堿提酸沉法提取銀杏外種皮中銀杏酸的工藝研究

馬 慧，李博涵，朱美林，李紅梅，戴軼群，陳剛勝，吳成柱

銀杏GinkgobilobaL.為銀杏科銀杏屬多年落葉喬木[1]。銀杏酸是分布于銀杏葉、果和外種皮中的生物活性物質(zhì)，在外種皮中含量最高[2]。其為一系列弱極性化合物，包括白果新酸、白果酸、十七烷二烯銀杏酸、氫化白果酸以及十七烷一烯銀杏酸5種主要成分[3]，其中白果酸含量最高，也是目前對(duì)銀杏烴基酚酸類化合物進(jìn)行定量檢測的主要指標(biāo)[4]。銀杏酸對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5-6]，有較好的研究價(jià)值及市場應(yīng)用前景。銀杏外種皮是銀杏果實(shí)的最外層肉質(zhì)皮，常被作為廢棄物，以其為原料提取銀杏酸，有助于資源的充分利用。然而，在外種皮開發(fā)利用及工藝研究過程中，還存在問題：銀杏外種皮的開發(fā)利用工作還處在實(shí)驗(yàn)室的探索研究階段，未進(jìn)行工廠化大規(guī)模生產(chǎn)，落后于銀杏葉的開發(fā)利用。因此，亟需一種適合工業(yè)化生產(chǎn)銀杏酸的方法。目前，銀杏酸常用的提取方法有有機(jī)溶劑浸提法、回流法、超聲萃取法、超臨界CO2萃取法等[7-10]，但這些提取方法存在溶劑毒性較大、耗時(shí)耗能、設(shè)備要求高、成本較高等缺點(diǎn)，尚不能滿足生產(chǎn)需要。而采用堿提酸沉法提取銀杏酸，操作簡單方便，成本降低，無需加熱，可以節(jié)約大量能耗，不失為大量提取銀杏酸的首選工藝。本研究以堿提酸沉法提取銀杏外種皮中銀杏酸，通過正交試驗(yàn)確定最佳提取條件，為銀杏外種皮開發(fā)及綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 FA2204B型電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)，LC-20A型高效液相色譜儀[島津企業(yè)管理(中國)有限公司]，IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海人和科學(xué)儀器有限公司)，XW-80A型微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)，L550型離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，Milli-Q Advantage A10型超純水系統(tǒng)(密理博(中國)有限公司)，GR150A型粉碎機(jī)(合肥榮事達(dá)小家電有限公司)，DGG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.1.2 試劑 銀杏外種皮(購買于山東臨沂藥材市場，經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥基礎(chǔ)教研室李紅梅老師鑒定為銀杏科銀杏屬植物銀杏的外種皮)，碳酸氫鈉(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，鹽酸(分析純，江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司)，白果酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，純度>95%)，甲醇、乙腈(色譜純，美國天地有限公司)，三氟乙酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

1.2 溶液配制

1.2.1 供試品溶液的制備 取銀杏外種皮粉末適量，加碳酸氫鈉水溶液堿提，過濾取濾液，用鹽酸調(diào)pH，酸沉，過濾取濾渣，干燥即得。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取白果酸標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定5.0 mg，色譜甲醇溶解配成9.6 mg/mL的白果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，用色譜甲醇依次稀釋2倍，得到系列濃度工作液，依次為4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15 mg/mL。

1.3 色譜條件 色譜柱：Waters Sun FireTMC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；檢測器：島津SPD-20a；波長310 nm；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為0.05%三氟乙酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～30 min，75% B→90% B；30～35 min，90% B；35～45 min，90% B→75% B)。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別取“1.2.2”項(xiàng)下不同濃度的對(duì)照品工作液，按照“1.3色譜條件”進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

1.4.2 專屬性 分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液20 μL，按照“1.3色譜條件”進(jìn)行分析。

1.4.3 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的銀杏外種皮粉末0.1 g 6份，分別加入精密稱定的白果酸對(duì)照品，按照“1.2.1”項(xiàng)下方法處理，按“1.3色譜條件”測定6份混合后的峰面積，計(jì)算回收率。

1.4.4 日內(nèi)精密度 取同一銀杏外種皮提取液，按照“1.3色譜條件”連續(xù)進(jìn)樣6次分析，測峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.4.5 日間精密度 取同一份銀杏外種皮提取液按照“1.3色譜條件”連續(xù)3 d，每天連續(xù)進(jìn)樣3次，測峰面積并計(jì)算RSD。

1.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“1.2.1”項(xiàng)下方法制備同一濃度銀杏外種皮提取液6份，“1.3色譜條件”進(jìn)樣分析，測峰面積并計(jì)算RSD。

1.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一銀杏外種皮提取液，分別于0、12、24、48、96、120 h按照“1.3色譜條件”進(jìn)樣分析，測峰面積并計(jì)算RSD。

1.5 單因素試驗(yàn)

1.5.1 料液比對(duì)堿提酸沉提取銀杏酸工藝的影響 在堿液濃度3%，堿提時(shí)間1 h，酸沉pH 4，酸沉?xí)r間1 h條件下，選擇料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察，以白果酸含量為指標(biāo)，HPLC進(jìn)樣分析，記錄峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求各料液比下白果酸含量。

1.5.2 堿液濃度對(duì)堿提酸沉提取銀杏酸工藝的影響 在料液比1∶10，堿提時(shí)間1 h，酸沉pH 4，酸沉?xí)r間1 h條件下，選擇堿液濃度1%、2%、3%、5%進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察。

1.5.3 堿提時(shí)間對(duì)堿提酸沉提取銀杏酸工藝的影響 在料液比1∶10，堿液濃度3%，酸沉pH 4，酸沉?xí)r間1 h條件下，選擇堿提時(shí)間0.5、1、1.5、2 h進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察。

1.5.4 酸沉pH對(duì)堿提酸沉提取銀杏酸工藝的影響 在料液比1∶10，堿液濃度3%，堿提時(shí)間1 h，酸沉?xí)r間1 h條件下，選擇酸沉pH 2、3、4、5進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察。

1.5.5 酸沉?xí)r間對(duì)堿提酸沉提取銀杏酸工藝的影響 在料液比1∶10，堿液濃度3%，堿提時(shí)間1 h，酸沉pH 4條件下，選擇酸沉?xí)r間0.5、1、1.5、2 h進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察。

1.6 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取3個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)(見表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，得線性回歸方程為Y=5E+6X+685 953，r=0.999 4(n=6)，結(jié)果表明銀杏酸在0.15～4.8 mg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.1.2 專屬性 待測組分峰形良好，白果酸對(duì)照品保留時(shí)間為26.8 min，分離度>2，與其他峰可達(dá)到基線分離(見圖1)。

2.1.3 加樣回收率試驗(yàn) 該方法平均回收率為100.13%，RSD為1.61%，該方法準(zhǔn)確度良好(見表2)。

表2 加樣回收率結(jié)果

2.1.4 日內(nèi)精密度 計(jì)算該方法日內(nèi)精密度，RSD為0.39%，該方法日內(nèi)精密度良好。

2.1.5 日間精密度 計(jì)算該方法日間精密度，RSD為1.17%，該方法日間精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 測6份同一濃度提取液峰面積，計(jì)算RSD為1.45%，該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 記錄不同時(shí)間進(jìn)樣的峰面積，計(jì)算RSD為1.52%，表明銀杏酸在常溫放置120 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 單因素試驗(yàn) 單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著料液比增加，白果酸含量先增加后減少，1∶10料液比下銀杏外種皮中銀杏酸含量較高。隨著堿液濃度增大，銀杏酸含量變化幅度平緩，考慮到生產(chǎn)成本，堿液濃度選擇為3%。隨著堿提時(shí)間增加，白果酸含量逐漸增加并達(dá)到平緩趨勢，因此最佳堿提時(shí)間選擇為1 h。不同酸沉pH對(duì)應(yīng)的白果酸含量相差無幾，為節(jié)約鹽酸用量，選擇酸沉pH為5作為最佳酸沉pH。隨著酸沉?xí)r間延長，對(duì)應(yīng)的白果酸含量增加趨勢較小并保持平緩，因此最佳酸沉?xí)r間選擇為1 h。

2.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)極差值，影響因素由大到小順序依次為B堿液濃度>A料液比>C堿提時(shí)間，不同因素內(nèi)各水平對(duì)結(jié)果的影響強(qiáng)弱為：A2>A3>A1；B3>B2>B1；C2>C3>C1(見表3)。根據(jù)正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果，F(xiàn)C<顯著性檢驗(yàn)F0.05(2,2)=19.00

表3 L9(34)正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果

表4 L9(34)正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

F0.05(2,2)=19.00；F0.01(2,2)=99.00

3 討論

中國是銀杏之鄉(xiāng)，為了充分利用資源優(yōu)勢，人們對(duì)銀杏資源研究逐漸深入，近年來研究表明，銀杏外種皮中的有效部位銀杏酸在抗菌[11]、抗炎、殺蟲等方面具有很好的活性，也可抑制多種腫瘤的生長[12-13]，已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究、生物農(nóng)藥和化妝品等方面。銀杏外種皮中含有豐富的銀杏酸，從中提取銀杏酸，可充分利用資源優(yōu)勢，變廢為寶，具有廣闊的應(yīng)用前景。利用銀杏酸具有的酸性化學(xué)性質(zhì)，本研究以銀杏外種皮為原料，采用堿提酸沉法提取銀杏酸，通過正交試驗(yàn)確定最佳提取條件。

在前期研究基礎(chǔ)上，考察單因素時(shí)，選取料液比1∶10，碳酸氫鈉作為堿提溶劑，避免與酚羥基反應(yīng)生成銀杏酚而影響銀杏酸的生成，隨著料液比增加，白果酸含量先增加后減少，1∶10料液比下銀杏外種皮中銀杏酸含量較高，可能是因?yàn)?:10時(shí)銀杏酸達(dá)到飽和，堿液再增加，銀杏外種皮中其他酸性物質(zhì)析出，影響銀杏酸反應(yīng)析出。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，從生產(chǎn)成本和提取效率方面綜合考慮，選取料液比1∶10，堿液濃度3%，堿提時(shí)間1 h，酸沉pH 5，酸沉?xí)r間1 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。因正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果對(duì)試驗(yàn)的誤差和各因素作用是否顯著不能進(jìn)行準(zhǔn)確的估計(jì)，所以需要對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行方差分析。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，最終確定堿提酸沉法提取銀杏外種皮中銀杏酸的最佳工藝條件是料液比1∶10，堿液濃度3%，堿提時(shí)間1 h，酸沉pH 5，酸沉?xí)r間1 h。

參考銀杏酸含量測定的相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]，對(duì)色譜條件中的流動(dòng)相比例進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%三氟乙酸水的和含0.1%三氟乙酸的乙腈-0.1%三氟乙酸水等流動(dòng)相系統(tǒng)，另外考慮酸對(duì)色譜柱的影響，最終以乙腈-0.05%三氟乙酸水作流動(dòng)相較佳。以銀杏酸中含量最高的的白果酸為檢測指標(biāo)，采用HPLC測含量，根據(jù)方法學(xué)考察結(jié)果可知該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度精密度良好，穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，適合銀杏酸含量的測定。

目前，提取銀杏酸的方法主要包括有機(jī)溶劑浸提法、回流法、超聲萃取法、超臨界CO2萃取法，然而有機(jī)溶劑毒性較大，污染環(huán)境，成本較高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。回流法不適用于受熱易破壞的成分，且溶劑消耗量大，操作繁瑣，使用超聲萃取法存在噪音污染等不足，由于操作的局限性，大量生產(chǎn)中較少被采用。超臨界CO2萃取法是近年來發(fā)展起來的新提取工藝，但是對(duì)技術(shù)設(shè)備要求較高，一次性投資較大，工業(yè)化大規(guī)模使用還受到一定限制。而采用堿提酸沉法提取銀杏外種皮中銀杏酸，操作簡單易行，省時(shí)節(jié)能，節(jié)約成本，提取效率較高，適合銀杏外種皮中銀杏酸的大量提取。