李 靜, 王 莉, 道 敏, 胡 平, 肖 逸, 韓建林, 王玉濤*
1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院, 新疆維吾爾自治區(qū)葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 喀什 844000;2.新疆維吾爾自治區(qū)塔什庫(kù)爾干縣畜牧獸醫(yī)局, 新疆 塔什庫(kù)爾干縣 845250
牦牛(Bosgrunniens),屬哺乳綱(Mammalia),偶蹄目(Artiodactyla),反芻亞目(Ruminantia),???Bovidae)[1],主要分布在中國(guó)青藏高原以及與其相鄰近的亞高原地區(qū)[2~4],中國(guó)牦牛是世界牦牛數(shù)量最多[5~7]、品種資源最豐富的國(guó)家[8,9],中國(guó)牛品種志收錄的地方牦牛品種有5個(gè)[10],現(xiàn)國(guó)家鑒定的牦牛品種(類群)18個(gè),西藏藏族自治區(qū)主要的牦牛品種為帕里牦牛、嘉黎牦牛和斯布牦牛,青海省主要分布環(huán)湖牦牛和高原牦牛,四川省主要牦牛品種為九龍牦牛和麥洼牦牛,甘肅省主要牦牛品種為天祝牦牛和甘南牦牛,云南省牦牛品種為中甸牦牛,新疆維吾爾自治區(qū)已鑒定的牦牛品種為巴州牦牛,2014年后又陸續(xù)鑒定出四川省木里牦牛、金川牦牛、西藏藏族自治區(qū)類烏齊牦牛、青海省雪多牦牛、四川省昌臺(tái)牦牛;培育品種兩個(gè):包括青海省大通牦牛[11]和阿什旦牦牛[12~14],而以上品種資源均未涵蓋分布于新疆喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)的牦牛群體,是地方牦牛品種資源認(rèn)定分布上未涉及的種群。
牦牛幾乎是集各種家畜產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)[15]、性能于一身的多功能動(dòng)物[16~18],是我國(guó)高寒地區(qū)的主要畜種和重要的生產(chǎn)資料[9,19,21]。對(duì)牦牛遺傳多樣性的研究有助于了解牦牛的分類地位及其品種的遺傳多樣性,本文對(duì)牦牛地方種群現(xiàn)狀進(jìn)行了分子遺傳學(xué)分析,對(duì)牦牛資源的合理保護(hù)與科學(xué)利用具有重要意義。
在研究動(dòng)物遺傳多樣性分子標(biāo)記中,哺乳動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素b(Cytb)基因是線粒體DNA中重要的蛋白編碼基因,它包含從種內(nèi)到種間乃至到科間的進(jìn)化遺傳信息[21],因而被廣泛地用來(lái)進(jìn)行脊椎動(dòng)物種上和種下系統(tǒng)進(jìn)化研究[22],被認(rèn)為是解決系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題最可信的線粒體DNA標(biāo)記之一。常國(guó)斌[23]對(duì)20頭巴州牦牛進(jìn)行研究分析發(fā)現(xiàn),巴州牦牛核苷酸多樣性相對(duì)貧乏,單倍型多樣性相對(duì)較豐富,推測(cè)巴州牦??赡艽嬖诓煌哪赶灯鹪?。王蘭萍等[24]在分析巴州牦牛時(shí)發(fā)現(xiàn),一部分巴州牦牛含野牦牛血統(tǒng),推測(cè)可能由于這部分牦牛與野牦牛有共同祖先,在漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中仍保留相似序列。涂世英等[25]研究中甸牦牛發(fā)現(xiàn),中甸牦牛核苷酸多樣性較貧乏,而單倍型多樣性較豐富,推測(cè)中甸牦??赡艽嬖诓煌哪赶灯鹪矗到y(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明中甸牦牛與野牦牛親緣關(guān)系較近,其次是美洲野牛,推測(cè)中甸牦牛在發(fā)展的過(guò)程中與野牦牛發(fā)生了基因交流,作者支持牦牛屬于牛亞科牦牛屬的觀點(diǎn)。胡丹[26]對(duì)新疆塔什庫(kù)爾干縣牦牛10個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop序列和mtDNACytb進(jìn)行分析,表明塔什庫(kù)爾干縣牦牛具有豐富的遺傳多樣性,支持牦牛和野牦牛劃分為牛亞科牦牛屬的觀點(diǎn),但該研究采集樣本少且地理覆蓋率低。以上研究均未對(duì)分布在喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)的牦牛群體進(jìn)行深入研究,因此該地區(qū)牦牛遺傳多樣性、遺傳分化及系統(tǒng)地位尚不清楚。
牦牛在牛亞科中的分類地位一直是牛亞科動(dòng)物遺傳發(fā)育領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題,牦牛是隸屬于牛亞科中獨(dú)立的牦牛屬,還是與北美野牛隸屬于野牛屬,或是作為牛亞科牛屬牦牛亞屬仍存在熱議,到目前為止仍沒(méi)有確定的結(jié)論。姬秋梅[27]、李齊發(fā)[28]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn),牦牛與野牦牛、美洲野牛親緣關(guān)系較近,與牛屬關(guān)系較遠(yuǎn),李齊發(fā)[28]推測(cè)家牦牛與野牦牛的分化時(shí)間約為55萬(wàn)年前。楊萬(wàn)遠(yuǎn)[29]對(duì)野牦牛分析發(fā)現(xiàn),野牦牛具有豐富的遺傳多樣性,支持將牦牛劃分為牛亞科中一個(gè)獨(dú)立的牦牛屬,李齊發(fā)[28]也認(rèn)為家牦牛和野牦牛應(yīng)劃分為牛亞科獨(dú)立的牦牛屬。但常國(guó)斌[23]、錢(qián)建新[30]基于水牛屬的系統(tǒng)發(fā)育地位,認(rèn)為牦牛應(yīng)歸為牛屬中牦牛亞屬更合理。耿榮慶[31]牛亞科動(dòng)物親緣關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn),大額牛與瘤牛之間可能有共同的母系起源;家牛與準(zhǔn)野牛屬親緣關(guān)系相近、其次是牦牛屬,認(rèn)為牛亞科動(dòng)物應(yīng)劃分為4個(gè)屬,包括家牛屬、準(zhǔn)野牛屬、牦牛屬和亞洲水牛屬。
喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)海拔高、常年積雪、氣候干旱、地勢(shì)險(xiǎn)峻,這里形成了天然的地理隔離帶[32,33],從而造成牦牛之間基因交流少,群體退化較為嚴(yán)重,物種資源保護(hù)與利用亟待解決。為進(jìn)一步明確喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛遺傳多樣性水平、遺傳分化和系統(tǒng)進(jìn)化地位,本文以分布在該區(qū)域的牦牛為研究對(duì)象,選擇mtDNACytb遺傳標(biāo)記,利用PCR直接測(cè)序和生物信息學(xué)方法,研究喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛mtDNACytb序列特征和遺傳多樣性水平,選擇GenBank中已提交的野牦牛及不同品種家牦牛序列,利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),這將為該區(qū)域牦牛遺傳資源保護(hù)和利用提供理論依據(jù);利用牛亞科代表物種序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,研究牦牛在牛亞科中的分類地位。
本實(shí)驗(yàn)采集覆蓋疆喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)5個(gè)地方(塔什庫(kù)爾干縣、烏恰縣、阿克陶縣、阿合奇縣、葉城縣)牦牛群體血樣或肌肉組織樣本共計(jì)110個(gè)(表1)。血液樣本采取頸靜脈采血,ACD抗凝劑抗凝,-80℃超低溫保存;肌肉組織樣品取屠宰廠牦牛背最長(zhǎng)肌,編號(hào)后冷凍保存,運(yùn)輸途中保持低溫,儲(chǔ)存于喀什大學(xué)葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱,取部分樣品在100%乙醇中固定,分樣保存。
血液和肌肉組織DNA提取方法參考經(jīng)典的苯酚-氯仿抽提法,在此基礎(chǔ)上,由于血液、肌肉組織中蛋白質(zhì)含量較多,本實(shí)驗(yàn)中對(duì)飽和酚、氯仿-異戊醇處理步驟適當(dāng)重復(fù)及處理時(shí)間適當(dāng)增加。
表1 牦牛樣本采集的樣品信息Table 1 Sample information collected in this study.
引物設(shè)計(jì)與合成:以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已提交的家牦牛的mtDNA序列(GenBank登陸號(hào):GQ464270.1、JQ692071.1)為參考序列,利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物序列為:YAK mtDNAcytb-F:5′-GTTCCGTAGCCATAGCCG-3′, YAK mtDNAcytb-R: 5′-TTGAGTCTTAGGGAGGTT-3′。PCR目的產(chǎn)物的大小約為1 520 bp,引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
PCR反應(yīng)體系:總體積50 μL,其中2×TaqPCR Mix 26 μL,上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL,DNA模板(100 ng/μL) 2 μL,ddH2O 20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,51.5℃退火30 s,72℃延伸80 s,40個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。
通過(guò)Chromasversion 2.6.6原始序列峰圖數(shù)據(jù)進(jìn)行人工校對(duì)。利用Clustal X軟件對(duì)所測(cè)定的mtDNACytb序列進(jìn)行同源序列比對(duì),用MEGA 5.2、MEGA 6.06統(tǒng)計(jì)序列堿基組成分析,用DNASP 5.10.01軟件進(jìn)行單倍型的推導(dǎo),并開(kāi)展遺傳多樣性的分析;最后將獲得的單倍型數(shù)據(jù)用MEGA 6.06軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,采用軟件NETWORK 4.1.0.9進(jìn)行單倍型的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和頻率分布分析。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載已提交的野牦牛及中國(guó)不同品種牦牛mtDNACytb的同源序列共82條,這些序列的來(lái)源信息見(jiàn)表2,同時(shí)下載42條牛亞科代表物種及綿羊、犀牛序列,序列的來(lái)源信息見(jiàn)表3,將GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的序列進(jìn)行比對(duì)剪切為1 400 bp,便于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。
對(duì)110個(gè)喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛mtDNACytb區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)(圖1)。擴(kuò)增產(chǎn)物條帶質(zhì)量較好,條帶清晰、明亮、單一,無(wú)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,符合后續(xù)的PCR產(chǎn)物測(cè)序要求。
2.2.1牦牛mtDNACytb核苷酸組成 測(cè)序結(jié)果與參照序列GQ464270.1進(jìn)行比對(duì)、人工矯正后,將測(cè)序獲得的1 150 bp序列與參照序列GQ464270.1、JQ692071.1進(jìn)行對(duì)比和校對(duì)后,最后獲得長(zhǎng)約1 140 bp的核苷酸序列用于進(jìn)一步分析。
表2 從GenBank 下載的牦牛mtDNA Cytb 序列信息Table 2 Information of mtDNA Cytb sequences in yak retrieved from GenBank.
表3 從GenBank 下載的牛亞科代表物種mtDNA Cytb 序列信息Table 3 Information of mtDNA Cytb sequences of bovine subfamily representative species from GenBank.
圖1 mtDNA Cytb全長(zhǎng)擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of full length amplification of mitochondrial mtDNA Cytb.
利用Clustal X 軟件對(duì)所測(cè)定的mtDNACytb序列進(jìn)行同源序列比對(duì)后,通過(guò)MEGA5.2對(duì)mtDNACytb全序列長(zhǎng)度和堿基組成進(jìn)行分析(表4)。由表中可以看出這6個(gè)牦牛群體mtDNACytb中T、C、A和G 4種堿基的平均比例分別為26.2%(26.1%~26.2%)、29.0%(28.0%~29.1%)、31.7%和13.1%,在不同種群之間,mtDNACytb序列堿基差異不明顯。
表4 5個(gè)牦牛群體mtDNA Cytb序列(1 140 bp)的堿基組成Table 4 Nucleotide composition in the mtDNA Cytb sequences (1 140bp) of five populations of yak
2.2.2喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛mtDNACytb多態(tài)位點(diǎn)分析 用DNASP 5.10.01軟件對(duì)喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)5個(gè)牦牛種群的110個(gè)樣品的mtDNACytb全序列分析共檢測(cè)出多態(tài)位點(diǎn)10個(gè),界定出單倍型5個(gè)(表5,圖2)。其中H1、H4為特有單倍型,單倍型H1為阿合奇縣牦牛特有單倍型包含4個(gè)個(gè)體;單倍型H4為烏恰縣牦牛特有單倍型僅有2個(gè)個(gè)體;單倍型H2、單倍型H5為優(yōu)勢(shì)單倍型,5個(gè)牦牛群體均包含單倍型H2,共35個(gè)個(gè)體,單倍型頻率為31.82%;5個(gè)牦牛群體也均含有單倍型H5,共65個(gè)個(gè)體,單倍型頻率為59.09%;單倍型H3為3個(gè)牦牛群體共享單倍型,共有6個(gè)個(gè)體含1個(gè)阿克陶縣牦牛、1個(gè)烏恰縣牦牛、4個(gè)塔什庫(kù)爾干縣牦牛。
表5 5個(gè)牦牛群體中5個(gè)線粒體mtDNA Cytb單倍型(1 140 bp )在各群體中的分布Table 5 Distribution of five mitochondrial mtDNA Cytb haplotypes (1 140 bp) in five yak populations.
圖2 5個(gè)牦牛群體5個(gè)線粒體mtDNA Cytb單倍型(1 140 bp )中10個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的分布Fig.2 Distribution of 10 polymorphic loci in 5 mitochondrial mtDNA Cytb haplotypes (1 140 bp) in 5 yak populations.
2.2.3喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)mtDNACytb核苷酸多樣性和單倍型多樣性分析 用DNASP5.10.01軟件對(duì)喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛5個(gè)牦牛群體的110個(gè)個(gè)體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性進(jìn)行系統(tǒng)分析(表6),發(fā)現(xiàn)總的平均單倍型多樣性(Hd)為0.566±0.001 23,平均核苷酸多樣性(π)為0.002 95,平均核苷酸差異性(K)為3.363。
2.2.4基于mtDNACytb序列分析牦牛在牛亞科中的分類地位 為了揭示喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛群體與中國(guó)地方牦牛品種的差異情況和遺傳
表6 5個(gè)牦牛群體mtDNA Cytb 序列遺傳多樣性相關(guān)參數(shù)的分析結(jié)果Table 6 Results of genetic diversity parameters of mtDNA Cytb in the five populations of yak.
關(guān)系,為喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛的品種鑒定提供理論基礎(chǔ),我們進(jìn)一步對(duì)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的不同地區(qū)牦牛品種的mtDNACytb序列進(jìn)行比對(duì)分析和聚類分析(圖3,表7,圖4)。
通過(guò)DNASP 5.10.01軟件對(duì)喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛與野牦牛及中國(guó)10個(gè)牦牛品種和西藏地區(qū)牦牛mtDNACytb(1140 bp)共82條序列檢測(cè)出35個(gè)多態(tài)位點(diǎn),共獲得24個(gè)單倍型(表7,圖4)。單倍型H2、H3、H4、H5為優(yōu)勢(shì)單倍型,其中單倍型H2含有97個(gè)個(gè)體,占個(gè)體總數(shù)的50%;每個(gè)家牦牛品種中均含有1個(gè)特有單倍型,野牦牛含有7個(gè)特有單倍型;基于各種群間的遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛與野牦牛親緣關(guān)系較近,與巴州牦牛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。
2.2.5基于mtDNACytb序列分析牦牛在牛亞科中的分類地位 為了明確牦牛在牛亞科中的分類地位,我們進(jìn)一步對(duì)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的牦牛mtDNACytb序列進(jìn)行了比對(duì),建樹(shù)分析牦牛的分類地位,將110個(gè)喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛和下載的82條牦牛序列進(jìn)行單倍型分析后,將牦牛形成的24個(gè)單倍型與牛亞科代表物種42個(gè)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5),結(jié)果表明:牦牛首先和美洲野牛聚類,形成的分支與歐洲野牛聚類,再與印度野牛、大額牛、林牛、爪哇野牛及普通牛與原牛、瘤牛形成的分支聚為一類,最后和水牛屬相聚。
本研究測(cè)定mtDNACytb基因全長(zhǎng)為1 140 bp,牦牛mtDNACytb基因不存在長(zhǎng)度變異;T、C、A和G堿基的平均含量分別為26.2%、29.0%、31.7%、13.1%,其中A+T堿基含量(57.9%)大于C+G堿基的含量(42.1%),表現(xiàn)出了堿基的偏倚性;共發(fā)現(xiàn)10個(gè)多態(tài)位點(diǎn):均為轉(zhuǎn)換,與胡丹[26]研究10頭塔什庫(kù)爾干縣牦牛分析共得到3個(gè)SNP 位點(diǎn)變異類型結(jié)果一致,而與涂世英[25]分析中甸牦牛mtDNACytb基因發(fā)現(xiàn)3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)及楊萬(wàn)遠(yuǎn)[29]對(duì) 6頭野牦牛 mtDNACytb基因研究發(fā)現(xiàn) 13 處變異位點(diǎn)的變異類型(轉(zhuǎn)換、顛換)存在差異;表明喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛mtDNACytb基因SNP 位點(diǎn)較豐富,不同牦牛品種的SNP位點(diǎn)變異類型存在差異。
表7 12個(gè)牦牛群體24個(gè)mtDNA Cytb 單倍型(1 140 bp )在各群體中的分布Table 7 Distribution of 24 mtDNA Cytb haplotypes (1 140 bp) from 12 yak populations in each population.
圖4 12個(gè)牦牛群體24個(gè)線粒體mtDNA Cytb單倍型(1 140 bp )中35個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的分布Fig.4 Distribution of 35 polymorphic loci in 24 mitochondrial mtDNA Cytb haplotypes (1 140 bp) from 12 yak populations.
圖5 牛亞科代表物種間mtDNA Cytb序列系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育聚類圖Fig.5 Clustering gram of development and evolution between species of bovine subfamily based on mtDNA Cytb sequence.
本研究喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)110個(gè)牦牛中共界定出5個(gè)單倍型,平均單倍型多樣性(Hd)為0.566±0.001 23,平均核苷酸多樣性(π)為0.002 95,平均核苷酸差異性(K)為3.363。與涂世英[25]研究的中甸牦牛、常洪等[24]分析的巴州牦牛、胡丹[26]塔什庫(kù)爾干縣牦牛mtDNACytb的研究結(jié)果相比,平均單倍型多樣性(Hd)、平均核苷酸多樣性(π)均較高;但與姬秋梅[27]研究測(cè)定的西藏牦牛mtDNACytb基因相比平均單倍型多樣性(Hd)、平均核苷酸多樣性(π)均較低。說(shuō)明西藏牦牛遺傳多樣性最為豐富,喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛遺傳多樣性較為豐富,而中甸牦牛、巴州牦牛遺傳多樣性較弱;西藏牦牛豐富的遺傳多樣性與西藏是牦牛起源的觀點(diǎn)相符;喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛遺傳多樣性較為豐富,但基于喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)為天然的地理隔離帶,推測(cè)可能是由于最初遷徙至喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)的牦牛含不同起源有關(guān)。
本研究中牦牛與美洲野牛親緣關(guān)系較近,與普通牛、原牛及瘤牛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。前期基于mtDNA D-loop區(qū)序列研究,郭松長(zhǎng)[34]認(rèn)為牦牛應(yīng)與草原野牛、美洲野牛合為一個(gè)屬,而不是獨(dú)立為牦牛屬;李齊發(fā)[1]、鐘金城[35]支持將牦牛、野牦牛劃分為牛亞科中牦牛屬的觀點(diǎn);基于野牦牛線粒體全基因組研究,鐘金城[36]認(rèn)為牦牛屬應(yīng)為牛亞科中的一個(gè)獨(dú)立屬;基于mtDNACytb區(qū)序列研究,李齊發(fā)[26]也認(rèn)為家牦牛和野牦牛應(yīng)劃分為牛亞科獨(dú)立的牦牛屬;常國(guó)斌[23]、錢(qián)建新[30]基于水牛屬的系統(tǒng)發(fā)育地位,認(rèn)為牦牛應(yīng)歸為牛屬中牦牛亞屬更合理。本研究認(rèn)為牦牛應(yīng)屬于牛亞科中獨(dú)立的牦牛亞屬。
本研究首次以喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛為研究對(duì)象,對(duì)喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛110個(gè)個(gè)體的mtDNACytb基因進(jìn)行了測(cè)序,序列長(zhǎng)均為1 140 bp,形成5種單倍型,含10個(gè)多態(tài)位點(diǎn),核苷酸變異類型僅為轉(zhuǎn)換,平均單倍型多樣性(Hd)、平均核苷酸多樣性(π)較高,其群體變異程度高,遺傳多樣性較為豐富,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明與野牦牛親緣關(guān)系較近,與其他地方品種牦牛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛遺傳背景獨(dú)特,具有作為我國(guó)優(yōu)良地方牦牛品種的遺傳資源的潛質(zhì),應(yīng)加大對(duì)喀喇昆侖-帕米爾地區(qū)牦牛品種優(yōu)良資源的保護(hù)。