響應(yīng)面分析結(jié)冷膠發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

周龍海

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237）

結(jié)冷膠是用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)的胞外多糖膠質(zhì)膠凝劑，具有增稠、懸浮、乳化、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是性能優(yōu)越的食品膠之一，廣泛應(yīng)用于制藥、食品、化妝品和化工等行業(yè)中。而發(fā)酵培養(yǎng)基是結(jié)冷膠生產(chǎn)的重要前提，結(jié)冷膠培養(yǎng)基的主要成分包括碳源、氮源、無機(jī)鹽和其他營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。其中，碳源可使用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉等，氮源可使用蛋白胨、玉米粉、大豆油胨、酵母粉、硝酸銨等，無機(jī)鹽包括磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鉀，其他營養(yǎng)物質(zhì)為表面活性劑吐溫等。研究表明，篩選出的不同菌株對最佳的碳源、氮源均不同，楊冬月，吳軍林等人[3-4]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)冷膠培養(yǎng)基的最佳碳源是蔗糖，而胡桂萍等人[5]發(fā)現(xiàn)結(jié)冷膠培養(yǎng)基最佳碳源為葡萄糖，牛永利等人[6]發(fā)現(xiàn)最佳碳源為可行性淀粉，李海軍等人[2]發(fā)現(xiàn)結(jié)冷膠培養(yǎng)基最佳氮源為大豆油胨，而文春溪等人[7]發(fā)現(xiàn)最佳氮源為酵母粉。試驗(yàn)篩選出1株產(chǎn)量較高的菌株，為了更好地提高其生產(chǎn)強(qiáng)度，以結(jié)冷膠發(fā)酵液的黏度和產(chǎn)膠率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)選擇最佳的碳源、氮源和無機(jī)鹽，并確定添加量，選擇合適的水平和因素；通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定培養(yǎng)基的最佳添加量，建立發(fā)酵培養(yǎng)基模型，并對模型進(jìn)行驗(yàn)證，最后得到最佳培養(yǎng)基成分，對結(jié)冷膠的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，編號為Sphingomonas paucimobilis NK2000。

1.2 材料

培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機(jī)鹽均為市售產(chǎn)品，分析純。

1.3 測定方法

（1）表觀黏度。發(fā)酵液直接測定，采用NDJ21型，轉(zhuǎn)子黏度計(jì)，溫度28℃，3號轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速60 r/min。

（2）粗多糖轉(zhuǎn)化率及粗多糖含量測定。20～50 g發(fā)酵液加1倍體積95%乙醇沉淀產(chǎn)物，收集沉淀，加同體積95%乙醇洗滌沉淀2次，再收集沉淀，于70℃條件下烘干2 h，稱質(zhì)量（粗多糖質(zhì)量），再按下式計(jì)算：

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 碳源的選擇

選擇最有可能是最佳碳源的試驗(yàn)用糖（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖）按3%的添加量，氮源和無機(jī)鹽不變進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得出最后發(fā)酵液的黏度和產(chǎn)膠率，每個試驗(yàn)做3個平行樣。

1.4.2 碳源添加量的優(yōu)化

選擇葡萄糖作為碳源，添加量分別設(shè)定為2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，其他成分不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，60 h后測得發(fā)酵液黏度和產(chǎn)膠率。

1.4.3 氮源的選擇

選擇最有可能是最佳氮源的試驗(yàn)用氮（牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、豆餅粉、硝酸銨）按0.5%的添加量，碳源和無機(jī)鹽不變，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得出最后發(fā)酵液的黏度和產(chǎn)膠率，每個試驗(yàn)做3個平行樣。

1.4.4 氮源添加量的優(yōu)化

選擇酵母粉作為氮源，添加量分別設(shè)定為0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，其他成分不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，60 h后測得發(fā)酵液黏度和產(chǎn)膠率。

1.4.5 無機(jī)鹽的選擇

選擇最有可能是最佳無機(jī)鹽（硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、氯化錳和硫酸亞鐵）按0.1%添加量，碳源和氮源不變，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得出最后發(fā)酵液的黏度和產(chǎn)膠率，每個試驗(yàn)做3個平行樣。

1.4.6 無機(jī)鹽添加量的優(yōu)化

選擇1.4.5產(chǎn)膠率最高的作為無機(jī)鹽，添加量分別設(shè)定為0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.12%，0.14%，0.16%，其他成分不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，60 h后測得發(fā)酵液黏度和產(chǎn)膠率。

1.4.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)（Box-Behnken Design，BBD），對影響結(jié)冷膠發(fā)酵后產(chǎn)膠率的顯著影響因子（碳源、氮源、無機(jī)鹽）進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)合因素的效應(yīng)大小和試驗(yàn)中的實(shí)際情況，選擇試驗(yàn)水平的中心點(diǎn)，響應(yīng)值為產(chǎn)膠率[8]。

BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及代碼水平見表1。

表1 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及代碼水平

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對發(fā)酵的影響

不同碳源對發(fā)酵的影響見圖1。

圖1 不同碳源對發(fā)酵的影響

由圖1可知，當(dāng)葡萄糖作為碳源時，結(jié)冷膠的黏度和產(chǎn)膠率都最高，分別為4 600 cp和1.79%，蔗糖和麥芽糖其次，可溶性淀粉最低，因此將選擇葡萄糖作為最佳碳源。

選擇葡萄糖為碳源，以添加量為變量，設(shè)置1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%共6個梯度值，其他成分不變，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

葡萄糖添加量對發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 葡萄糖添加量對發(fā)酵的影響

由圖2可知，結(jié)冷膠的產(chǎn)膠率和黏度隨著葡萄糖量的增加而增加，當(dāng)葡萄糖添加量為3%時，結(jié)冷膠的黏度和產(chǎn)膠率達(dá)到最高，分別為4 800 cp和1.81%，之后隨著葡萄糖添加量增加，結(jié)冷膠的產(chǎn)膠率和黏度逐漸減少，這是因?yàn)槠咸烟潜壤^大，導(dǎo)致菌種生產(chǎn)迅速，反而抑制了次級代謝產(chǎn)物的生成。因此，最終確定最佳的葡萄糖添加量為3%。

2.2 氮源對發(fā)酵的影響

不同氮源對發(fā)酵的影響見圖3。

圖3 不同氮源對發(fā)酵的影響

由圖3可知，當(dāng)?shù)鞍纂俗鳛榈磿r，結(jié)冷膠的黏度和產(chǎn)膠率都最高，分別為4 700 cp和1.75%，酵母粉其次，硝酸銨最低，因此將選擇蛋白胨作為最佳氮源。

選擇蛋白胨為氮源，以添加量為變量，設(shè)置0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%共5個梯度值，其他成分不變，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

蛋白胨添加量對發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 蛋白胨添加量對發(fā)酵的影響

由圖4可知，結(jié)冷膠的產(chǎn)膠率和黏度隨著蛋白胨添加量的增加而增加，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.6%時，結(jié)冷膠的黏度和產(chǎn)膠率達(dá)到最高，分別為4 800 cp和1.72%，之后隨著蛋白胨添加量增加，結(jié)冷膠的產(chǎn)膠率和黏度逐漸減少，這是因?yàn)榈鞍纂颂砑颖壤^大，導(dǎo)致菌種生產(chǎn)迅速，反而抑制了次級代謝產(chǎn)物的生成。因此，最終確定最佳的蛋白胨添加量為0.6%。

2.3 無機(jī)鹽對發(fā)酵的影響

不同無機(jī)鹽對發(fā)酵的影響見圖5。

由圖5可知，當(dāng)無機(jī)鹽為硫酸鎂或者磷酸二氫鉀時結(jié)冷膠的產(chǎn)膠率和黏度都相對較高，產(chǎn)膠率分別達(dá)到1.76%和1.75%，黏度分別達(dá)到4 750 cp和4 700 cp。然后分別選擇硫酸鎂和磷酸二氫鉀作為無機(jī)鹽，以添加量為變量，其他成分不變，得到2條結(jié)冷膠產(chǎn)膠率曲線。

圖5 不同無機(jī)鹽對發(fā)酵的影響

無機(jī)鹽添加量對發(fā)酵的影響見圖6。

圖6 無機(jī)鹽添加量對發(fā)酵的影響

由圖6可知，硫酸鎂和磷酸二氫鉀的最佳添加量分別為0.06%和0.14%，產(chǎn)膠率分別為1.74%和1.76%。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取X1，X2，X3，X4進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，以產(chǎn)膠率為響應(yīng)值。

BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

采用Design Expert 10軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，由此可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)式，得到回歸方程式：

回歸模型方差分析見表3。

由表3可知，模型Pr＞F=0.000 1，說明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到了極顯著水平，模型的校正系數(shù)R=0.984 3，表明該方程擬合程度良好。模型的修正系數(shù)R2Adj=0.932 2，表明該模型較好地反映了各因素之間的關(guān)系。通過對回歸方程的方差分析得出，一次項(xiàng)X1，X2，X3，X4；二 次 項(xiàng)X12，X22，X32，X42和 交 互 項(xiàng)X1X2，X1X4，X2X4對產(chǎn)膠率的影響是顯著的，各試驗(yàn)因子對產(chǎn)膠率的影響為非線性關(guān)系。

試驗(yàn)因子交互作用對產(chǎn)膠率的影響見圖7。

由圖7可知，兩因素之間的影響呈拋物線型關(guān)系，且均有一個極大值點(diǎn)，變化趨勢為先增大后減小。通過求解回歸方程得到結(jié)冷膠培養(yǎng)基的最佳工藝是葡萄糖添加量3.235%，蛋白胨添加量0.5246%，硫酸鎂添加量0.06374%，磷酸二氫鉀添加量0.1463%，產(chǎn)膠率的預(yù)測值是1.781 3%?？紤]到實(shí)際操作，將試驗(yàn)的條件修改為葡萄糖添加量3.2%，蛋白胨添加量0.52%，硫酸鎂添加量0.064%，磷酸二氫鉀添加量0.15%。

表2 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

圖7 試驗(yàn)因子交互作用對產(chǎn)膠率的影響

在最佳組合條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，測定實(shí)際產(chǎn)膠率含量為1.74%，與預(yù)測值1.78%基本吻合，偏差較小，說明得到的回歸模型和實(shí)際情況擬合較好，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可行性。

3 結(jié)論

首先，通過對結(jié)冷膠培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機(jī)鹽進(jìn)行單因素優(yōu)化，最終確定最佳碳源為葡萄糖、氮源為蛋白胨、無機(jī)鹽為硫酸鎂和磷酸氫二鉀。其次，通過采用響應(yīng)面Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，確定了以葡萄糖添加量3.2%，蛋白胨添加量0.52%，硫酸鎂添加量0.064%，磷酸二氫鉀添加量0.15%的最優(yōu)培養(yǎng)基成分，并建立了結(jié)冷膠發(fā)酵培養(yǎng)基模型。最后，對模型進(jìn)行了驗(yàn)證，獲得產(chǎn)膠率為1.74%，說明模型能較好地預(yù)測產(chǎn)膠率的實(shí)際情況，具有較好的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。