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    PCV2 感染后JAK-STAT 信號通路的基因差異表達(dá)分析

    2019-10-12 01:23:44時建立吳曉燕孫盼盼
    中國動物檢疫 2019年10期
    關(guān)鍵詞:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)定量熒光

    時建立,彭 喆,吳曉燕,,王 碩,孫盼盼,王 妍,李 俊

    (1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實驗室,山東濟(jì)南 250100;2. 山東師范大學(xué)生命科學(xué)院,山東濟(jì)南 250014;3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,山東青島 266109)

    豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)等多種疾病[1],是當(dāng)前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。豬圓環(huán)病毒毒株一直在不斷地變異,其中由PCV2 引發(fā)的疾病引起了研究人員更為廣泛的關(guān)注,但到目前為止,其致病機(jī)制尚未被完全闡明。

    信號通路在病毒感染細(xì)胞后的復(fù)制和致病力等方面發(fā)揮著重要作用。PCV2 感染后引發(fā)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究將有助于闡明PCV2 的致病機(jī)理。

    TLR/MyD88/NF-κB、JNK/p38MAPK、PI3K/Akt

    以及AMPK/ERK/TSC2/mTOR 等信號通路,在PCV2 感染過程中發(fā)揮著促進(jìn)感染細(xì)胞凋亡、促進(jìn)或增強(qiáng)病毒本身復(fù)制能力等作用[2-9],基因描述見表1。JAK-STAT 途徑是多數(shù)細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)途徑,在α-IFN 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用。α-IFN 與細(xì)胞膜上α-IFN 受體結(jié)合,激活JAKSTAT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,控制包括免疫應(yīng)答、細(xì)胞生長、細(xì)胞分化和血細(xì)胞生成等多種重要的生物學(xué)功能。截至目前,JAK-STAT 信號通路在PCV2 感染PK-15 細(xì)胞時的作用機(jī)制及其與病毒復(fù)制的相關(guān)性尚無報道。

    本研究采用PCR 列陣方法,建立PK-15 細(xì)胞JAK-STAT 信號通路的功能分類芯片,通過分析JAK-STAT 信號通路中Jak 和Stat 家族成員、激活JAK-STAT 信號通路的受體、與Stat 蛋白相關(guān)的核輔助因子及共同活化因子、Stat 誘導(dǎo)蛋白及該通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白等基因在PCV2 感染前后的差異表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究JAK-STAT 信號通路在PCV2 感染時起作用的關(guān)鍵基因、影響PCV2 復(fù)制的分子機(jī)制、提高病毒滴度及宿主抗病毒免疫反應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試驗材料與儀器

    PK-15 細(xì)胞PCR-Array 分類芯片、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒:購自QIAGEN 公司;Roche480 II 熒光定量PCR 儀:購自德國羅氏公司。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純品。

    1.2 病毒感染和RNA 提取

    無PCV1 污染的PK-15 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)基(GIBCO)中,6 孔板長到80%時接種滴度為106.0TCID50/mL PCV2 SD 株(GenBank:DQ478947)1 mL,分別培養(yǎng)24、48、60 和72 h,棄上清液;采用QIAGEN 公司的RNA 提取試劑盒提取RNA,具體步驟按照說明書進(jìn)行。

    1.3 反轉(zhuǎn)錄和PCR-Array 反應(yīng)

    采 用QIAGEN 公 司 的RT2 First Strand 試 劑盒進(jìn)行cDNA 合成,操作步驟按照說明書進(jìn)行。PCR-Array 反應(yīng)在96 孔板中進(jìn)行,取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 102 μL,QIAGEN 公司2×RT2SYBR Green Mastermix 1 350 μL,再加入無RNase 的水至2 700 μL;將其加入96 孔板中,25 μL/孔,按照以下程序進(jìn)行熒光定量反應(yīng):95 ℃ 10 min、95 ℃15 s、60 ℃ 1 min,并收集熒光信號,72 ℃ 15 s,40 個循環(huán)。采用QIAGEN 公司的線上數(shù)椐庫進(jìn)行統(tǒng)計分析。

    1.4 相對定量PCR 驗證

    根據(jù)PCR-Array 統(tǒng)計結(jié)果,選擇接種病毒后上調(diào)、下調(diào)明顯的基因,應(yīng)用熒光定量PCR 重新驗證,以GAPDH 為內(nèi)參基因,進(jìn)行相對定量檢測。選擇基因及其引物設(shè)計如下:

    應(yīng)用以下程序進(jìn)行熒光定量反應(yīng),擴(kuò)增曲線:95 ℃ 30 s,循環(huán)1 次;95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s,循環(huán)40 次,72 ℃單點(diǎn)檢測信號。溶解曲線:95 ℃ 0 s、65 ℃ 15 s、95 ℃ 0 s,連續(xù)檢測信號。

    表1 相對定量PCR 試驗中的基因名稱及引物序列

    采用2-△△Ct 法,對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR-Array 反應(yīng)

    通過QIAGEN 公司的線上數(shù)椐庫,對PCRArray 的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:除去應(yīng)用的6 個對照基因后,選擇的90 個JAK-STAT信號通路相關(guān)基因,在PCV2 接種PK-15 細(xì)胞24 h 后,提取樣品中有39 個基因為下調(diào)基因,16 個為上調(diào)基因;48 h 后,提取樣品中有36 個基因為下調(diào)基因,21 個為上調(diào)基因;60 h 后,提取樣品中有51 個基因為下調(diào)基因,9 個為上調(diào)基因;72 h 后,提取樣品有53 個基因為下調(diào)基因,13 個為上調(diào)基因。此結(jié)果也進(jìn)一步證明,細(xì)胞中JAK-STAT 信號通路對病毒感染后的調(diào)控是一個動態(tài)變化過程,不同時間點(diǎn)有不同的基因參與調(diào)控,而且不同時間點(diǎn)的部分基因表達(dá)有顯著性差異,從而盡可能維持細(xì)胞平衡?;虿町惐磉_(dá)情況如圖1 所示。

    圖1 JAK-STAT 信號通路在不同時間點(diǎn)提取樣品后的差異基因表達(dá)情況

    2.2 相對定量PCR 檢測

    根據(jù)PCR-Array 檢測結(jié)果,重新選取在4 個時間點(diǎn)都有明顯差異表達(dá)的16 個基因合成引物,以GAPDH 為內(nèi)參基因進(jìn)行相對定量檢測。結(jié)果顯示:在選擇的16 個基因中,和PK-15 細(xì)胞對照組相比,基因IL2RG、PIAS3、ISG15、SOCS3 和IL10RA 基因上調(diào)表達(dá)明顯,與PK-15 細(xì)胞對照組差 異 顯 著;B2M、IRF1、GRB2、LRG1 和GRB2基因的上調(diào)表達(dá),與PK-15 細(xì)胞對照組相比差異 不 顯 著;SMAD4、CEBPB、JAK2、STAT5A、INSR、JUN 和SRC 基因的下調(diào)表達(dá),與PK-15 細(xì)胞對照組相比差異不顯著,和PCR-Array 檢測結(jié)果基本一致(圖2)。

    3 討論

    PCV2 1991 年在加拿大首次暴發(fā),隨后在世界許多國家和地區(qū)流行。目前我國大部分豬群中存在PCV2 感染,且常與多種病原混合感染,造成形式多樣、病理復(fù)雜的臨床癥狀,尤其是斷乳仔豬,同時表現(xiàn)腹瀉、呼吸困難、嚴(yán)重消瘦、貧血,偶爾伴有黃疸,隨著共感染病原的不同,死亡率也有很大差異,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[10]。

    圖2 熒光定量PCR 檢測基因差異表達(dá)情況

    細(xì)胞因子IL-2 不僅在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,而且能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。Teng 等[11]發(fā)現(xiàn),PK-15 細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-2 基因并穩(wěn)定表達(dá)后,能夠顯著提高PCV2 的增值能力,在PCV2 增值中發(fā)揮著重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn),在PK-15 細(xì)胞接種PCV2 后,IL-2 受體基因(IL2RG)表達(dá)明顯上調(diào),IL-2 受體與IL-2 特異性結(jié)合后,可活化細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。主要發(fā)揮作用的3 條信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為:JAK/STAT5 通路、P13K/Akt/mTOR 通路以及絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路。不同類型的細(xì)胞可以通過激活不同的分子進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo),3 條通路既相互聯(lián)系,又相互影響。本研究還發(fā)現(xiàn),活化 Stat 的蛋白抑制物3(PIAS3)、干擾素刺激基因15(ISG15)等在PCV2 感染后也有明顯的上調(diào)表達(dá),提示其在病毒刺激機(jī)體產(chǎn)出先天性免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。對于IL-2 及其受體基因在PCV2 感染PK-15細(xì)胞中的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)作為SOCS 家族的重要成員之一,是在細(xì)胞因子和生長相關(guān)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起負(fù)性調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)因子。大量研究證明,SOCS3 基因可被多種炎癥因子誘導(dǎo)表達(dá),并且可抑制多種免疫分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖3)。最近的報道顯示,SOCS3 基因的過表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長,促進(jìn)其凋亡,并且降低AKT 磷酸化水平,說明SOCS3 基因能夠抑制AKT 激活,從而調(diào)控細(xì)胞生長。Zhu 等[14]研究發(fā)現(xiàn),PCV2 感染后,SOCS3 基因在沒有臨床癥狀仔豬的PBM 細(xì)胞中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),在PK-15 細(xì)胞中也是上調(diào)表達(dá),被小干擾RNA 抑制后,IL-6 和TNF-α 的表達(dá)量明顯上調(diào),因此SOCS3 基因可抑制原代免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng),在PCV 2 亞臨床感染中發(fā)揮重要作用。本研究也證實,PCV2 感染后SOCS3 基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),但對JAK/STAT 信號通路及其在PCV2 感染PK-15 細(xì)胞中的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

    圖3 Jak-stat 信號通路發(fā)揮作用示意圖

    4 結(jié)論

    本研究發(fā)現(xiàn):PCV2 感染PK-15 細(xì)胞后,JAK-STAT 信號通路所有已知的Jak 和Stat 家族成員、激活JAK-STAT 信號通路的受體、與Stat 蛋白相關(guān)的核輔助因子及共同活化因子、Stat 誘導(dǎo)蛋白及該通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白等基因均發(fā)生差異表達(dá);信號通路對病毒感染后的調(diào)控是一個動態(tài)變化過程,不同時間點(diǎn)有不同的基因參與調(diào)控,從而盡可能維持細(xì)胞平衡。

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