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    磷酸化對UCHL3體外去泛素化酶活性的影響

    2019-10-14 02:44:08任禹靜梅子青
    生物技術(shù)進(jìn)展 2019年5期
    關(guān)鍵詞:化酶泛素底物

    丁 珊, 任禹靜,2, 姜 凌, 梅子青*

    1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081;2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081

    泛素化修飾是指通過泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)以及泛素連接酶(ubiquitin-protein ligase,E3)等一系列酶促級聯(lián)反應(yīng)將靶點(diǎn)底物蛋白通過其上賴氨酸的側(cè)鏈氨基與泛素分子C末端甘氨酸(Gly76)以異肽鍵相連而被共價修飾的過程[1]。泛素化修飾是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,幾乎在所有生命活動中都發(fā)揮著重要作用,如蛋白質(zhì)的降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及DNA損傷修復(fù)等[2~4]。由于泛素分子具有自由的氨基,其N端甲硫氨酸和7個賴氨酸(M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)均可與其他參與泛素鏈形成的泛素蛋白分子上的Gly76的羧基縮合形成肽鍵/異肽鍵,進(jìn)而形成鏈接類型更為復(fù)雜的多聚泛素鏈。眾多研究已表明,不同鏈接類型的泛素鏈會介導(dǎo)底物蛋白參與不同的生命過程[5,6]。

    與E1-E2-E3負(fù)責(zé)的泛素化過程相反,去泛素化是泛素化修飾的逆過程,由去泛素化酶負(fù)責(zé)完成[7~9]。真核細(xì)胞的去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)主要包含6個家族:泛素特異性加工酶(ubiquitin-specific processing proteases,USPs)家族、UCH家族、卵巢腫瘤蛋白酶(ovarian tumour proteases,OTUs)家族、Jab1/Pab/MPN結(jié)構(gòu)域金屬酶(Jad1/Pad/MPN domain containing metallo-enzymes,JAMM)家族、馬查多-約瑟夫病相關(guān)酶(Machado-Joseph disease related enzymes,MJD)家族和單核細(xì)胞趨化蛋白1誘導(dǎo)蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein,MCPIP)家族。UCHL3蛋白是UCH家族的重要成員,其可催化Ⅰ型干擾素受體的去泛素化,從而調(diào)控Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的抗病毒作用[10]。研究表明,UCHL3在成骨細(xì)胞中過表達(dá),可對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad(drosophila mothers against decapentaplegic protein)家族中的Smad1進(jìn)行去泛素化調(diào)控[11]。另有研究報道,UCHL3在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)[12],是乳腺癌細(xì)胞對放療和化療產(chǎn)生抗性的根源[13],因而,近年來,靶向抑制UCHL3蛋白已成為乳腺癌治療的新思路。此外,UCHL3被發(fā)現(xiàn)可通過對RAD51(DNA repair protein RAD51 homolog 1,DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白)進(jìn)行去泛素化,參與DNA損傷修復(fù)調(diào)節(jié)[13];其還可通過對TDP1(tyrosyl DNA phosphodiesterase l,調(diào)控修復(fù)拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的染色體斷裂的關(guān)鍵蛋白)去泛素化,調(diào)控染色質(zhì)斷裂修復(fù)[14]。

    在相當(dāng)長時間內(nèi),UCHL3一直被認(rèn)為只能對單泛素及其綴合物、或者泛素結(jié)合酶與泛素的復(fù)合物進(jìn)行切割,而不能對泛素鏈進(jìn)行切割[15,16]。2016年,Luo等[13]首次發(fā)現(xiàn)UCHL3上Ser75發(fā)生磷酸化后,可對底物RAD51多聚泛素鏈進(jìn)行切割,但是,這項(xiàng)研究均為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,磷酸化賦予UCHL3切割多聚泛素鏈活性的結(jié)論尚缺少體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持。

    基于此,本研究利用點(diǎn)突變方法將UCHL3上的Ser75突變成Glu,實(shí)現(xiàn)模擬磷酸化修飾,并使用親和層析、離子交換層析及凝膠過濾層析等多種純化技術(shù),在大腸桿菌中異源重組表達(dá)并純化到了性質(zhì)均一的野生型UCHL3(UCHL3WT)和模擬磷酸化的UCHL3蛋白(UCHL3S75E),進(jìn)而在體外生化水平上研究磷酸化對UCHL3的泛素鏈切割活性的影響,以期為深入了解其受翻譯后修飾調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    質(zhì)粒pET-28a_UCHL3WT為本實(shí)驗(yàn)室保存;DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    Q5 DNA聚合酶、DpnⅠ酶均購于美國NEB公司;牛血清白蛋白購自北京信科奧達(dá)科技有限公司;雞卵清白蛋白購自美國Sigma公司;苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;Bradford試劑購自美國Bio-Rad公司。Ub-AMC和K27、K48以及K63鏈接類型二泛素(K27 diub、K48 diub、K63 diub)均為清華大學(xué)劉磊教授實(shí)驗(yàn)室贈送。其他主要試劑均購于美國Sigma公司。

    HitrapQ層析柱、Superdex 200凝膠過濾層析柱均購自美國GE醫(yī)療公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1基因克隆 研究所用目的基因來源于人源cDNA,在本實(shí)驗(yàn)室已有的pET28a_UCHL3質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,利用QuikChange定點(diǎn)誘變技術(shù)構(gòu)建點(diǎn)突變質(zhì)粒,將Ser75突變?yōu)镚lu[17]。設(shè)計上游引物為:5′-GAAAAAATAAAAgagCAGGGACA-AGATGTTACATC-3′,下游引物為:5′-gaaTTTTATT-TTTTCTTCCTCTTCTGTTC-3′(小寫部分為突變位點(diǎn))。引物由華大基因公司進(jìn)行合成。PCR反應(yīng)體系(共20 μL)為:野生型UCHL3質(zhì)粒模板0.4 μL,上、下游引物各0.4 μL,5×Q5緩沖液4 μL,5×Q5 Enhancer 4 μL,dNTP 1.6 μL, Q5 DNA聚合酶0.2 μL,滅過菌的去離子水9 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 min;95℃ 30 s,58℃退火30 s,72℃延伸3 min,共25個循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后,使用DpnⅠ酶在37℃酶切消化3 h。隨后,將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,并涂布于含卡那霉素的LB平板,37℃過夜培養(yǎng),挑取單克隆,送至華大基因公司進(jìn)行測序,將成功構(gòu)建的pET28a_UCHL3S75E質(zhì)粒于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2蛋白表達(dá)與純化 將pET28a_UCHL3S75E質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后,接入50 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)3~4 h。隨后轉(zhuǎn)接至1 L LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(37℃、220 r/min);待菌體生長至OD600=1.0時,加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)至終濃度為0.2 mmol/L,于22℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12~16 h。pET28a_UCHL3WT質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的方法同pET28a_UCHL3S75E質(zhì)粒。

    分別將誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液在4℃、4 000 r/min條件下離心15 min,收集菌體后,用Lysis Buffer(25 mmol/L的pH 8.0 Tris、150 mmol/L NaCl)重懸,并加入0.3 mmol/L PMSF,超聲破碎(600 W功率下超聲3 s,停止9 s,總共超聲30 min)。在4℃、13 000 r/min條件下離心50 min去除沉淀后,利用鎳柱進(jìn)行親和層析純化,使離心所得上清液與柱料充分結(jié)合后,用25 mmol/L的pH 8.0 Tris、500 mmol/L NaCl進(jìn)行第1次清洗(W1),再用25 mmol/L的pH 8.0 Tris、10 mmol/L咪唑進(jìn)行第1次洗脫(E1),最后用25 mmol/L的pH 8.0 Tris、150 mmol/L咪唑進(jìn)行二次洗脫(E2)。選擇較好的洗脫液進(jìn)行下一步陰離子交換層析HitrapQ以及凝膠過濾層析Superdex 200純化,最終得到高純度、高質(zhì)量的目的蛋白。

    1.2.3利用Bradford法測定蛋白濃度 配制不同濃度梯度的牛血清白蛋白(包括0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.375 mg/mL以及0.5 mg/mL);分別取10 μL各濃度梯度的牛血清白蛋白,加入1 mL Bradford試劑中,檢測OD595讀值;重復(fù)3次,并取平均值,進(jìn)而制作牛血清白蛋白濃度對OD595的標(biāo)準(zhǔn)曲線。另取1 mL Bradford試劑,加入10 μL稀釋后的UCHL3WT或UCHL3S75E蛋白,進(jìn)行OD595數(shù)據(jù)測定,并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算UCHL3WT以及UCHL3S75E的蛋白濃度。

    1.2.4Ub-AMC切割活性實(shí)驗(yàn) 參照Lee等[18]的方法,利用Ub-AMC切割活性實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證模擬磷酸化對UCHL3蛋白功能的影響。向包含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、1 mg/mL雞卵清白蛋白、5 mmol/L ATP/MgCl2、1 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)的反應(yīng)體系中分別加入濃度為5 nmol/L的UCHL3WT和UCHL3S75E蛋白,再加入65 μmol/L Ub-AMC來啟動反應(yīng)。Ub-AMC的水解活性主要通過Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)在Ex360/Em460處進(jìn)行實(shí)時檢測。每30 s記錄1次熒光強(qiáng)度,共記錄15 min。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,并計算平均值。

    1.2.53種不同鏈接類型二泛素的切割活性實(shí)驗(yàn)

    基于此前對UCHL3與二泛素的相互作用力的測定結(jié)果[19],選擇3種不同鏈接類型的二泛素(K27 diub、K48 diub、K63 diub)作為底物,來進(jìn)行比較UCHL3WT與UCHL3S75E(4 μmol/L)的二泛素切割活性實(shí)驗(yàn)。同時,選擇OTUD2(一種去泛素化酶)作為陽性對照。在25 mmol/L的pH 8.0 Tris、150 mmol/L NaCl反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)。分別加入3種酶(OTUD2、UCHL3WT、UCHL3S75E)啟動反應(yīng),在不同時間點(diǎn)(0 min、120 min,UCHL3S75E實(shí)驗(yàn)組還包括60 min)取樣,最后通過SDS-PAGE來檢驗(yàn)切割活性。

    1.2.6UCH家族多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

    利用Uniprot網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/)查找UCH家族中成員(UCHL3、UCHL1、UCHL5和BAP1)的蛋白質(zhì)序列,使用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對,使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    利用NCBI網(wǎng)站BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找UCHL3在不同物種中的同源蛋白(包括小鼠Musmusculus、果蠅Drosophilanavojoa、水稻Oryzasativa、玉米Zeamays以及擬南芥Arabidopsisthaliana),使用DNAMAN進(jìn)行多序列比對,使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 UCHL3S75E質(zhì)粒的構(gòu)建

    為了獲得模擬磷酸化的UCHL3蛋白,通過QuikChange定點(diǎn)誘變技術(shù)構(gòu)建pET-28a_UCHL3S75E質(zhì)粒。如圖1所示,目的條帶在5 000 bp~10 000 bp之間,與預(yù)測分子量(6 062 bp)基本相符。同時,測序結(jié)果顯示本研究克隆的UCHL3S75E基因序列完全正確。

    2.2 UCHL3WT和UCHL3S75E蛋白的純化

    為了獲得高純度、高質(zhì)量的UCHL3WT和UCHL3S75E蛋白,利用大腸桿菌BL21(DE3)對其進(jìn)行表達(dá)并嘗試?yán)枚喾N層析技術(shù)進(jìn)行純化。如圖2所示,經(jīng)過親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析多步純化,UCHL3WT蛋白的純度超過90%(圖2A),在Superdex 200的洗脫體積為16.5 mL左右,對應(yīng)分子量大小正確。SDS-PAGE顯示其分子量在21~33 kDa,與目的蛋白的預(yù)測分子量26 kDa相一致。圖3為UCHL3S75E蛋白的純化結(jié)果,表明其純度、洗脫體積和分子量與UCHL3WT類似。

    圖1 pET-28a_UCHL3S75E(6 062 bp)PCR鑒定Fig.1 The PCR identification of pET-28a_UCHL3S75E(6 062 bp).

    圖2 UCHL3WT蛋白純化結(jié)果Fig.2 The purification of UCHL3WT protein.注:A: UCHL3WT 親和層析純化結(jié)果以及SDS-PAGE鑒定;B: UCHL3WT Hitrap Q陰離子交換層析及SDS-PAGE鑒定;C: UCHL3WT SD 200凝膠過濾層析純化及SDS-PAGE鑒定。

    2.3 蛋白濃度測定

    為了獲得準(zhǔn)確的蛋白濃度,測定并擬合了蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)擬合曲線以及蛋白稀釋倍數(shù)計算得到待測蛋白濃度。其中,UCHL3WT為2.8 mg/mL(16.8 μmol/L)、UCHL3S75E為2.4 mg/mL(14.5 μmol/L)。

    2.4 磷酸化對Ub-AMC切割活性的影響

    為了理解磷酸化對UCHL3活性影響,對UCHL3切割Ub-AMC的活性進(jìn)行了分析。如圖4A所示,相比于UCHL3WT蛋白,模擬磷酸化的UCHL3S75E切割Ub-AMC的活性明顯升高。經(jīng)Origin軟件分析可知,在同等酶量以及底物濃度條件下,UCHL3S75E的切割活性比UCHL3WT提高了70%。

    2.5 磷酸化對二泛素切割活性的影響

    為了探索磷酸化對UCHL3切割二泛素活性的影響,采用不同鏈接類型的二泛素作為底物,進(jìn)行了相關(guān)的酶切活性實(shí)驗(yàn)。如圖4B、4C和4D所示,作為陰性對照,單獨(dú)的K27、K48以及K63等鏈接類型二泛素在不加酶的體系中保持不變;作為陽性對照,OTUD2可對上述3種類型二泛素實(shí)現(xiàn)有效切割。相比之下,UCHL3WT對上述3種二泛素均不具備切割活性,模擬磷酸化的UCHL3S75E對K27、K48鏈接類型二泛素也不具備切割活性,但對K63鏈接類型二泛素展現(xiàn)出微弱的切割活性,不過此活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于生理水平切割活性。

    2.6 UCH家族多序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

    為了驗(yàn)證該種磷酸化調(diào)控機(jī)制在UCH家族中的保守程度,進(jìn)行了相應(yīng)的多序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析。如圖5A所示,磷酸化位點(diǎn)Ser75僅存在于UCHL3中,在UCH家族其他3個成員中均不保守,即便是在與其親緣關(guān)系最為接近的UCHL1中也不保守(圖5A、5B)。隨后,為了驗(yàn)證該種磷酸化調(diào)控機(jī)制在不同物種中的保守程度,進(jìn)行了不同物種中UCHL3同源蛋白的多序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖5C、5D)。結(jié)果顯示,Ser75位點(diǎn)在小鼠、果蠅、水稻和玉米中均保守存在,僅在擬南芥中突變成了Glu(圖5C)。而由系統(tǒng)發(fā)育樹可知,人源UCHL3與小鼠中UCHL3親緣關(guān)系較近,而水稻和玉米中UCHL3蛋白親緣關(guān)系較近,模式生物果蠅以及擬南芥與其他物種中UCHL3蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5D)。

    圖4 UCHL3S75E 以及UCHL3WT酶對Ub-AMC以及不同類型二泛素分子的切割活性反應(yīng)Fig.4 The cleavage activity of UCHL3WT and UCHL3S75E towards Ub-AMC and different types of ubiquitin-linked chains.注:A: 5 nmol/L濃度下,UCHL3S75E 以及UCHL3WT對Ub-AMC的酶切反應(yīng)及速率分析;B: UCHL3S75E 以及UCHL3WT對K27鏈接類型二泛素酶切反應(yīng)的SDS-PAGE檢測結(jié)果;C: UCHL3S75E 以及UCHL3WT對K48鏈接類型二泛素酶切反應(yīng)的SDS-PAGE檢測結(jié)果;D: UCHL3S75E以及UCHL3WT對K63鏈接類型二泛素酶切反應(yīng)的SDS-PAGE檢測結(jié)果。

    圖5 UCH家族成員以及不同物種UCHL3序列對比及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.5 Sequence alignment and phylogenetic trees of UCH family and UCHL3 sequence of different species.注:A: UCH家族成員成員多序列比對結(jié)果,其中黃色代表4種蛋白中保守度為100%的氨基酸;青色代表保守度大于75%的氨基酸;紅色框代表UCHL3中磷酸化位點(diǎn)Ser75及其在其他家族成員中對應(yīng)的氨基酸。B: UCH家族系統(tǒng)發(fā)育樹。C: 不同種屬來源的UCHL3之間序列對比。D: 不同種屬來源的UCHL3系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

    3 討論

    作為UCH家族的重要成員,去泛素化酶UCHL3參與了DNA損傷修復(fù)[13]、染色質(zhì)斷裂[20]以及成骨細(xì)胞分化[11]等眾多重要生命過程。在被發(fā)現(xiàn)后的很長時間內(nèi),UCHL3一直被認(rèn)為只能對單泛素及其綴合物,或者泛素結(jié)合酶與泛素的復(fù)合物進(jìn)行切割,而不能對泛素鏈進(jìn)行切割[15,16]。但近期的一些研究顯示,UCHL3在細(xì)胞內(nèi)可對Smad1、Rad51等底物上的多聚泛素鏈進(jìn)行切割[10,13,21],尤其是受到磷酸化修飾后,該活性明顯增強(qiáng)。這些工作暗示UCHL3在細(xì)胞內(nèi)的去泛素化酶活性可能受到翻譯后各種修飾的調(diào)控。由于至今為止尚未有任何體外實(shí)驗(yàn)顯示UCHL3WT具有切割泛素鏈的活性[15,16],因此關(guān)于UCHL3切割泛素鏈的活性缺乏體外證據(jù)。如果UCHL3的體內(nèi)活性報道真實(shí),則很可能是細(xì)胞內(nèi)UCHL3在表達(dá)后受到了關(guān)鍵的翻譯后修飾。而原核系統(tǒng)表達(dá)的UCHL3由于沒有修飾,不具備切割泛素鏈的活性。因此,展開UCHL3的體外修飾研究將對該問題做出一定程度上的闡釋。

    Ser突變?yōu)镚lu是常用的模擬磷酸化策略,在很多蛋白激酶的體外研究中有過成功案例。在近期的去泛素化酶翻譯后修飾研究中,無活性的USP14在模擬磷酸化后展現(xiàn)了對Ub-AMC的切割活性[22]。本研究正是基于先前的模擬磷酸化成功案例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計,利用點(diǎn)突變技術(shù)將Ser75突變?yōu)镚lu,成功構(gòu)建模擬磷酸化的UCHL3S75E,并純化得到性質(zhì)均一的UCHL3S75E蛋白,隨后進(jìn)行體外去泛素化酶的活性測定。首先,在5 nmol/L濃度下,UCHL3S75E切割Ub-AMC的活性比UCHL3WT提高了70%,顯示了模擬磷酸化對UCHL3活性的調(diào)控作用。其次,UCHL3WT沒有展現(xiàn)對K27 diub、K48 diub和K63 diub等二泛素的切割活性[16];出人意料的是,UCHL3S75E也沒有展現(xiàn)出對這3種鏈接類型二泛素的生理水平切割活性。這些結(jié)果首次提供了UCHL3磷酸化之后活性提高的體外證據(jù),一定程度上支持了UCHL3受磷酸化調(diào)控的理論。同時,這些結(jié)果也暗示UCHL3切割泛素鏈可能存在尚未發(fā)現(xiàn)的、更為復(fù)雜的分子機(jī)制。

    在本課題組近期解析的UCHL3與K27二泛素復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)中,K27二泛素的2個泛素分子分別占據(jù)了UCHL3蛋白表面上的S1以及S2位點(diǎn)[19](圖6)。而去泛素化酶實(shí)現(xiàn)切割的前提是2個泛素的異肽鍵應(yīng)接近于活性中心,即2個泛素分子應(yīng)分別位于S1和S1’位點(diǎn)。由此推測,UCHL3也許是以二泛素為結(jié)合基本單元(在S1和S2位點(diǎn)結(jié)合),對三泛素或者更長的泛素鏈進(jìn)行切割,更確切地說是對S1與S1’之間的異肽鍵進(jìn)行切割。結(jié)構(gòu)分析顯示,Ser75的位置正處于UCHL3分子的S1’附近,其磷酸化可能誘導(dǎo)S1’位點(diǎn)結(jié)構(gòu)重排,幫助S1’位點(diǎn)形成接納泛素鏈底物的空間構(gòu)象,激活UCHL3蛋白對泛素鏈的切割活性。

    圖6 UCHL3與K27diub復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)及Ser75位置[19]Fig.6 The crystal structure of UCHL3 and K27 diub complex and position of Ser75[19].注:綠色代表UCHL3蛋白;青色和玫紅色代表K27 diub,其中玫紅色泛素分子占據(jù)了UCHL3蛋白的S1位點(diǎn),而青色泛素分子則占據(jù)了UCHL3蛋白的S2位點(diǎn);紅色位點(diǎn)代表UCHL3中Ser75。

    此外,盡管UCHL3與UCHL1的親緣關(guān)系最近,但Ser75只存在于UCHL3中,在UCHL1中并不存在,表明UCHL3受磷酸化調(diào)控的進(jìn)化獨(dú)特性。這與目前的研究結(jié)果較為吻合,即UCHL1只能對單泛素及其綴合物進(jìn)行切割[16],且并未發(fā)現(xiàn)其存在磷酸化調(diào)控機(jī)制,也未有文獻(xiàn)報道其具備切割多聚泛素鏈的活性。盡管與UCHL1序列同源,可以推測出,正是由于在Ser75位點(diǎn)的不同,UCHL3的底物范圍從單泛素及其綴合物擴(kuò)展到多泛素鏈,在細(xì)胞內(nèi)已進(jìn)化成一個真正可以對多泛素鏈底物進(jìn)行切割的去泛素化酶。當(dāng)然,這些推測還需要進(jìn)一步的生物化學(xué)以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加以證實(shí)。此外,值得注意的是,Ser75位點(diǎn)在小鼠、果蠅、水稻和玉米中保守存在,但是在擬南芥中卻變成了Glu,暗示著擬南芥中的UCHL3蛋白很可能是組成性活化的,無需其他激酶的磷酸化修飾便可切割泛素鏈。因此,在后續(xù)研究中,可以在擬南芥中將組成型活化位點(diǎn)Glu突變?yōu)镾er,觀察植株表型變化,探索植株水平上磷酸化調(diào)控UCHL3的意義。

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