蠶蛹多肽螯合鈣的生物可及性研究

王思遠(yuǎn)，趙梓月，穆利霞，廖森泰，鄒宇曉

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510610）

生物利用率是指進(jìn)入人體后能夠通過(guò)消化道吸收，最終到達(dá)血液或淋巴沮織內(nèi)（即進(jìn)入人體內(nèi)循環(huán)）的物質(zhì)占攝入總量的比例。生物可及性是指在胃腸道消化過(guò)程中，釋放到胃腸液中的量與攝入總量的比例，表示物質(zhì)能被人體吸收的相對(duì)量，也是人體可能吸收的最大量。因此，生物可及性研究是生物利用率研究的重要基礎(chǔ)[1]。人體對(duì)鈣的攝入主要來(lái)自膳食攝入，對(duì)鈣的吸收以離子（Ca2+）形式或結(jié)合到一種可溶性的有機(jī)分子上，才能夠穿過(guò)小腸上皮細(xì)胞被腸道吸收。人體攝入的鈣經(jīng)胃消化后，大部分處于可溶狀態(tài)，但到達(dá)腸環(huán)境中，會(huì)有部分被沉淀尤其是同時(shí)攝入食物中含有植酸、草酸、單寧以及纖維等時(shí)，易形成不溶性的鈣鹽影響人體對(duì)鈣的吸收[2]。所以，研究補(bǔ)鈣制劑在人體胃腸道環(huán)境中鈣的可溶性，即生物可及性，是非常有意義。

目前市面上的補(bǔ)鈣產(chǎn)品主要有以碳酸鈣為代表的無(wú)機(jī)鈣和以葡萄糖酸鈣、乳酸鈣和檸檬酸鈣等為代表的有機(jī)鈣。多肽螯合鈣穩(wěn)定性好、生物利用度高，作為新一代補(bǔ)鈣制劑越來(lái)越受到關(guān)注，應(yīng)用前景廣闊[3]。本團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)發(fā)了一種蠶蛹多肽螯合鈣，可溶性好，含鈣量高，本研究擬通過(guò)體外模擬胃腸道消化法，比較該蠶蛹多肽螯合鈣與碳酸鈣和葡萄糖酸鈣的生物可級(jí)性，為其補(bǔ)鈣制劑的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐與理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DF－101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CR22G Ⅲ型高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；ST85Best 真空冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Millrock 公司。

1.2 材料

新鮮削絲蠶蛹：兩廣2 號(hào)，韶關(guān)翁源縣真誠(chéng)意蠶桑專業(yè)合作社；Alcalase 酶（4.3×106U/mg）、胰蛋白酶（2.5×106U/mg）、胃蛋白酶（3.0×105U/mg）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；石油醚、鹽酸、硫化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鉀、氯化鈣、氯化鈉、無(wú)水乙醇：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；絡(luò)黑T：分析純，天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心；磷酸二氫鉀：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

2 方法

2.1 蠶蛹多肽螯合鈣的制備

蠶蛹→漂燙2 min→60 ℃烘干→粉碎過(guò)40 目篩→石油醚脫脂→加入Alcalase 酶酶解4 h→沸水中滅酶5 min→離心取上清液→按肽鈣比3.4 ∶1（質(zhì)量比）加入氯化鈣，調(diào)節(jié)pH 10，73 ℃反應(yīng)時(shí)間80 min→加入4 倍體積95%乙醇進(jìn)行沉淀→離心后取沉淀→冷凍干燥后得蠶蛹多肽螯合鈣樣品。

2.2 鈣含量測(cè)定

參照GB/T 5009.92-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鈣的測(cè)定》中的EDTA 滴定法。

2.3 體外模擬消化試驗(yàn)

2.3.1 模擬胃液和腸液配制

1）模擬胃液：將 0.2 g 氯化鈉、0.32 g 胃蛋白酶加入到80 mL 蒸餾水中，調(diào)pH 值至1.2 后定容至100 mL容量瓶。

2）模擬腸液：將0.68 g 磷酸二氫鉀加入到少量蒸餾水中震蕩至完全溶解，而后加入70 mL 蒸餾水，調(diào)pH 值至7.5 后，加入1 g 胰蛋白酶，混合均勻再用0.2 mol/L 氫氧化鈉調(diào)pH 值至7.5，用蒸餾水定容至100 mL 容量瓶。

2.3.2 體外模擬胃腸道消化試驗(yàn)

1）體外模擬胃環(huán)境消化試驗(yàn)

將裝有胃液的離心管在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，稱取一定量碳酸鈣、葡萄糖酸鈣、蠶蛹多肽螯合鈣使其鈣含量為2 mg/mL 投入胃液中。在37 ℃恒溫水浴振蕩器中分別振蕩 0、5、10、30、60、120 min 后取出于沸水中滅酶5 min，冷卻后在10 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液置于消化管中，加入10 mL 混合酸（濃硝酸/高氯酸=4 ∶1，體積比），置于電熱板上加熱硝化至剩余2 mL～3 mL，取出冷卻，測(cè)定鈣含量。

鈣釋放率/%=上清液中鈣含量/補(bǔ)鈣制劑中鈣含量×100

2）體外模擬腸道環(huán)境消化試驗(yàn)

將裝有胃液的離心管在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，稱取一定量碳酸鈣、葡萄糖酸鈣、蠶蛹多肽結(jié)合鈣使其鈣含量為2 mg/mL 投入胃液中。在37 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩120 min 充分消化后，調(diào)節(jié)pH 值至7.5 后加入腸液。分別在 0、5、10、30、60、120 min 取出于沸水中滅酶5 min，冷卻后在10 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液置于消化管中，加入10 mL 混合酸（濃硝酸/高氯酸=4 ∶1，體積比），置于電熱板上加熱硝化至剩余2 mL～3 mL，取出冷卻，測(cè)定鈣含量。

可溶性鈣比例/%=上清液中鈣含量/補(bǔ)鈣制劑中鈣含量×100

2.3.3 草酸、植酸、膳食纖維共存的體外模擬消化試驗(yàn)

1）不同濃度共存組分對(duì)補(bǔ)鈣制劑在胃腸中可溶性鈣含量的影響

在胃液中分別加入不同濃度（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%，質(zhì)量比）的草酸、植酸、膳食纖維，根據(jù)2.3.2 中1）的方法，在模擬胃環(huán)境中消化120 min，測(cè)定可溶性鈣含量。

將上述胃液中消化好的樣品，調(diào)節(jié)pH 值至7.5 后加入腸液，振蕩120 min。根據(jù)2.3.2 中2）的方法消化后，測(cè)定鈣含量。

2）草酸、植酸、膳食纖維存在下補(bǔ)鈣制劑在胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性

在胃液中加入1.0%草酸、植酸、膳食纖維，根據(jù)2.3.2 中1）的方法，檢測(cè)共存組分影響下，補(bǔ)鈣制劑在胃環(huán)境中不同時(shí)間的可溶性鈣含量。

在胃液中加入1.0%草酸、植酸、膳食纖維，根據(jù)2.3.2 中2）的方法，檢測(cè)共存組分影響下，補(bǔ)鈣制劑在腸環(huán)境中不同時(shí)間的可溶性鈣含量。

相對(duì)可溶性鈣比例/%=共存組分影響下可溶性鈣含量/未添加共存組分時(shí)的可溶性鈣含量×100

3 結(jié)果與分析

3.1 3 種補(bǔ)鈣制劑在模擬胃腸消化中的生物可及性

相同鈣含量的CaCO3、葡萄糖酸鈣和蠶蛹多肽螯合鈣在模擬胃環(huán)境中可溶性鈣的釋放率隨消化時(shí)間的變化情況如圖1 所示。

圖1 3 種補(bǔ)鈣制劑在胃中的釋放情況Fig.1 The solubility of calcium in simulated gastric digestion

隨著時(shí)間的變化，3 種補(bǔ)鈣制劑在胃酸作用下不斷解離形成鈣離子，且蠶蛹多肽螯合鈣的釋放速率相對(duì)較快。120 min 后，CaCO3的鈣釋放率僅為68.13%，而葡萄糖酸鈣和蠶蛹多肽結(jié)合鈣經(jīng)胃部消化后鈣釋放率均可達(dá)到90%以上。

經(jīng)胃消化后，3 種補(bǔ)鈣制劑在模擬腸環(huán)境中可溶性鈣的變化情況如圖2 所示。

圖2 3 種補(bǔ)鈣制劑在腸中的溶解情況Fig.2 The solubility of calcium in simulated intestinal digestion

pH 值是影響鈣吸收的重要環(huán)境因素。由于腸道呈堿性，進(jìn)入腸道后，溶解的Ca2+立刻與OH-反應(yīng)生成沉淀，3 種補(bǔ)鈣制劑的可溶性鈣比例瞬間降到25 %以下，且隨著時(shí)間變化，生成的沉淀越來(lái)越多，可溶性鈣含量不斷下降。碳酸鈣作為一種無(wú)機(jī)鈣鹽，穩(wěn)定性最差，120 min 后，CaCO3和葡萄糖酸鈣的可溶性鈣比例只有10%左右，可被吸收的鈣離子含量較低，而蠶蛹多肽螯合鈣的可溶性鈣含量為15.5%，高于前面兩者。

鈣能被吸收的前提條件是其在腸道中處于可溶狀態(tài)（即生物可及性），因此，穩(wěn)定性是補(bǔ)鈣制劑的重要指標(biāo)。目前市售的補(bǔ)鈣產(chǎn)品，其有效成分多為碳酸鈣、乳酸鈣或葡萄糖酸鈣，雖然含鈣量較高，但溶解度小，吸收利用不良，生物利用率低[4]。多肽螯合鈣是鈣離子與多肽結(jié)合形成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物，可以通過(guò)減少不溶性鈣化合物的形成來(lái)提高鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)[5]，同時(shí)，鈣離子可以螯合物的形式被完整地轉(zhuǎn)運(yùn)吸收并有效釋放[6]。

3.2 共存組分對(duì)3種補(bǔ)鈣制劑生物可及性的影響

機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，膳食中的鈣在嬰兒和兒童骨骼生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)吸收最好，吸收率可達(dá)70%左右，隨著年齡的增長(zhǎng)，鈣的吸收率逐漸下降，中年以后僅有30%左右[7]。影響鈣吸收的因素除機(jī)體狀態(tài)、飲食習(xí)慣、生活方式、腸道pH 值外，還受多種食物成分的影響[8]。膳食成分中的某些營(yíng)養(yǎng)素經(jīng)胃腸道消化后在小腸內(nèi)與鈣結(jié)合，會(huì)抑制鈣的吸收，如草酸、植酸、膳食纖維以及長(zhǎng)鏈脂肪酸等[9]。

3.2.1 草酸對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑生物可及性的影響

草酸普遍存在于植物中，如菠菜、芋頭、甘薯等均具有較高的草酸含量，已知草酸會(huì)通過(guò)形成鈣的不溶性鹽來(lái)干擾鈣的吸收，濃度過(guò)高甚至?xí)?dǎo)致腎結(jié)石的發(fā)生。以3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸消化中可溶性鈣含量為基準(zhǔn)，研究添加不同濃度草酸時(shí)的相對(duì)可溶性鈣含量，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同濃度草酸對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸中可溶性鈣的影響Fig.3 Effect of different oxalic acid on the solubility of calcium in simulated gastronintestinal digestion

在胃腸環(huán)境中，草酸對(duì)CaCO3、葡萄糖酸鈣、蠶蛹多肽螯合鈣的溶解性均有影響。隨著草酸濃度的不斷增大，3 種補(bǔ)鈣制劑經(jīng)胃消化后的相對(duì)可溶性鈣比例均有所降低，其中，受影響最大的是葡萄糖酸鈣，當(dāng)草酸濃度達(dá)到2.5%時(shí)，葡萄糖酸鈣的相對(duì)可溶性鈣含量?jī)H為27.2%。經(jīng)腸消化后，CaCO3的相對(duì)可溶性鈣含量?jī)H為17.2%，葡萄糖酸鈣和蠶蛹多肽螯合鈣的相對(duì)鈣含量分別為33.3%和37.6%。

進(jìn)一步研究添加1.0%草酸時(shí)，3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸消化過(guò)程中相對(duì)可溶性鈣比例的變化情況，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 草酸對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸中可溶性鈣含量變化的影響Fig.4 Effect of oxalic acid on the changes of soluble calcium in simulated gastronintestinal digestion

添加草酸后，CaCO3、葡萄糖酸鈣在胃消化過(guò)程中的可溶性鈣含量均明顯下降，消化120 min 后，CaCO3和葡萄糖酸鈣在胃中的含量為未添加時(shí)的55%左右，但蠶蛹多肽螯合鈣受影響較小，可保持75%左右。在腸消化過(guò)程中，草酸共存時(shí)，3 種補(bǔ)鈣制劑的相對(duì)可溶性鈣比例下降趨勢(shì)較緩慢，分別為73.2%、76.6%和82.5%，蠶蛹多肽螯合鈣受影響相對(duì)較小。

3.2.2 植酸對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑生物可及性的影響

3 種補(bǔ)鈣制劑添加不同濃度植酸時(shí)的相對(duì)可溶性鈣比例如圖5 所示。

圖5 不同濃度植酸對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸中可溶性鈣的影響Fig.5 Effect of different phytic acid on the solubility of calcium in simulated gastronintestinal digestion

植酸共存時(shí)，經(jīng)胃消化和腸消化后，3 種補(bǔ)鈣制劑的相對(duì)可溶性鈣比例均明顯下降，但下降幅度小于草酸。消化120 min 后，CaCO3、葡萄糖酸鈣和蠶蛹多肽螯合鈣的相對(duì)可溶性鈣比例分別為55.5 %、47.6 %和65.7%。腸消化后，三者的相對(duì)可溶性鈣比例分別為36.7%、54.8%和50.0%。

3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸消化過(guò)程中相對(duì)可溶性鈣比例的變化情況，結(jié)果如圖6 所示。

由圖6 可看出，添加1.0%植酸時(shí)，在胃環(huán)境中，蠶蛹多肽螯合鈣受影響最小，CaCO3和葡萄糖酸鈣受影響的程度差不多；腸環(huán)境中，3 種補(bǔ)鈣制劑間差異較小。

圖6 植酸對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸中可溶性鈣含量變化的影響Fig.6 Effect of phytic acid on the changes of soluble calcium in simulated gastronintestinal digestion

植酸普遍存在于豆類、谷類等植物中，具有很強(qiáng)的螯合能力，能夠與食物中金屬離子結(jié)合形成不溶性植酸鹽，植酸鹽是肌醇的六磷酸鹽并且可以與鈣結(jié)合，使它們?cè)隗w內(nèi)難以吸收[10]。Frontela 等通過(guò)添加外源植酸酶，利用Caco-2 細(xì)胞模型研究了嬰兒谷物食品中礦物質(zhì)的生物有效性，研究結(jié)果表明，添加外源植酸酶去除植酸后，谷物中的鈣在細(xì)胞水平上的吸收顯著增加[11]。

3.2.3 膳食纖維對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑生物可及性的影響

膳食纖維含量較高的谷物產(chǎn)品也會(huì)影響礦物元素的可利用性。不同濃度膳食纖維對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸中可溶性鈣的影響結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同濃度膳食纖維對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸中可溶性鈣的影響Fig.7 Effect of different dietary fiber on the solubility of calcium in simulated gastronintestinal digestion

由圖7 可以看出，膳食纖維濃度對(duì)和葡萄糖酸鈣和蠶蛹多肽螯合鈣在胃腸消化中的影響較小，添加膳食纖維后，兩者的相對(duì)可溶性鈣比例均能80%以上，且受濃度影響小。但添加膳食比例后，CaCO3的可溶性鈣明顯下降，尤其是在腸消化過(guò)程中，當(dāng)膳食纖維濃度為2.5%時(shí)，CaCO3的可溶性鈣比例僅為36.7%。

膳食纖維對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸中可溶性鈣含量變化的影響結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 膳食纖維對(duì)3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸中可溶性鈣含量變化的影響Fig.8 Effect of dietary fiber on the changes of soluble calcium in simulated gastronintestinal digestion

從圖8 可以看出，添加1.0%膳食纖維時(shí)，3 種補(bǔ)鈣制劑在胃腸道環(huán)境中可溶性鈣含量變化較小，均能保持80%以上。攝入膳食纖維含量較高的谷物產(chǎn)品也會(huì)影響人體對(duì)礦物元素的吸收利用，主要是膳食纖維中的糖醛酸殘基可以在胃腸道內(nèi)電離成負(fù)電性，以靜電離子鍵或配位鍵與鈣離子結(jié)合成絡(luò)合物，從而影響鈣的吸收[12]。

4 結(jié)論

碳酸鈣、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣等離子鈣的缺點(diǎn)是在基礎(chǔ)腸道環(huán)境中容易形成鈣沉淀，導(dǎo)致膳食鈣的吸收和生物利用度嚴(yán)重降低。此外，過(guò)量攝入碳酸鈣可能導(dǎo)致胃腸道副作用，包括便秘、產(chǎn)生氣體、腸胃氣脹和腹脹。螯合鈣作為離子鈣的優(yōu)選替代物，被認(rèn)為克服了離子鈣的兩個(gè)主要局限，即低濃度的低吸收和低生物利用度，以及高水平的生物毒性。肽鈣螯合物在消化過(guò)程pH 值變化中可保持溶解并且是電中性的，其可在腸道內(nèi)通過(guò)特定通道直接被吸收，吸收速度快且吸收量大，是作為增加人體胃腸道鈣吸收補(bǔ)充劑的合適候選物[13]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于尋找高效、低成本的多肽材料，已從多種食品蛋白中制備出金屬螯合肽，如魚(yú)骨、南極磷蝦、太平洋鱈魚(yú)等[14-16]，并發(fā)現(xiàn)這些肽類在改善鈣等二價(jià)礦物元素生物利用度方面具有極大的潛力。

本文以CaCO3、葡萄糖酸鈣為對(duì)照，探究蠶蛹多肽螯合鈣在胃腸道環(huán)境中的生物可及性。在模擬胃消化環(huán)境中，蠶蛹多肽結(jié)合鈣的鈣釋放量達(dá)90%以上，在腸道環(huán)境中，其可溶性鈣含量顯著高于CaCO3、葡萄糖酸鈣；在食物共存成分草酸、植酸、膳食纖維的影響下，蠶蛹多肽螯合鈣仍具有較好的穩(wěn)定性，是理想的鈣補(bǔ)充劑材料。