七氟烷對幼年大鼠短期認知功能的影響及其機制*

龔濤武，鄭雪，楊洋，林夏妃，吳振宇，朱昭瓊

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，遵義 563000；2.貴州省遵義市婦幼保健院麻醉科，遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)，遵義 563000)

隨著社會的快速發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)的進步，接受手術(shù)治療的患兒日漸增多，而患兒家屬比較關(guān)注全身麻醉后是否會影響患兒的學(xué)習(xí)記憶能力。認知功能障礙以意識受損和思維模式紊亂為特征，發(fā)生后可導(dǎo)致患者學(xué)習(xí)能力的下降、記憶受損、人格改變等，甚至影響到患者術(shù)后的康復(fù)，已經(jīng)成為社會關(guān)注的熱點問題[1]。研究發(fā)現(xiàn)七氟烷可能會引起認知功能障礙的發(fā)生[2-3]。筆者在本研究對幼年大鼠進行七氟烷麻醉處理，觀察其認知功能所受到的影響及可能的發(fā)生機制，為七氟烷的臨床使用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD幼年大鼠30只，8周齡，體質(zhì)量220～250 g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.2試藥 七氟烷(山東魯南貝特制藥有限公司，批號：65170507)；磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)p85(α)抗體(武漢proteintech公司)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)抗體(武漢proteintech公司)、羊抗鼠IgG(H+L)抗體、β-action(1：1000)、BCA蛋白定量試劑盒均由北京綠澤森生物技術(shù)有限公司提供。

1.3儀器 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國BioRad公司)。Morris 水迷宮測試儀(成都泰盟科技有限公司)；DragerFabius麻醉機，Vamos氣體監(jiān)護儀(Drager公司，德國)；自制吸入麻醉箱。

1.4動物分組及給藥方法 采用隨機數(shù)字表法分為空白對照組(K組)，模型對照組(C組)和實驗組。實驗組分為4個亞組，分別為吸入2%七氟烷30 min后蘇醒2 h(Sev-2 h組)、12 h(Sev-12 h組)、24 h(Sev-24 h組)、72 h(Sev-72 h組)，每組5只。K組大鼠不做任何處理，C組大鼠于自制麻醉箱中吸入純氧30 min，Sev-2 h、Sev-12 h、Sev-24 h、Sev-72 h組大鼠分別吸入七氟烷30 min。自制密閉吸入麻醉箱內(nèi)鋪墊厚鈉石灰，通過控制揮發(fā)罐刻度使大鼠吸入七氟烷濃度始終維持在2.0%。K組、C組及Sev-2 h、Sev-12 h、Sev-24 h、Sev-72 h組分別吸入空氣、氧氣、七氟烷30 min后完全蘇醒2，12，24，72 h后再次進行定位航行實驗和空間搜索實驗，所有記錄數(shù)據(jù)同麻醉前。

1.5Morris水迷宮實驗 適應(yīng)性訓(xùn)練1 d：以適應(yīng)環(huán)境，剔除不會游泳的大鼠。連續(xù)5 d的定位航行實驗：標記四個象限，平臺距離水面2 cm。將大鼠面向池壁依次由4個象限中點入水，限定大鼠在120 s內(nèi)找到并爬上平臺休息10 s，若120 s內(nèi)未找到，則指引其找到并置于平臺上休息10 s，記錄逃避潛伏期和游泳總路程。空間探索實驗：定位航行實驗結(jié)束后次日撤去平臺，將所有大鼠從同一平臺象限入水，游泳120 s，記錄有效區(qū)域運動時間、有效區(qū)域運動距離和有效區(qū)域進入次數(shù)。Sev-2 h、Sev-12 h、Sev-24 h、Sev-72 h組再次行Morris水迷宮實驗并取材，K組、C組與Sev-2 h組于同一時間處理。

1.6血漿PI3K/AKT蛋白表達的檢測 Morris水迷宮實驗結(jié)束當天，各組5只大鼠分別腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg·kg-1，麻醉生效后取腹主動脈血5 mL，離心10 min，取上層血漿，-40 ℃保存待測。取出保存血漿標本常溫解凍，用BCA蛋白試劑盒測定總蛋白量。電泳：配制12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，濃縮膠為80 V，30 min，分離膠為120 V，75 min。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，在4 ℃冰水混合物下將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(300 mA ，90 min)。封閉：PVDF膜轉(zhuǎn)移至塑料平皿中，5%脫脂牛奶封閉120 min，TBST洗膜，加入PI3K p85(α)一抗(1：4000)或AKT一抗(1：4000)，4 ℃孵育過夜，第2天，TBST洗膜3次，每次15 min，孵二抗(1：8000)，于37 ℃溫箱孵育50 min，TBST清洗3次，每次15 min，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)液曝光，經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集，以條帶灰度反映PI3K和AKT的表達。

2 結(jié)果

2.1Morris水迷宮實驗結(jié)果 所有幼年大鼠麻醉前進行水迷宮訓(xùn)練，逃避潛伏期與總路程隨著時間的推移逐漸縮短，第3天后形成穩(wěn)定的空間學(xué)習(xí)記憶能力。見表1。

與K組、C組比較，Sev-2 h組逃避潛伏期、游泳總路程明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Sev-2 h組比較，Sev-24 h組、Sev-72 h組逃避潛伏期、游泳總路程縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

與C組比較，Sev-2 h組麻醉后有效區(qū)域運動時間、有效區(qū)域運動距離縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Sev-2 h組比較，Sev-24 h、Sev-72 h組有效區(qū)域運動時間、有效區(qū)域運動距離明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組有效區(qū)域進入次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表1 水迷宮訓(xùn)練逃避潛伏期與總路程

表2 6組大鼠逃避潛伏期與總路程

2.2PI3K、AKT表達結(jié)果 與K組、C組比較，Sev-2 h組PI3K、AKT表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；與Sev-2 h組比較，Sev-24 h組、Sev-72 h組PI3K、AKT表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖1。

3 討論

七氟烷作為目前臨床上常用的吸入麻醉或復(fù)合麻醉的常用藥物，具有血氣分配系數(shù)低、麻醉誘導(dǎo)和蘇醒迅速、呼吸道刺激小、芳香味和不易燃等優(yōu)點，尤其在小兒全麻誘導(dǎo)和維持中的優(yōu)勢顯著[4]。近年來，有研究報道，嚙齒類動物在七氟烷麻醉后可能會造成短期學(xué)習(xí)、記憶功能下降，許多臨床觀察發(fā)現(xiàn)兒童暴露在七氟烷麻醉會造成認知功能損傷，且多發(fā)生于術(shù)后1～3 d，其具體機制至今仍不明確[5-6]。2%七氟烷是臨床麻醉常用濃度，為與臨床相結(jié)合，同時參考文獻[7]，本研究選擇2%七氟烷作為麻醉處理的濃度。

表3 6組大鼠空間探索實驗結(jié)果

與K組比較，*1P<0.05；與C組比較，*2P<0.05；與Sev-2 h組比較，*3P<0.05。

Morris水迷宮是用于評價嚙齒類動物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力的經(jīng)典實驗，在神經(jīng)認知障礙的相關(guān)研究中得到了廣泛的應(yīng)用，但是否適用于測量動物的長時記憶還存在爭議[8]。因此，本研究以2%七氟烷麻醉幼年大鼠，并選擇Morris水迷宮實驗檢測幼年大鼠短期內(nèi)不同時間段的空間回憶探究能力。行為學(xué)結(jié)果顯示，Sev-2 h組逃避潛伏期、游泳總路程明顯較K組、C組延長。與C組比較，Sev-2 h組麻醉后有效區(qū)域運動時間、有效區(qū)域運動距離明顯縮短，表明幼年大鼠吸入2%七氟烷后2h出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶能力下降，而在12 h后幼年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力逐漸恢復(fù)。

PI3K/Akt信號通路作為一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細胞凋亡、存活和增殖等多種細胞過程。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，由催化亞基(p110)和調(diào)節(jié)亞基(p85)組成。Akt是絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要下游靶點。AKT是促進細胞損傷后存活的關(guān)鍵成員。多項研究表明，通路及其下游激酶可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，AKT可激活多種蛋白激酶，AKT的活化可誘導(dǎo)蛋白磷酸化，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡[9]。PI3K/AKT信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，通路的激活可抑制神經(jīng)細胞凋亡、改善神經(jīng)形態(tài)、增強突觸可塑性、減輕神經(jīng)損傷、減少炎癥細胞死亡[10-11]。本研究血漿Western blotting結(jié)果顯示，與K組、C組比較，Sev-2 h組PI3K、AKT蛋白表達明顯下降，12 h后蛋白表達量逐漸恢復(fù)，這與行為學(xué)的結(jié)果吻合，提示七氟烷麻醉后引起的幼年大鼠認知功能障礙可能與血漿PI3K、AKT蛋白的表達下調(diào)有關(guān)。這與本課題組前期實驗幼年大鼠吸入2%七氟烷麻醉后海馬中PI3K mRNA、AKT mRNA的表達結(jié)果一致[12]。本次研究未對幼年大鼠的海馬進行PI3K、AKT蛋白檢測對比為不足之處，課題組后期將會做進一步研究。

綜上所述，幼年大鼠在吸入2%七氟烷麻醉后發(fā)生短暫的認知功能障礙，而其機制可能與PI3K/Akt信號通路被抑制有關(guān)。