馬鼻肺炎雙重熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

林志雄，魚海瓊，王 瑩，佟鐵鑄，溫肖會，張 利，翟建新

（1.廣州海關檢驗檢疫技術中心/廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640；3.深圳澳東檢驗檢測科技有限公司，廣東 深圳 518000）

【研究意義】馬鼻肺炎是描述馬屬動物呼吸道病、流產(chǎn)、新生駒肺炎或腦脊髓炎等幾種疾病的總稱，在全世界分布廣泛。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫?。?］，我國農(nóng)業(yè)部也將馬鼻肺炎列為二類動物傳染病，國家質量監(jiān)督檢驗檢疫局與其他國家簽訂的檢疫條款也將其列為出入境馬屬動物檢驗檢疫的疫病之一［2］。馬皰疹病毒1型（Equine herpesvirus，EHV1）和馬皰疹病毒4型（Equine herpesvirus，EHV4）是引起馬鼻肺炎的主要病原。EHV1是馬呼吸道疾病、病毒性流產(chǎn)的主要病因［3］，EHV4主要引起急性呼吸道感染［4］，從致病性來看，區(qū)分EHV1與EHV4意義重大。【前人研究進展】馬鼻肺炎的診斷一般采用病毒分離培養(yǎng)、血清學檢測、核酸檢測［5］。由于EHV1與EHV4之間存在嚴重的血清交叉反應，目前我國還沒有從血清學角度區(qū)分EHV1與EHV4的標準方法［6］，以PCR與熒光定量PCR為代表的核酸檢測，對樣品有較好的生物安全性，適合于早期檢測［7］。ELISA檢測方法靈敏度高，但操作復雜，不適合快速篩查?！颈狙芯壳腥朦c】相對于上述幾種檢測方法，實時熒光PCR（real-time PCR）檢測速度快、靈敏度高、特異性強［8］，與傳統(tǒng)PCR相比具有省時、高效、成本低等優(yōu)勢，且結果易于觀察?！緮M解決的關鍵問題】通過設計特異性引物和探針、優(yōu)化反應條件等手段，建立一種靈敏、特異、快速的雙重real-time PCR檢測方法，對EHV1與EHV4進行快速檢測和分型確認。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 毒株和標本 選擇EHV1和EHV4陽性標本各5份，馬流感病毒（EIV）、馬動脈炎病毒（EAV）、馬日本腦炎病毒（EVJ）和馬傳染性貧血病毒（EIAV）陽性標本各5份，臨床采集馬鼻咽喉拭子共64份。由于試驗所用的病毒株涉及保存條件要求和樣本信息保密性，故病毒株測試實驗和臨床樣本測試實驗主要在廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室完成。

1.1.2 主要試劑及儀器 病毒核酸提取試劑購自凱杰生物工程（深圳）有限公司（QIAGEN），熒光PCR試劑購自美國VitaNavi Technology 公司，pMD-18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司，探針引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，7500型熒光定量PCR儀購自美國應用生物系統(tǒng)（ABI）公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計和篩選 分別下載GenBank報道的不同國家和地區(qū)的EHV1和EHV4基因序列，進行核苷酸序列同源性比對，根據(jù)比對結果將比較保守的糖蛋白B區(qū)（gB）基因作為擴增序列，根據(jù)熒光定量PCR引物和探針設計原則，使用primer5.0軟件分別對EHV1和EHV4設計多套引物和探針，并對設計出的引物進行序列比對分析和特殊結構分析，再根據(jù)試驗結果對幾套引物探針和擴增程序進行篩選，最終選擇1套最佳引物探針，并確定引物探針間的最佳比例。引物探針序列信息見表1。

1.2.2 陽性質粒制備 通過比對EHV1和EHV4參考毒株，擴增含有gB序列的基因片段，PCR產(chǎn)物回收后與 Peasy-T3載體連接構建成重組質粒，轉化DH5a感受態(tài)細胞，通過氨芐藍白斑篩選轉化成功的菌株［9］，測序鑒定目的片段，提取質粒制備陽性對照。

1.2.3 病毒核酸提取 EHV1和EHV4 DNA提取選擇QIAGEN公司的DNA提取試劑盒，EIV、EAV、EVJ和EIAV RNA提取選擇QIAGEN公司的RNA提取試劑盒，病毒核酸提取按照試劑盒說明書進行操作。對EIV、EAV、EVJ和EIAV標準毒株的RNA進行反轉錄獲得cDNA，所有核酸-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 real-time PCR反應體系的建立和優(yōu)化 根據(jù)Vitanavi Technology公司PCR試劑盒設定real-time PCR的基本反應體系25 μL。設定基本反應條件為：50 ℃ 15 min；95℃ 15 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，45個循環(huán)；40 ℃ 20 s；退火時采集熒光信號。摸索各組分對EHV1和EHV4標準毒株擴增的影響，設置了Mg2+濃度（2、3、4、5、6mmol/L）、dNTP濃度（0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L）、引物和探針的比例（1∶1、1.5∶1、2∶1）和退火溫度（52、55、60 ℃），分別以EHV1和EHV4標準毒株的混合核酸為模板，根據(jù)試驗結果選擇最佳反應體系和擴增條件。

1.2.5 敏感性試驗 分別對EHV1和EHV4陽性對照進行10倍稀釋，共稀釋10個梯度，每個梯度5次重復，進行real-time PCR檢測，確定EHV1和EHV4檢測濃度的最低限以及分析方法的靈敏性。

1.2.6 特異性試驗 用建立的real-time PCR方法分別對5份EHV1、5份EHV4標準毒株和逆轉錄后的EIV、EAV、EVJ和EIAV標準毒株（各5份）的cDNA進行檢測，驗證該方法的特異性。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗 分別以1.47×105copies/μL的EHV1和EHV4陽性對照為模板，3次重復，記錄Ct值，計算標準差（S）和變異系數(shù)（CV），驗證該方法的穩(wěn)定性。將上述3管樣本保存于-20℃保存4 d和7 d后重復檢測，記錄Ct值，計算標準差（S）和變異系數(shù)（CV）以驗證該陽性對照的穩(wěn)定性和重復性。

1.2.8 臨床樣本檢測 對已有的64份臨床樣本分別用本研究建立的EHV1/EHV4 real-time PCR、常規(guī)PCR和病毒分離方法同時進行檢測，比較3種方法結果的符合率。

2 結果與分析

2.1 gB基因擴增及標準品制備

應用設計的EHV引物進行常規(guī)PCR擴增，結果（圖1）顯示，從EHV中擴增到850 bp的gB基因特異性片段。產(chǎn)物回收后構建成重組質粒并轉化至DH5a感受態(tài)細胞，細菌培養(yǎng)后提取重組質粒進行核苷酸序列測定，測序結果與原始序列片段的同源性為99.8%，表明構建重組質粒成功。抽提質粒DNA，經(jīng)超微核酸蛋白濃度儀測定，OD260/OD280=1.92，質粒濃度為 1.373 μg/μL，根據(jù)公式換算的拷貝數(shù)為1.47×109copies/μL。

圖 1 gB基因擴增結果Fig.1 Amplification result of gB gene

2.2 Real-time PCR方法的建立

2.2.1 Real-time PCR反應體系的建立和優(yōu)化 通過對Mg2+濃度、dNTP濃度、引物和探針的比例進行優(yōu)化，結果表明，Mg2+濃度為4 mmol/L，dNTP濃度為0.4 mmol/L，引物探針比例為2∶1，退火溫度為55℃時，擴增效果最佳，重復性好。最佳體系擴增效果見圖2。

圖2 EHV1、EHV4實時熒光PCR檢測結果Fig.2 Results of duplex real-time PCR of EHV1 and EHV4

2.2.2 敏感性試驗 對陽性對照進行10個濃度梯度稀釋，圖3所示藍色為EHV1擴增曲線，紅色為EHV4擴增曲線，均出現(xiàn)7個稀釋梯度擴增曲線；質?？截悢?shù)為1.47×102copies/μL時，均能檢測到特異性擴增；當質?？截悢?shù)為1.47×101copies/μL時，則不能檢測到特異性擴增，陰性對照也不能檢測到擴增曲線。因此樣本的最小檢測濃度為1.47×102copies/μL。擴增線性方程為：Ct=20.907-3.214 LogC，擴增效率E為104.687%，相關系數(shù)r2=1，證實擴增指標正常。

圖3 EHV1、EHV4 雙重實時熒光 PCR敏感性檢測結果Fig.3 Sensitivity detection of EHV1 and EHV 4 by using duplex real-time PCR

2.2.3 特異性實驗 采用本研究建立的EHV1、EHV4 real-time PCR方法分別對EHV1、EHV4、EIV、EAV、EVJ和EIAV各5份標準毒株進行檢測，結果（圖4）只有EHV1、EHV4出現(xiàn)特異性擴增，其他病毒未出現(xiàn)擴增。

圖4 EHV1、EHV4 雙重實時熒光PCR特異性檢測結果Fig.4 Specific detection of EHV1 and EHV 4 by using duplex real-time PCR

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 批內重復性試驗中，相同濃度樣本，檢測結果見表2，EHV1批內變異系數(shù)為1.68%，EHV4批內變異數(shù)為2.04%。批間重復性試驗中，相同模板不同檢測時間結果見表3，EHV1批間變異系數(shù)為2.10%，EHV4批間變異數(shù)為2.08%。批間和批內重復性試驗中Ct值變異系數(shù)均小于3%，表明該方法重復性良好，能夠滿足實際檢測的要求。

表2 批內重復性試驗結果Table 2 Result of Intra-assay repetitive experiment

表3 批間重復性試驗結果Table 3 Result of Inter-assay repetitive experiment

2.2.5 臨床樣本檢測 本研究建立的real-time PCR方法以Ct值＜35并且擴增曲線呈“S”型為陽性判定標準。若Ct值＜35且擴增曲線良好可直接判定為陽性；Ct值在35～38之間需重復試驗，2次試驗均能得到良好“S”型擴增曲線方可判定為陽性；Ct值＞38判定為陰性。對臨床樣本進行常規(guī)PCR、real-time PCR和病毒分離，結果顯示，64份臨床樣本中，常規(guī)PCR檢出率為9.38%（6/64）、real-time PCR檢出率為14.06%（9/64）、病毒分離陽性率為14.06%（9/64）。證實realtime PCR比常規(guī)PCR檢測靈敏度更高。

3 討論

EHV1和EHV4引起的馬鼻肺炎可導致妊娠馬流產(chǎn)、胎兒死亡等傳染性疾病，是影響我國養(yǎng)馬業(yè)健康發(fā)展的巨大威脅，建立快速、準確的檢測方法對 EHV1、EHV4 的鑒別診斷和流行病學調查具有重要意義［10］。SYBR Green染料的熒光定量 PCR 方法是目前采用的快速檢測方法之一，鑒于SYBR Green 熒光染料的特異性欠佳，該方法對引物的設計要求很高：引物設計中不可出現(xiàn)反向重復序列和發(fā)夾結構，引物避免形成二聚體，更不能與模板發(fā)生錯配擴增等［11］。特異性篩選實驗既要保證引物的特異性，又要保證引物的各項參數(shù)符合熒光定量PCR 反應的要求［12］。因此，設計常規(guī)引物，建立成熟的SYBR Green 染料的熒光定量 PCR 方法有一定的挑戰(zhàn)性。

為避免因常規(guī)引物特異性差造成檢測結果假陽性等不利因素［13］，本研究設計了具有強特異性的引物和探針，并建立了檢測EHV1、EHV4的雙重熒光定量 PCR 方法。該方法可在1 h內分別檢測EHV1與EHV4，從而達到在同一反應體系內對EHV進行分型的要求。在設計引物過程中，我們選取gB基因中GC含量較高的區(qū)域，提高引物Tm值，從而有效防止引物二聚體的產(chǎn)生，并高概率地減少了非特異性擴增。

4 結論

本研究建立的雙重熒光定量PCR的檢測方法對EHV1與EHV4有特異性檢出，且與其他幾種馬屬動物易感病毒 （EIV、EAV、EIAV及EVJ）無交叉反應。該方法最低檢出限為1.47×102copies/μL，可用于檢測目的基因拷貝數(shù)較低的樣品，實際應用前景廣闊。