百合莖尖培養(yǎng)材料的篩選及其組培配方的優(yōu)化

吳青青， 王維澤， 崔 嵬， 石樂娟， 李正麗，文林宏

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所/貴州省園藝工程技術(shù)研究中心， 貴州 貴陽 550009)

百合(Liliumspp.)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生球根花卉，其花朵典雅對(duì)稱，花色艷麗多變，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，是當(dāng)前世界花卉市場的主流切花產(chǎn)品之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3]。世界范圍內(nèi)百合相關(guān)行業(yè)已經(jīng)形成了龐大而復(fù)雜的產(chǎn)業(yè)鏈，荷蘭依靠其在種質(zhì)資源創(chuàng)新、雜交育種、商品球生產(chǎn)繁育等上游領(lǐng)域的壟斷性技術(shù)、資源優(yōu)勢，獲得了可觀的經(jīng)濟(jì)利益。我國目前使用的切花百合種球主要從荷蘭進(jìn)口，每年進(jìn)口數(shù)量超過3億粒，并且呈逐年快速增加趨勢[4-10]。隨著進(jìn)口種球的輸入，大量百合病毒病也被傳播到中國，以車前草花葉病毒(Plantagoasiaticamosaicvirus,PLAMV)為例，此病毒2010年被荷蘭報(bào)道在百合上發(fā)現(xiàn)侵染，隨后即在美國、中國臺(tái)灣等地檢出，2018年對(duì)北京40個(gè)百合樣品進(jìn)行PLAMV檢測，檢出率為12.5%。在荷蘭，車前草花葉病毒已經(jīng)成為侵染百合種球的主要病毒病之一[11]。

目前，我國的切花百合病毒病發(fā)病率越來越高，1代球情況較好，2代球、3代球病毒病發(fā)病率高達(dá)80%，已成為提高百合切花品質(zhì)、產(chǎn)量的重要障礙。最為嚴(yán)重的是種球國產(chǎn)化領(lǐng)域，由于未能很好地解決病毒病問題，已經(jīng)嚴(yán)重制約了百合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[12-13]?？刂撇《静〉膫鞑ツ壳白钣行У淖龇ㄊ欠N苗脫毒，較為常用的脫毒方法有莖尖培養(yǎng)、抗病毒藥劑處理、愈傷組織脫毒及熱處理等。莖尖培養(yǎng)是利用頂端分生組織來獲得再生植株，由于頂端分生組織無毒，所以莖尖培養(yǎng)經(jīng)常被用于種苗脫毒，是一種簡單、廉價(jià)、有效的脫毒方式[14-18]。為緩解百合病毒病發(fā)病率越來越高的現(xiàn)狀，筆者等通過比較不同來源的培養(yǎng)材料，篩選適宜百合莖尖培養(yǎng)的種源及其適宜的組培配方，旨在深入掌握百合莖尖脫毒技術(shù)，為百合脫毒苗的大批量生產(chǎn)提供技術(shù)支撐，以提高百合的品質(zhì)與產(chǎn)量。

1材料與方法

1.1材料

供試品種為東方百合品種卡瓦娜(Corvara)，供試材料為卡瓦娜不同處理的組培苗與種球共3組材料。A組，未經(jīng)處理的組培苗；B組，經(jīng)過4℃低溫處理40 d后打破休眠的組培苗；C組，商品球，經(jīng)低溫處理后直接栽種于基質(zhì)中。供試材料均由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供。

1.2方法

1.2.1適宜莖尖培養(yǎng)種源的篩選A、B組百合組培苗，去除外部鱗片直到裸露出內(nèi)部嫩葉，在體視鏡下使用刀片與解剖針將嫩葉剝?nèi)?，觀察莖尖。C組百合商品球，芽從基質(zhì)長出后，地上部分長至10 cm左右時(shí)將芽切斷，剝?nèi)ツ廴~，將莖尖置于體視鏡觀察。通過對(duì)生長點(diǎn)與葉原基的觀察與判斷，篩選適宜脫毒莖尖培養(yǎng)的種源。

1.2.2百合莖尖培養(yǎng)基激素組合篩選使用適宜莖尖培養(yǎng)的B、C組材料進(jìn)行試驗(yàn)。切0.3～0.5 mm的莖尖置于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。以6-BA的3個(gè)濃度水平(0.5 mg/L、1.0 mg/L和1.5 mg/L)和NAA的2個(gè)濃度水平(0.25 mg/L和0.5 mg/L)進(jìn)行6個(gè)培養(yǎng)基配方組合，配制培養(yǎng)基為：MS+6-BA+NAA+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH5.8，培養(yǎng)90 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。B、C組材料各接種5個(gè)莖尖，3次重復(fù)。通過比較分析不同處理的培養(yǎng)效果，篩選適宜百合莖尖培養(yǎng)的培養(yǎng)基激素組合。

1.2.3培養(yǎng)基糖濃度的篩選由于60 g/L的蔗糖濃度在百合組培中有利于不定芽的生長，故以1.2.2篩選出的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)配方(蔗糖30 g/L，CK)，提高蔗糖濃度至60 g/L，對(duì)C組材料莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)基各接種5個(gè)莖尖，3次重復(fù)。通過比較分析不同蔗糖濃度(蔗糖30 g/L與60 g/L)處理的培養(yǎng)效果，篩選適宜百合莖尖培養(yǎng)的培養(yǎng)基糖濃度。

2結(jié)果與分析

2.1適宜脫毒莖尖培養(yǎng)的百合種源選擇

2.1.1A組材料的莖尖生長情況對(duì)A組培苗進(jìn)行莖尖觀察可知，其小種球直徑在1 cm左右，撥開層層鱗片后，觀察到靠近基盤位置的小芽(圖1)，其外部被嫩葉包裹，長度為2.5 mm。撥開嫩葉后可見生長點(diǎn)位于底部基盤上，呈圓錐形，生長點(diǎn)的高度為0.2 mm左右，重復(fù)剝開幾個(gè)小球莖進(jìn)行觀察，總體情況差別不大。從生長點(diǎn)情況看，未見葉原基等其他結(jié)構(gòu)，可能這些分生組織尚不具備立刻發(fā)育成莖的能力，結(jié)合百合自身特點(diǎn)，推測這些百合鱗莖處于休眠狀態(tài)。因?yàn)榘俸蠈?duì)溫度敏感，在20℃以上的組培室中長時(shí)間生長會(huì)越來越趨向休眠狀態(tài)，其底部基盤上不斷分生出新的鱗片，但是其莖尖生長點(diǎn)不會(huì)向上生長。從A組莖尖的實(shí)際情況看，未經(jīng)處理的組培苗不適宜作為莖尖培養(yǎng)的材料使用。

2.1.2B組材料的莖尖生長情況對(duì)經(jīng)低溫處理的組培苗進(jìn)行觀察，剝開鱗片后可看到2種情況。

1) 生長點(diǎn)與葉原基生長好，芽結(jié)構(gòu)完整。小種球內(nèi)的莖已經(jīng)開始萌發(fā)伸長，嫩葉層層分布，其莖尖位置明顯，頂端為嫩葉包裹的生長點(diǎn)，去掉嫩葉后即可見生長點(diǎn)與葉原基，芽結(jié)構(gòu)完整，頂端生長點(diǎn)活動(dòng)旺盛(圖2)。說明，部分經(jīng)低溫處理的百合組培苗適宜進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，此類材料占總數(shù)的33.3%。

注：a,包裹生長點(diǎn)的嫩葉;b,生長點(diǎn)俯視圖;c,生長點(diǎn)側(cè)視圖。

Note: a, tender leaves wrapped around the growing point; b, top view of the growing point; c, side view of the growing point.

圖1A組材料的莖尖觀察

Fig.1 Observation on stem tip of Group A

注： a,伸長的莖尖; b, 包裹生長點(diǎn)的嫩葉; c,莖尖。

Note: a, elongated stem tips; b, tender leaves wrapped around growing points; c, stem tips.

圖2B組材料的莖尖觀察(有葉原基的材料)

Fig.2 Shoot tip observation of group B materials (with leaf primordium)

2) 莖尖周圍未見葉原基。部分組培苗頂芽并未快速生長，葉片從鱗莖包裹的中心部位長出，剝開鱗片后露出新葉基部(圖3a)，去除葉片后露出柱狀莖尖(圖3b)，長度約1.8 mm，莖尖位置靠近基盤，類似于A組材料莖尖，只是長度有一定增加，說明其有一定的生長，莖尖周圍未見葉原基。通過觀察判斷，這類材料莖尖分生組織不活躍，不適宜進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，在進(jìn)一步試驗(yàn)中不采用此類材料。

注：a,新生嫩葉;b,裸露得莖尖;c,剝下的莖尖。

Note: a,newborn leaves; b, bare tips; c, peeled tips.

圖3B組材料的莖尖觀察(無葉原基的材料)

Fig.3 Stem tip observation of group B materials (without leaf primordium)

2.1.3C組材料的莖尖生長情況去除種球萌發(fā)出的芽上層層葉片，在體視鏡下觀察莖尖，可見最后一層小葉包裹的莖尖、生長點(diǎn)、葉原基等(圖4)。C組材料莖尖部位明顯且生長旺盛，莖尖剝離等操作難度低，說明經(jīng)低溫處理的百合商品球最適宜作為莖尖培養(yǎng)的材料。

注：a,剝開葉片的芽尖端; b,莖尖側(cè)視圖; c, 莖尖俯視圖。

Note: a, bud tip of peeled leaf; b. side view of the stem tip; c, top view of the stem tip.

圖4C組材料的莖尖觀察

Fig.4 Stem tip observation of group C materials

2.2適宜百合莖尖培養(yǎng)的培養(yǎng)基激素組合

2.2.1成活率從表1看出，B組材料中6-BA 1.0 mg/L和1.5 mg/L與NAA 0.50 mg/L組合的培養(yǎng)苗成活率最高，為53.3%；C組材料中，6-BA 1.5 mg/L與NAA 0.50 mg/L組合的培養(yǎng)苗成活率最高，為60%。說明高濃度的6-BA與NAA有利于提高莖尖培養(yǎng)的幼苗成活率。

2.2.2愈傷組織6-BA 1.5 mg/L與不同濃度NAA組合，均可獲得較多的愈傷組織(表1)，其中，B組材料中6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.50 mg/L獲得8個(gè)愈傷組織；其次是6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L組合，獲得6個(gè)愈傷組織；C組材料中，6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.50 mg/L獲得9個(gè)愈傷組織，其次是6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L組合，獲得8個(gè)愈傷組織。

2.2.3不定芽和成苗數(shù)從表1看出，在B組材料和C組材料中，均以6-BA 1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L組合獲得的不定芽數(shù)最多，均為8個(gè)；成苗數(shù)最高，均7株。從成活率與成苗數(shù)綜合看，6-BA 1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L組合配制的培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8)培養(yǎng)效果最好，可以用于下一步試驗(yàn)。

表1 不同濃度激素培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果

2.3培養(yǎng)基適宜的糖濃度

在組織培養(yǎng)中，蔗糖作為培養(yǎng)基中碳與能量的主要來源，為組培苗的生長提供基礎(chǔ)條件，多數(shù)情況下，適當(dāng)提高蔗糖濃度能夠促進(jìn)植株的生長與發(fā)育。從表2看出，蔗糖濃度30 g/L的培養(yǎng)基對(duì)莖尖培養(yǎng)的效果略優(yōu)于蔗糖濃度60 g/L的培養(yǎng)基。說明，較高的糖濃度未表現(xiàn)出對(duì)百合莖尖生長的促進(jìn)作用，甚至弱于低濃度配方，從實(shí)際效果看，蔗糖濃度30 g/L更適合百合莖尖培養(yǎng)。因此，百合莖尖培養(yǎng)適宜的組培配方為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8。

表2不同糖濃度培養(yǎng)基效果比較

Table 2 Effects comparison of media with different sugar concentration

蔗糖濃度/(g/L)Sucrose concentration成活率/%Survival rate愈傷組織總數(shù)/個(gè)Total number of callus obtained不定芽總數(shù)/個(gè)Total number of adventitious buds成苗數(shù)/株Number of seedlings30 46.7 07760 33.3 055

3結(jié)論與討論

研究表明，百合未經(jīng)處理的組培苗、經(jīng)低溫處理的組培苗和商品球3組材料中，適宜進(jìn)行莖尖培養(yǎng)的種源是經(jīng)低溫處理的組培苗和商品球，尤以經(jīng)低溫處理的商品球培養(yǎng)效果最佳。通過不同濃度激素和蔗糖組配試驗(yàn)得到百合莖尖培養(yǎng)的適宜激素組合及蔗糖濃度，即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L(pH 5.8)為百合莖尖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。

莖尖培養(yǎng)是病毒病脫除中最常見的方法，具有成本低廉、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前在百合脫毒方面，為了保證脫毒效果，通常都是幾種脫毒方法結(jié)合使用，比如采用熱處理+莖尖培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)+病毒唑處理等?？傮w來看，其脫毒的核心是通過無毒莖尖來獲得脫毒苗。莖尖脫毒的原理源自于莖尖分生組織無毒，其主要障礙在于莖尖生長點(diǎn)太小，其厚度不超過0.1 mm，因此難以獲得且培養(yǎng)難度大，通常進(jìn)行的莖尖培養(yǎng)為了方便操作都是切取頂端生長點(diǎn)與葉原基一起培養(yǎng)，這樣可能造成材料依然帶毒。綜合看，通過徹底的頂端生長點(diǎn)培養(yǎng)可以完全解決問題，所以可以嘗試進(jìn)一步研究。

研究在培養(yǎng)基中添加了活性炭，因?yàn)樵诎俸辖M織培養(yǎng)中活性炭在預(yù)防褐化等方面確實(shí)有一定的作用，但是其缺陷是容易造成組培苗生長緩慢，因此，在培養(yǎng)基中添加活性炭還需再斟酌。