環(huán)狀RNA FBLIM1在肝細(xì)胞癌中生物學(xué)功能的初步研究

彭婀敏，夏發(fā)達(dá)，王文龍，姚磊，梁婕，白寧

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1.國際醫(yī)療部 2.普通外科 3.急診科，湖南 長沙 410008）

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，至今仍沒有得到充分有效的控制，呈現(xiàn)較高的病死率[1-3]。原發(fā)性肝癌病理類型包括肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）（75%～85%）、膽管細(xì)胞癌（10%～15%）、混合型肝癌以及其他罕見類型。目前，針對(duì)HCC的治療方法主要是以外科手術(shù)為主的包括：肝移植、經(jīng)皮穿刺射頻消融、介入治療和分子靶向藥物、免疫治療藥物等為輔的綜合治療[4-6]。然而，盡管手術(shù)技術(shù)和與之相配套的綜合治療方案在過去幾十年不斷改善，但HCC的預(yù)后仍然很差[7-9]。大部分HCC患者在初診的時(shí)候已經(jīng)處于晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，并且即使接受了系統(tǒng)的治療，HCC患者5年復(fù)發(fā)率也高達(dá)70%[10]。因此，對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，尋找新的分子靶點(diǎn)以發(fā)掘更有效的HCC治療策略成為需迫切解決的問題。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是內(nèi)源性非編碼RNA的一類，其結(jié)構(gòu)為共價(jià)環(huán)狀閉合的單鏈RNA。近年來，隨著生物信息學(xué)以及RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究者逐漸認(rèn)識(shí)到circRNA在生命科學(xué)當(dāng)中的重要作用。Sand 等[11]發(fā)現(xiàn)23 個(gè)circRNA在基底細(xì)胞癌中上調(diào)，48個(gè)下調(diào)。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_002059在胃癌的表達(dá)明顯比癌旁組織低，可作為胃癌的生物標(biāo)志物。與mRNA和lncRNA相比，HCC中circRNA的研究仍處于初步階段，在HCC中circRNA的作用及分子機(jī)制仍然不明。到 目前為止，在HCC 中僅鑒定和表征了少量功能性circRNA。筆者前期對(duì)HCC患者的腫瘤組織及其癌旁肝組織進(jìn)行了高通量的circRNA芯片篩選，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0010090是在HCC 細(xì)胞系當(dāng)中上調(diào)最為明顯的環(huán)狀RNA，根據(jù)人類參考基因組（GRCh37/hg19），發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0010090（chr1：16084668-16113084）是源自于位于染色體1p36.21上的FBLIM1基因，故將其命名為“circFBLIM1”。本研究將進(jìn)一步探討circFBLIM1在HCC中的功能，為發(fā)現(xiàn)circRNA在HCC中的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估方面的潛在價(jià)值提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

HCC細(xì)胞系HepG2、7402、97H均購買自美國ATCC，并且嚴(yán)格按照美國模式培養(yǎng)物保藏所的要求進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞系在使用后每6個(gè)月通過短串聯(lián)重復(fù)DNA分析重新鑒定，并且排除支原體感染。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS（巴西GIBCO）的DMEM（美國Invitrogen）中，于37 ℃，5%CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡，BALB/c雌性裸鼠，30只，（20±2）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。在無特定病原體條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)地點(diǎn)：中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。所有動(dòng)物研究均經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)。根據(jù)IACUC方案遵循標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)室指南。

1.3 主要試劑及儀器

RNAiso plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒均購自日本Takara公司；Transwell小室、基質(zhì)膠Matrigel（BD）；ThermoND2000C超微量分光光度計(jì)（Thermo）、GeneAmp PCR system 9700擴(kuò)增儀（PerkinElmer）、Ligh tCycler?480 II System（Roche）。circFBLIM1干擾序列（sicircFBLIM1）：GCA AUA CAC AAG UGC AUA CTT；陰性對(duì)照序列：UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT（廣州銳博生物科技有限公司合成）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期的HCC 細(xì)胞株接種于6 孔板（5×105/ 孔）中待生長至匯合度為50% 時(shí)，按照Lipofectamine2000 說明書要求分別轉(zhuǎn)染si-circFBLIM1 與陰性對(duì)照序列。

1.4.2 qRT-PCR 提取好的RNA 進(jìn)行濃度測(cè)定，各取1 μg RNA 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將cDNA 進(jìn)行一定的稀釋，作為RT-PCR 的模板，參照熒光定量PCR 試劑盒（SYBR染料法）說明書進(jìn)行PCR。mRNA 相對(duì)表達(dá)水平的定量采用比較Ct 法來計(jì)算相對(duì)定量，內(nèi)參選擇GAPDH。

1.4.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn) HCC 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后24 h 后，以100 μL 細(xì)胞懸液（約1×103細(xì)胞）接種到96 孔板，分別在0、1、2、3、5 d 后加入10 μL/孔CCK-8 溶液，避光37 ℃培養(yǎng)2 h，用Bio-Tek EPOCH2 檢測(cè)450 nm 波長處的吸光度。

1.4.4 Transwell 試驗(yàn) HCC 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后24 h后，采用胰酶消化細(xì)胞并離心棄上清，用無血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:8 比例稀釋50 mg/L的Matrigel 后，加50 μL稀釋后的Matrigel 包被Transwell 小室底部膜，將1×105/100 μL 細(xì)胞懸液接種到上室，下室加500μL 含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，48 h 后取出小室，棄上室培養(yǎng)基，用棉簽拭掉頂部的未侵入細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)入侵細(xì)胞。

1.4.5 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 將HepG2 細(xì)胞懸浮于無血清培養(yǎng)液中，調(diào)整濃度至5×107/mL，將細(xì)胞接種于裸鼠一側(cè)腋部皮下后為2 組，每組5 只裸鼠，以40 μL 陰性對(duì)照序列或si-circFBLIM1 進(jìn)行接種部位原位多點(diǎn)注射，1 次/4 d；記錄觀察裸鼠的一般情況、移植瘤形成的時(shí)間及大??；每4 天用游標(biāo)卡尺測(cè)移植瘤最長徑（L）和最短徑（W），連續(xù)測(cè)量28 d，繪制移植瘤生長曲線；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將腫瘤完整剝離并進(jìn)行大體照相，測(cè)量腫瘤體積及質(zhì)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分別使用t檢驗(yàn)、One-way ANOVA進(jìn)行各組之間的差異分析。所有數(shù)據(jù)顯示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 干擾效果檢測(cè)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-circFBLIM1后，HepG2、7402和97H細(xì)胞中的circFBLIM1的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，與各自轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列的同種細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）（圖1）。

圖1 si-circFBLIM 在3 種HCC 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)Figure 1 Determination of the transfection efficiency of sicircFBLIM in the three different HCC cells

2.2 下調(diào)circFBLIM1 對(duì)HCC 細(xì)胞增殖的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染si-circFBLIM1后，3種HCC細(xì)胞的增殖能力均明顯減弱，在450 nm處的OD值在轉(zhuǎn)染后3、4、5 d明顯均較各自陰性對(duì)照組明顯降低（均P＜0.01）（圖2）。

2.3 下調(diào)circFBLIM1 對(duì)HCC 細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-circFBLIM1后，細(xì)胞穿過Transwell膜的數(shù)目與各自陰性對(duì)照組比較均明顯減少（均P＜0.01）（圖3）。

2.4 下調(diào)circFBLIM1 對(duì)HCC 細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長的影響

皮下注射裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，通過連續(xù)28 d的觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用si-circFBLIM1下調(diào)HepG2細(xì)胞中circFBLIM1的表達(dá)水平之后，HCC在裸鼠體內(nèi)的生長速度明顯減慢，腫瘤體積與質(zhì)量明顯降低，與陰性對(duì)照組有明顯差異（均P＜0.01）（圖4）。

圖2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCC 細(xì)胞增殖Figure 2 Proliferation of HCC cells detected by CCK-8 assay

圖3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCC 細(xì)胞的侵襲能力（×200）Figure 3 Invasion ability measured by Transwell assay (×200)

圖4 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) Figure 4 Nude mouse tumor transplantation mode

3 討 論

circFBLIM1即hsa_circ_0010090（chr1：16084668-16113084），其來源于FBLIM1基因（1p36.21）。通過調(diào)研文獻(xiàn)，circFBLIM1的生物學(xué)功能到目前為止尚未見報(bào)道。為了初步評(píng)估circFBLIM1在HCC中的生物學(xué)功能，本研究通過轉(zhuǎn)染si-circFBLIM1的方式來下調(diào)HCC細(xì)胞系（HepG2、7402和97H）中circFBLIM1的表達(dá)。通過CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在HCC細(xì)胞中下調(diào)circFBLIM1的表達(dá)，能夠顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖能力。后續(xù)的Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過抑制circFBLIM1的表達(dá)能夠使得HCC細(xì)胞系穿過Transwell膜的能力大大下降，提示侵襲能力受到抑制。在皮下注射裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，通過向10只BALB/c裸鼠皮下注射HepG2細(xì)胞，并瘤內(nèi)注射陰性對(duì)照序列或si-circFBLIM1進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘤內(nèi)注射si-circFBLIM1后，腫瘤體積顯著縮小，此項(xiàng)結(jié)果提示，下調(diào)circFBLIM1能顯著減慢HCC體內(nèi)腫瘤生長速度。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)circFBLIM1能抑制HCC細(xì)胞增殖、侵襲、促進(jìn)凋亡，在體內(nèi)抑制腫瘤生長，進(jìn)一步從反向證明了中circFBLIM1在HCC中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲的作用。

文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道，HCC組織中circMTO1的減少可以作為患者生存率低的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。Lin等[15]報(bào)道在各種HCC 細(xì)胞系和HCC 患者的組織樣品中，circCDK13表達(dá)受到抑制。在HCC細(xì)胞中誘導(dǎo)的circCDK13過表達(dá)顯著抑制了它們的遷移速率，改變了細(xì)胞周期進(jìn)程，并抑制了細(xì)胞遷移和侵襲能力。微陣列分析還鑒定了由circCDK13調(diào)節(jié)的許多下游基因，特別JAK/STAT以及PI3K/Akt信號(hào)通路。致瘤性測(cè)定的結(jié)果顯示，circCDK 13過表達(dá)顯著抑制裸鼠的HCC進(jìn)展。Qin等[16]研究發(fā)現(xiàn)，基于89對(duì)HCC組織和鄰近肝組織樣本的分析，hsa_circ_0001649表達(dá)在HCC組織中顯著下調(diào)（P=0.0014），并且ROC曲線下面積（AUC）為0.63。此外，hsa_circ_0001649表達(dá)與HCC中腫瘤大小（P=0.045）和瘤栓的發(fā)生（P=0.017）密切相關(guān)。

近來，隨著生物信息學(xué)以及RNA 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究者逐漸認(rèn)識(shí)到circRNA在生命科學(xué)當(dāng)中的重要作用。據(jù)報(bào)道，RNA 可以作為競(jìng)爭性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA，ce RNA），通過競(jìng)爭共有的miRNA 而互相調(diào)節(jié)[17-18]。circ RNA 主要存在于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，具有比一般的ce RNA 更多更穩(wěn)定的miRNA 應(yīng)答元件（MRE），因此circ RNA 能夠更有效的結(jié)合miRNA，成為miRNA海綿，作為ceRNA發(fā)揮作用，通過自身的MRE 競(jìng)爭結(jié)合miRNA，調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，最終影響其功能[19]。譬如過表達(dá)CDR1as能夠有效地“吸附”miR-7，從而下調(diào)miR-7，導(dǎo)致miR-7靶標(biāo)的表達(dá)水平升高[20-21]。Zheng 等[22]證實(shí)circ HIPK3 通過充當(dāng)海綿“吸附”miR-124等miRNA，從而抑制腫瘤的增殖。Hansen等[23]發(fā)現(xiàn)circRNA Sry可充當(dāng)miR-138的海綿。Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)來自FOXO3的cir cRNA hsa_circR NA_104170，通過吸附miR-22等一系列miRNA，抑制乳腺癌的細(xì)胞增殖及腫瘤血管生成。這些研究結(jié)果表明：circRNA在多種腫瘤中差異表達(dá)，可作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，通過miRNA海綿的作用，影響腫瘤的多種生物學(xué)行為，發(fā)揮重要的調(diào)控功能。

目前，circRNA在HCC中研究仍處于起步階段，對(duì)其在HCC的功能了解甚少，而機(jī)制的研究更為缺乏。本研究雖然初步觀察了circFBLIM1在HCC中的基本生物學(xué)作用，但對(duì)其作用機(jī)制仍未做深入研究。筆者推測(cè)circFBLIM1也可能通過充當(dāng)海綿“吸附”miRNA，進(jìn)而通過ceRNA機(jī)制調(diào)節(jié)miRNA靶基因的表達(dá)參與HCC的發(fā)生與發(fā)展。因此，本研究后續(xù)將通過各種生物信息學(xué)方法與不同分子生物學(xué)手段預(yù)測(cè)并查明circFBLIM1的靶miRNA，并進(jìn)一步構(gòu)建全面的circFBLIM1相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)探明circFBLIM1在HCC中的功能及作用機(jī)制。

總之，本研究基于前期發(fā)現(xiàn)circ FBLIM1 在HCC 中的高表達(dá)，初步證明circ FBLIM1 能促進(jìn)HCC 細(xì)胞的增殖與侵襲，在HCC 中發(fā)揮促瘤作用。circFBLIM1可能作為HCC診斷治療中的新的生物標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)。