響應(yīng)面法優(yōu)化月季花中總黃酮的提取工藝

錢慧琴，秦晶晶，李亞杰，劉林煜，閆福林，2，*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000）

月季花（Rosac hinensisJacq.）屬于薔薇科（Rosaceae），薔薇屬（Rosa）常綠灌木[1]，因花期綿長，又稱為“月月紅”?；ù笃G麗，可作為庭院觀賞植物，目前應(yīng)用于化妝品和食品行業(yè)，作為精油提煉、制備香料、天然色素提取和食品加工的原料?；扇胨帲哂谢钛{(diào)經(jīng)、消腫解毒、疏肝解郁之效，用于治療月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)來腹痛，跌打損傷，血瘀腫痛，癰疽腫毒等證[2]。經(jīng)過大量試驗(yàn)研究表明，月季花含有多種化學(xué)成分，主要含有黃酮類、酚酸類、鞣質(zhì)類、揮發(fā)油等成分[3-6]，其中，黃酮類化學(xué)物質(zhì)在抗菌[7]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]等方面顯示較好的生物活性。目前，對(duì)于月季總黃酮的含量測定已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道[8]，但是針對(duì)月季花中總黃酮提取工藝的優(yōu)化鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化月季花中總黃酮的提取工藝，確定出最佳的提取工藝條件，旨在為月季花資源的開發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

月季葉：2018 年4 月采集于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院校園；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201408）：中國食品藥品檢定研究院；乙醇、NaNO2等試劑均為分析純：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（101-8）：江蘇金壇市佳美儀器有限公司；新世紀(jì)紫外可見分光光度儀（T6）：北京普析通用儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S）：金壇市金南儀器廠；電子分析天平（HA2004）：上海象平儀器儀表有限公司；循環(huán)水式真空泵（SHZ-D II）：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R206）：上海申生科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 月季花預(yù)處理

將采集的月季花洗凈，用濾紙吸干，于60 ℃烘干，粉碎，過篩，將烘干樣品放入廣口瓶中，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液，精密吸取 0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40、2.80 mL的蘆丁對(duì)照品溶液置于10 mL 容量瓶中，隨后分別依次加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻，放置6 min 后加入0.4 mL 10%硝酸鋁，放置6 min，最后加入4 mL 4%NaOH 溶液，加蒸餾水定容，搖勻，放置15 min，用紫外-可見分光光度計(jì)于510 nm 處測定其的吸光度A510。以蘆丁濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸收度A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The figure of standard curve

由圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程為：y=0.011 3 x+0.018 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。此方程具有良好的線性關(guān)系，可用于評(píng)價(jià)月季花總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.2.3 月季花中總黃酮的提取

精密稱定月季花粗粉約1 g，置于100 mL 圓底燒瓶中，按一定的液料比例，加入不同濃度的乙醇溶液搖勻后，在一定的溫度下進(jìn)行加熱回流提取一定時(shí)間，過濾至100 mL 圓底燒瓶中，于55 ℃減壓濃縮至干，加水20 mL 懸浮，加石油醚洗滌3 次，棄去石油醚部分，水相再加乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯部分，水浴蒸干，加乙醇溶解后定量轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，乙醇稀釋至刻度即得供試品溶液，待測。

1.2.4 月季花中總黃酮含量測定

精密吸取月季葉花供試品溶液1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，按“1.2.2”項(xiàng)下方法測吸光度。月季花中總黃酮質(zhì)量濃度按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程進(jìn)行計(jì)算。黃酮提取率計(jì)算公式如下：

式中：Y 為月季花中總黃酮提取率，mg/g；C 為月季花中總黃酮類化合物的質(zhì)量濃度，mg/mL；m 為樣品質(zhì)量，mg。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

按照“1.2.3”項(xiàng)下的方法分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、60%、70%、80%、95%）、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、液料比[15 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（ mL/g）]、提取時(shí)間（30、60、80、100、120 min）4個(gè)因素對(duì)月季花中總黃酮提取率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定響應(yīng)面的優(yōu)化范圍，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理為依據(jù)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、液料比（C）、提取時(shí)間（D）為自變量，固定提取次數(shù)為1 次，總黃酮提取率為因變量，采用四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化工藝，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design expert 8.0.6 建立數(shù)學(xué)回歸模型，確定月季葉總黃酮最佳提取工藝條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)月季花中總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)月季花總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由圖2 可知，月季花中總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，月季花總黃酮的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，黃酮類物質(zhì)溶出趨于飽和，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，其他醇溶性物質(zhì)溶出也增多，使得黃酮提取率反而下降。所以，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)中，選擇60%、70%、80%3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.1.2 提取溫度的影響

提取溫度對(duì)月季花總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)月季花總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由圖3 可知，隨著提取溫度的升高，月季花總黃酮的提取率隨之增加。當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最高，之后迅速降低?？赡苁且?yàn)楫?dāng)溫度較低時(shí)，總黃酮得不到充分的提取，但是過高的溫度又會(huì)導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)變成非黃酮類成分，其他醇溶性物質(zhì)隨著溫度升高溶出增加，最終導(dǎo)致總黃酮提取率迅速降低。所以，確定最佳提取溫度為 80 ℃。因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)中，選擇 70、80、90 ℃3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.1.3 液料比的影響

料液比對(duì)月季花總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 液料比對(duì)月季花總黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of liquid-to-solid ratio on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由圖4 可知，在液料比 15 ∶1（mL/g）～50 ∶1（mL/g）內(nèi)，月季花總黃酮提取率隨液料比的增大而增加。當(dāng)液料比大于50 ∶1（mL/g）時(shí)，總黃酮提取率反而下降。這可能是因?yàn)樵黾犹崛∪軇┡c原料的比例，有利于黃酮類物質(zhì)的溶出，但是，當(dāng)液料比達(dá)到50 ∶1（mL/g）時(shí)，黃酮類物質(zhì)的溶出達(dá)到飽和，繼續(xù)增加液料比，會(huì)使其他雜質(zhì)的溶出增多，同時(shí)會(huì)增加后續(xù)提取液的濃縮時(shí)間。所以，確定最佳液料比為 50 ∶1（mL/g），因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)中，選擇液料比例為 40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（mL/g）3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.1.4 提取時(shí)間的影響

提取時(shí)間對(duì)月季花總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)月季花總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由圖5 可知，在提取時(shí)間 50 min～100 min 范圍內(nèi)，月季花總黃酮提取率明顯增加，當(dāng)提取時(shí)間超過100 min時(shí)，隨著提取時(shí)間增加總黃酮提取率反而下降，這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過短黃酮類化學(xué)物質(zhì)溶解不充分，不能有效提取出來，但是提取時(shí)間過長導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。所以，確定最佳提取時(shí)間為100 min。因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)中，選擇提取時(shí)間80、100、120 min 3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化月季花總黃酮提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用響應(yīng)面分析法對(duì)月季花總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design with experimental values of flavonoid yield for response surface analysis

2.2.2 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到擬合全變量二次回歸方程：Y=12.53-0.69A+1.61B+0.83C-1.02D+0.21AB+0.79AC+0.52AD+0.23BC-2.04BD+0.27CD+1.74A2+1.08B2+0.92C2+1.06D2（R2=0.966 7），響應(yīng)面多元二次模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 The response surface quadratic model analysis of variance

續(xù)表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Continue table 3 The response surface quadratic model analysis of variance

由表3 可知，模型的 F=29.05，P＜0.000 1，表明該模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.054 4＞0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著；該模型相關(guān)系數(shù) R2=0.966 7 和調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.933 4，說明93.347%響應(yīng)值的變化是由獨(dú)立變量決定，只有6.66%的總變異系數(shù)不能由該模型來解釋，模型的變異系數(shù)為3.51%，在可接受的范圍內(nèi)，說明該試驗(yàn)值有較高的精密度及可靠性。綜上所述，可以通過該方程來預(yù)測月季花總黃酮的最佳提取工藝。一次項(xiàng)影響因素A、B、C、D 有顯著影響，根據(jù)F 值的大小，得出對(duì)月季花中總黃酮提取率各因素的影響依次是：提取溫度（B）＞提取時(shí)間（D）＞液料比（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）。交互項(xiàng)中，AC、BD 有顯著影響，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比、提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)月季花總黃酮提取率有顯著影響；二次項(xiàng)中A2、B2、C2、D2都有極顯著影響，說明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是存在一定交互作用。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件擬合繪制三維響應(yīng)曲面圖及相應(yīng)的等高線圖見圖6～圖11。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度的響應(yīng)曲線Fig.6 Response surface methodology analysis for interactive effects of alcohol concentration and extraction temperature

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的響應(yīng)曲線Fig.7 Response surface methodology analysis for interactive effects of alcohol concentration and solvent-to-solid ratio

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的響應(yīng)曲線Fig.8 Response surface methodology analysis for interactive effects of alcohol concentration and extraction time

響應(yīng)面圖坡度的陡峭程度直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，響應(yīng)面坡度陡峭，說明兩因素交互作用明顯，反之，響應(yīng)面坡度平緩，說明兩因素交互作用不明顯。等高線的形狀也可以反映各因素的交互影響是否顯著，若等高線為圓形，則表明兩變量之間的交互影響不顯著；若為橢圓形，則表明兩變量之間的交互影響顯著[9-10]。圖7、圖10 表現(xiàn)出響應(yīng)面陡峭，等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比、提取溫度與提取時(shí)間交互作用對(duì)月季花總黃酮提取率的影響顯著；圖6、圖8、圖9、圖11 表現(xiàn)出響應(yīng)面平緩，等高線呈現(xiàn)近圓形，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、提取溫度與液料比、液料比與提取時(shí)間交互作用對(duì)月季花總黃酮提取率的影響不顯著。這與響應(yīng)面顯著性分析結(jié)果一致。

2.2.4 最優(yōu)工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

圖9 提取溫度與液料比的響應(yīng)曲線Fig.9 Response surface methodology analysis for interactive effects of extraction temperature and solvent-to-solid ratio

圖10 提取溫度與提取時(shí)間的響應(yīng)曲線Fig.10 Response surface methodology analysis for interactive effects of extraction temperature and extraction time

圖11 液料比與提取時(shí)間的響應(yīng)曲線Fig.11 Response surface methodology analysis for interactive effects of solvent-to-solid ratio and extraction time

利用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)回歸模型求解方程，得出月季花總黃酮最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60.48%，提取溫度86.97 ℃，液料比42.02 ∶1（mL/g），提取時(shí)間 85.56 min，此條件下月季花總黃酮提取率最高，預(yù)測值為19.492 mg/g。為了驗(yàn)證模型的有效性，并結(jié)合實(shí)際情況將最佳提取工藝條件改為乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %、提取溫度87 ℃、液料比42 ∶1（mL/g）、提取時(shí)間 85 min，在此工藝條件下，月季花總黃酮提取率為19.15 mg/g，與模型預(yù)測值基本吻合，說明所得模型可以用來預(yù)測月季花中總黃酮提取率，對(duì)提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠可行。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)月季花總黃酮提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，建立月季花總黃酮提取工藝的二次多項(xiàng)式回歸模型，以及各個(gè)因素之間的交互作用對(duì)月季花中總黃酮得率的影響，確定最佳提取工藝。根據(jù)實(shí)際操作條件，將月季花總黃酮得率的最佳提取工藝修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %、提取溫度87 ℃、液料比42 ∶1（mL/g）、提取時(shí)間 85 min，為月季花資源的開發(fā)、綜合利用及其質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。