麥冬多糖的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析

王瑩，王華，趙麗，李嶼君

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物藥學(xué)院，江蘇泰州225300；2.南京理工大學(xué)泰州科技學(xué)院藥學(xué)院，江蘇泰州225300）

麥冬為多年常青草本植物，生長在溫暖濕潤的地方，主要分布在廣東、廣西、福建、臺灣、浙江、江蘇等地。麥冬作為養(yǎng)陰潤肺的上品，不僅具有抗疲勞、清除自由基，提高細(xì)胞免疫功能以及降血糖的作用，還具有催眠、抗心律失常、促進(jìn)胰島細(xì)胞功能恢復(fù)等作用。麥冬的主要化學(xué)成分有甾體皂苷、多糖、氨基酸等[1-2]。麥冬多糖作為麥冬的主要活性成分之一，具有耐缺氧、降血糖、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[3-9]。目前，已有文獻(xiàn)報道，麥冬多糖對四氧嘧啶所致糖尿病小鼠有降血糖作用并能改善小鼠的耐糖力，并且可提高長期負(fù)荷訓(xùn)練大鼠的免疫功能，抑制過氧化損傷和糖原的耗竭，具有良好的開發(fā)前景[10-11]。由此可見，尋找一種經(jīng)濟(jì)合適的麥冬多糖的提取方法至關(guān)重要。目前，已有學(xué)者采用水提醇沉法提取多糖，利用響應(yīng)曲面法和正交設(shè)計法優(yōu)化襄麥冬多糖和山麥冬多糖的工藝參數(shù)[12-13]，但鮮有采用二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計優(yōu)化廣東麥冬多糖的提取工藝以及抗氧化能力的報道。本文以廣東麥冬為原料，采用水提醇沉法提取多糖，以苯酚-硫酸法測定提取物中多糖的含量，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化提取工藝，并研究麥冬多糖的抗氧化活性，為廣東麥冬多糖的開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：產(chǎn)自廣東省經(jīng)炮制過的麥冬原料，60 ℃下真空干燥，經(jīng)多功能粉碎機(jī)粉碎，過20 目篩，所得麥冬粉末密封貯藏，備用。

葡萄糖對照品、苯酚（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：無錫靈達(dá)化工有限公司；硫酸（分析純）：無錫市佳妮化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HK-02A 多功能粉碎機(jī)：上海燁昌食品機(jī)械有限公司；HH-1 數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；UV-1800PC-DS2 紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；DZF-6050 真空干燥箱：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵：河南省予華儀器有限公司；LE204E 電子天平：梅特勒-托利多有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取葡萄糖對照品13.2 mg，加蒸餾水溶解，定容至 25 mL，精密吸取 0.00（空白）、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 上述溶液于10 mL 容量瓶中，分別加1 mL 5%苯酚水溶液，5 mL 濃硫酸，蒸餾水定容至刻度線，混合均勻，20 ℃放置30 min，在490 nm 處測定吸光度[14]，以吸光度值對葡萄糖溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.3.2 麥冬多糖的提取及測定

準(zhǔn)確稱取10 g 干燥的麥冬粉末于250 mL 燒杯中，按照一定的液料比加入蒸餾水，熱水浸提，抽濾，收集濾液，將濾液濃縮至10 mL 后加入足量95%乙醇，靜置，待多糖全部沉降，抽濾，濾餅經(jīng)真空干燥即得麥冬多糖。

將麥冬多糖用適量蒸餾水溶解后定容至250 mL，準(zhǔn)確移取1.00 mL 多糖溶液于250 mL 容量瓶中，加入5%苯酚水溶液1 mL、濃硫酸5 mL，定容，搖勻后放置30 min，在490 nm 處測定吸光度，通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析計算，從而得出麥冬多糖得率。

式中：m 為麥冬粉末的質(zhì)量，mg；A490為稀釋后的多糖溶液的吸光度；前一個250 為稀釋倍數(shù)；后一個250 為麥冬多糖溶液體積，mL。

1.3.3 麥冬多糖的抗氧化性作用試驗(yàn)

取適量干燥的麥冬多糖，配制 20、40、60、80、100、120 mg/L 麥冬多糖水溶液，備用。

采用DPPH 法[15-18]，準(zhǔn)確移取0.20 mL 不同濃度的麥冬多糖提取液于比色管中，加入預(yù)先配置好的4 mL 0.15 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液，搖勻后暗處放置30 min，以樣品溶劑為空白，測定其在515 nm 波長處吸光度A，同時測定樣品溶液在515 nm 處的吸光度A0及DPPH 甲醇溶液在515 nm 處的吸光度A1，每個樣品重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對麥冬多糖得率的影響

稱取5 份質(zhì)量為10 g 的麥冬粉末，按液料比為4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，70 ℃水浴浸提1.5 h，濾液濃縮至10 mL，加入50 mL 95%乙醇進(jìn)行醇沉，結(jié)果見圖2。

圖2 液料比對多糖得率的影響Fig.2 Effect of ratios of water to materials on extraction yield of polysaccharides

由圖2 可知，當(dāng)液料比在 4 ∶1（mL/g）～8 ∶1（mL/g）范圍內(nèi)時，隨著溶劑體積的增大，麥冬多糖的得率顯著上升；溶劑體積繼續(xù)增大時，麥冬多糖得率趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)檎麴s水用量越大，水中麥冬多糖濃度相對就越低，麥冬細(xì)胞內(nèi)外多糖濃度差越大，傳質(zhì)推動力越大，麥冬多糖就越容易浸出[19]。

2.1.2 提取時間對麥冬多糖得率的影響

稱取5 份質(zhì)量為10 g 的麥冬粉末，按液料比8 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，置于 70 ℃的恒溫水浴鍋中分別浸提 0.5、1、1.5、2、2.5 h，醇沉?xí)r加入 50 mL 95%乙醇，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield of polysaccharides

由圖3 可知，隨著提取時間的增多，多糖的得率逐步升高，這是由于當(dāng)提取時間較短時，多糖還未充分提取出來，當(dāng)提取時間為2 h 時，多糖得率最高，繼續(xù)提取，多糖得率幾乎不變。

2.1.3 乙醇用量對麥冬多糖得率的影響

分別稱取5 份質(zhì)量為10 g 的麥冬粉末，按液料比8 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，置于 70 ℃的恒溫水浴鍋中浸提 1.5 h，醇沉?xí)r分別加入 40、50、60、70、80 mL 95%乙醇，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇用量對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ethanol content of the yield of polysaccharides

由圖4 可知，隨著乙醇用量的增多，麥冬多糖水提液的乙醇濃度不斷增加，多糖得率逐步升高，當(dāng)乙醇用量超過60 mL 時，多糖得率趨于穩(wěn)定，這表明采用60 mL 乙醇進(jìn)行醇沉?xí)r，水提液中的大部分多糖已經(jīng)被沉降。

2.1.4 提取溫度對麥冬多糖得率的影響

稱取5 份質(zhì)量為10 g 的麥冬粉末，按液料比8 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，分別置于 50、60、70、80、90 ℃的恒溫水浴鍋中提取1.5 h，醇沉?xí)r加入50 mL 95 %乙醇，結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對多糖得率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction yield of polysaccharides

由圖5 可知，隨著溫度的升高，麥冬多糖的得率逐步增大。當(dāng)溫度由50 ℃上升至80 ℃時，多糖得率上升明顯，當(dāng)溫度超過80 ℃時，多糖得率上升趨勢趨緩。溫度越高，多糖分子擴(kuò)散速度加快，相同提取時間內(nèi)，多糖得率越高[20]。

2.2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化試驗(yàn)分析

2.2.1 設(shè)計因素和水平

綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計法對提取工藝進(jìn)行分析并優(yōu)化。通過Data Processing System 軟件設(shè)計試驗(yàn)，分析因素及水平編碼表見表1。

2.2.2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果與分析

麥冬多糖提取的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗(yàn)結(jié)果見表2。方差分析表見表3。

試驗(yàn)號根據(jù)多項(xiàng)式回歸方程Y=b0+∑biXi+∑bijXiXj+∑Xii，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果計算出擬合方程的各項(xiàng)系數(shù)，得到回歸方程：Y=19.430 00＋0.700 83X1－0.020 83X2＋1.010 83X3＋0.685 00X4－0.684 79X12－0.836 04X22－0.511 04X32－0.792 29X42＋0.232 50X1X2－0.210 00X1X3－0.027 50X1X4＋0.108 75X2X3－0.083 75X2X4＋0.238 75X3X4。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計法分析的因素和水平Table 1 Factors and levels of quadratic general rotary unitized design

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of results

由表3 可知，在單因素試驗(yàn)中，只有液料比（X2）這個因素的效果不顯著，剔除α=0.10 的不顯著項(xiàng)后[21-24]，顯著項(xiàng)的各個系數(shù)都可由表而知，得到得率對試驗(yàn)因素的回歸方程：Y=19.430 00＋0.700 83X1＋1.010 83X3＋0.685 00X4－ 0.684 79X12－ 0.836 04X22－ 0.511 04X32－0.792 29X42。

2.3 單因素分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對單因素進(jìn)行效應(yīng)分析，結(jié)果見表4 及圖6。

表4 單因素效應(yīng)分析Table 4 Effect analysis of single factor

圖6 各單因素與多糖得率的關(guān)系Fig.6 Relationship of single factors and yield of water soluble polysaccharide

由表4 和圖6 可知，提取時間影響得率變化最大，然后依次是提取溫度和乙醇用量，液料比最小。

當(dāng)試驗(yàn)水平為0.500 0 時，即提取時間為1.75 h時，多糖的得率最高，當(dāng)提取時間繼續(xù)延長，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢。因?yàn)闊崴釙r間過長時，多糖的組分則比較容易降解，使分子內(nèi)和分子間的氫鍵等弱相互作用力失效加劇降解，造成得率下降[21]。

乙醇用量的試驗(yàn)水平在0.500 0 時達(dá)到最高，此時乙醇用量為65 mL。繼續(xù)增加乙醇用量時，多糖得率降低。

當(dāng)提取溫度的試驗(yàn)水平為1.000 0 時，即提取時溫度設(shè)置為80 ℃，麥冬多糖的得率達(dá)到最高。當(dāng)溫度繼續(xù)增加時，多糖的耐熱性較差容易降解[17]，使得得率下降。

多糖從麥冬中溶出是一個由濃度差推動的擴(kuò)散過程[22]，在理論上講，水提時加入的蒸餾水越多，多糖就越容易擴(kuò)散。然而除了多糖擴(kuò)散的因素之外，也受細(xì)胞組織的影響。由于后續(xù)醇沉步驟中，為節(jié)省乙醇用量，需要將多糖的水提液濃縮，因此過大的溶劑體積會對試驗(yàn)造成不便，所以液料比選 8 ∶1（mL/g）較適宜。

2.4 優(yōu)化與驗(yàn)證

由試驗(yàn)結(jié)果可知，在試驗(yàn)中不但存在著單因素效應(yīng)，而且還有因素間的相互作用。綜合考慮試驗(yàn)中一些條件限制，比如熱水提取時加入蒸餾水的量不宜過大、提取溫度不宜過高等，需要對本文中回歸模型再進(jìn)行更深一步的研究。采用頻數(shù)分析法分析此模型確定最優(yōu)良的工藝條件，結(jié)果見表5。

表5 各變量取值的頻數(shù)分布Table 5 Probability distribution of variables

由表5 可知，麥冬多糖的最優(yōu)提取條件為：乙醇用量區(qū)間為 63.45 mL～67.28 mL、液料比區(qū)間為 7.69 ∶1（mL/g）～8.31 ∶1（mL/g）、提取溫度區(qū)間為 76.98 ℃～80.58 ℃、提取時間區(qū)間為1.651 h～1.837 h。在此范圍內(nèi)，考慮到實(shí)際的可操作性，結(jié)合單因素效應(yīng)分析結(jié)果，將最佳工藝條件定為：乙醇用量 65 mL、液料比為 8 ∶1（mL/g）、提取溫度為80 ℃、提取時間為1.7 h，在最佳條件下，麥冬多糖理論得率為20.29%。

通過驗(yàn)證得到麥冬多糖得率為20.17%，和理論值較為接近，表明本文擬合得到的回歸方程能夠較好的應(yīng)用于麥冬多糖的提取。

2.5 麥冬多糖物DPPH自由基清除能力

麥冬多糖對DPPH 自由基的清除作用結(jié)果見圖7。

圖7 麥冬多糖對DPPH 自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of Liriope spicata polysaccharide on DPPH free radicals

試驗(yàn)結(jié)果表明，麥冬多糖對DPPH 自由基具有一定的清除能力，且清除能力與麥冬多糖濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，即隨著麥冬多糖濃度的增加其清除DPPH 自由基的能力也在逐漸增加。當(dāng)麥冬多糖濃度達(dá)到100 mg/mL 時，麥冬多糖對DPPH 自由基的清除率達(dá)到63.78%，且趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本文采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計有助于克服二次回歸正交設(shè)計的缺陷，即二次回歸預(yù)測值依賴于試驗(yàn)點(diǎn)在因子空間中的位置，不能根據(jù)預(yù)測值直接尋找最優(yōu)區(qū)域，減少了誤差的干擾，從而易于得到組合較優(yōu)的提取條件。最終確定最佳提取工藝條件為：10 g 麥冬粉末，乙醇用量 65 mL、液料比為 8 ∶1（mL/g）、提取溫度為80 ℃、提取時間為1.7 h，麥冬多糖得率為20.17%。麥冬多糖對DPPH 自由基的清除能力隨著麥冬多糖濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)麥冬多糖濃度達(dá)到100 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率達(dá)到63.78%，且趨于穩(wěn)定。

目前，麥冬多糖的提取方法，除了水提醇沉法，還有酶提取法、微波提取法，酶提取法提取條件較溫和，可明顯提高植物成分的提取效率，但成本較高[25]。微波超聲法能夠提升釋放多糖的速度，縮短提取時間，但是超聲時間過長多糖會發(fā)生降解，影響多糖的得率[12]。水提醇法成本較低，提取方法簡單方便，適合于大規(guī)模生產(chǎn)，因此，研究水提醇沉麥冬多糖的最佳工藝參數(shù)和抗氧化活性可為今后深入研究和開發(fā)利用麥冬多糖提供參考。