(bǔ)質(zhì)粒；2：GS115基因組；3～9：酵母轉(zhuǎn)化子。

圖4 3種菌株在不同碳源的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth profiles of three strains on different carbon sources.注：左側(cè)培養(yǎng)基碳源為葡萄糖，右側(cè)為鼠李糖；a、b、c分別為GS115、GS115-ΔLRA3、GS115-LRA3。

2.4 GS115總RNA提取及帽子結(jié)構(gòu)去除

通過(guò)CRRT-PCR方法確定PLRA3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在以鼠李糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)GS115，鼠李糖誘導(dǎo)LRA3基因高強(qiáng)度轉(zhuǎn)錄。收集菌體，以Trizol法抽提GS115中總RNA。電泳結(jié)果顯示(圖5A)，總RNA各條帶清晰，未有明顯降解。真核生物基因轉(zhuǎn)錄時(shí)在RNA 5′加帽，促進(jìn)RNA穩(wěn)定性。在進(jìn)行RNA環(huán)化前，需要用5′焦磷酸水解酶去除RNA 5′帽子結(jié)構(gòu)(圖5B)。

2.5 P. pastoris GS115總RNA環(huán)化及嵌套PCR

RNA經(jīng)RNA環(huán)化酶作用后，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與RNA 3′多聚腺嘌呤相連而形成環(huán)形RNA。根據(jù)LRA3的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)2套PCR引物，引物位置示意圖見圖6A。以環(huán)化RNA為模板、以外側(cè)引物(ⅠF/ⅠR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物理論大小約為1 kb。電泳結(jié)果顯示，有大小約為1 kb的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)(圖6B)。

圖5 RNA提取及去帽處理Fig.5 RNA extraction and decapped RNA.注：A：GS115 RNA；M：8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker；1～2：畢赤酵母GS115 RNA。B：GS115去帽RNA；M：8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker；1：畢赤酵母GS115去帽RNA。

為進(jìn)一步提高PCR產(chǎn)物的特異性，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板、引物為內(nèi)部引物(ⅡF/ⅡR)進(jìn)行第二輪PCR。PCR產(chǎn)物理論大小約為0.69 kb，這一結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步證實(shí)(圖6C)。以上結(jié)果表明，利用嵌套PCR可獲得目標(biāo)片段。

2.6 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)確定

上述嵌套PCR產(chǎn)物連接至克隆載體pEASY-Blunt，通用引物M13F/M13R對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖7)。由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中RNA產(chǎn)生不同程度的降解，導(dǎo)致連接到測(cè)序載體的片段大小不一。

選取較大的PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化子測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用Vector NIT軟件進(jìn)行序列比對(duì)(圖8)，其中LRA3為L(zhǎng)RA3基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)序列，其他序列均為測(cè)序所得。CRRT-PCR實(shí)驗(yàn)原理是將mRNA的首尾相連，mRNA的首個(gè)堿基即為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)而尾部則是polyA，即polyA后的第一堿基即為啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在本研究中，polyA后面第一個(gè)堿基為G。但啟動(dòng)子上G的前一個(gè)堿基亦為A，故這個(gè)A是ployA還是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)無(wú)法確定。因此，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能為A或G。根據(jù)大量研究結(jié)果統(tǒng)計(jì)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)通常為A[10]，在本研究中認(rèn)定A為PLRA3的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

2.7 PLRA3核心啟動(dòng)子及核心元件預(yù)測(cè)

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site，TSS)，通常為轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)位點(diǎn)，核心啟動(dòng)子在TSS指導(dǎo)下發(fā)揮正確轉(zhuǎn)錄起始的作用。核心啟動(dòng)子一般包括以TSS為中心的上、下游各40個(gè)核苷酸，還包含一些重要的核心啟動(dòng)子元件，典型例如TATA Box、起始子Initiator[11]。當(dāng)然，不是所有的啟動(dòng)子都含有所有的核心啟動(dòng)元件，甚至一些啟動(dòng)子沒有核心啟動(dòng)子元件[12]。通過(guò)Promoter Scan在線分析PLRA3的核心啟動(dòng)子及核心啟動(dòng)子元件(圖9)，預(yù)測(cè)PLRA3核心啟動(dòng)子區(qū)為-256 bp～-6 bp，得分為69.20，TATA Box位于-32 bp～-36 bp，未預(yù)測(cè)到其他元件，此結(jié)果與之前研究的酵母核心啟動(dòng)子中唯一的保守基序是TATA Box結(jié)論一致[13]。

圖6 CRRT-PCR引物示意圖及嵌套PCR瓊脂糖電泳Fig.6 The schematic diagram of CRRT-PCR primers and agarose gel of nested PCR.注：A：嵌套引物位置示意圖。B：第一輪嵌套PCR產(chǎn)物；M：8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker；1～5號(hào)：溫度梯度PCR產(chǎn)物。C：第二輪嵌套PCR產(chǎn)物；M：8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker；1～2：PCR產(chǎn)物。

圖7 PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子Fig.7 The PCR identification of transformants.注:M:8 kb標(biāo)準(zhǔn)Marker; 1～12:轉(zhuǎn)化子。

2.8 PLRA3順式作用元件預(yù)測(cè)

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域中的順式元件相互作用，產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，基因啟動(dòng)子含有多種順式作用元件，受到多個(gè)途徑的調(diào)節(jié)[14]。CpG島通常是一段大于200 bp、GC含量不小于50%、同時(shí)CpG含量與期望含量的比值不小于0.6的區(qū)域[15]。CpG島主要存在于啟動(dòng)子區(qū)，通常情況其為非甲基化狀態(tài)，一旦受到調(diào)控發(fā)生甲基化會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，最終造成基因沉默[16]。利用CpG Finder和EMBOSS Cpgplot在線分析PLRA3的CpG島存在情況，預(yù)測(cè)表明PLRA3不存在CpG島，即PLRA3不受甲基化調(diào)控。利用Nsite預(yù)測(cè)PLRA3的順式作用元件，同時(shí)結(jié)合Promoter Scan結(jié)果，將二者重合結(jié)果部分列出，具體見表2。

圖8 多序列比對(duì)結(jié)果Fig.8 The result of multiple sequences alignment.注：灰色陰影區(qū)為polyA；字體加粗的A為L(zhǎng)RA3基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；黑框?yàn)長(zhǎng)RA3基因的起始密碼子。

圖9 LRA3基因圖譜及PLRA3啟動(dòng)子序列Fig.9 The map of the LRA3 gene and the promoter PLRA3 sequence.注：下劃線為核心啟動(dòng)子；黑框?yàn)門ATA Box；箭頭指示為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

表2 PLRA3順式作用元件預(yù)測(cè)Table 2 The prediction of cis-acting elements of PLRA3.

3 討論

啟動(dòng)子是表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵元件之一，在重組蛋白表達(dá)中扮演著重要角色。目前，應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可分為天然啟動(dòng)子和合成啟動(dòng)子。其中，天然啟動(dòng)子來(lái)源于一些在特定條件下表達(dá)譜或轉(zhuǎn)錄譜波動(dòng)較大的基因，天然啟動(dòng)子往往存在一定缺陷，如轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度不足和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄高等，需要進(jìn)行理性改造。在對(duì)順式作用元件研究較為清楚的基礎(chǔ)上，可通過(guò)控制關(guān)鍵順式元件位置、數(shù)量和間距構(gòu)建合成啟動(dòng)子[19]。Vogl等[20]通過(guò)向啟動(dòng)子最小共有序列摻入常見的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)基序構(gòu)建合成核心啟動(dòng)子，并在此基礎(chǔ)上添加PAOX1上游序列得到合成啟動(dòng)子，其在甲醇誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)時(shí)達(dá)到野生型PAOX1核心啟動(dòng)子的10%。Portela等[21]從頭合成核心啟動(dòng)子并與畢赤酵母基因AOX1上游調(diào)控區(qū)融合，其驅(qū)動(dòng)外源蛋白表達(dá)水平最高可達(dá)野生型PAOX1的70.6%。顯然，合成啟動(dòng)子是在揭示了天然啟動(dòng)子上關(guān)鍵調(diào)控元件的基礎(chǔ)上對(duì)天然啟動(dòng)子進(jìn)行改良和優(yōu)化，從而避免天然啟動(dòng)子存在的一些弊端。

本實(shí)驗(yàn)室挖掘的鼠李糖強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PLRA3可以實(shí)現(xiàn)重組蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度仍有提高的潛力以顯著提高重組蛋白表達(dá)水平；該啟動(dòng)子在無(wú)鼠李糖誘導(dǎo)時(shí)還有較高的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄，重組蛋白存在滲漏表達(dá)，在表達(dá)對(duì)宿主有毒性作用的重組蛋白時(shí)效果不夠理想[6～8]。因此，需要揭示該啟動(dòng)子上關(guān)鍵元件以進(jìn)行理性改良。本研究通過(guò)敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LRA3參與畢赤酵母鼠李糖代謝途徑，并利用CRRT-PCR方法確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)A，同時(shí)預(yù)測(cè)了核心啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄重要元件TATA Box及可能的順式作用元件。在后期的研究中，將利用這些信息在啟動(dòng)子關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，從中篩選轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度提升而基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度降低的突變體。