基于離子液體雙水相萃取番茄中抗氧化酶研究

李夢(mèng)瑤　王書雅　謝云峰　黃蔚霞　翟晨　劉云國(guó)

摘要 基于 [C4mim] Cl/K2HPO4雙水相體系，建立了萃取分離番茄中5種抗氧化酶（CAT、POD、SOD、AAO、PPO）的新方法。以番茄中抗氧化酶的活性為指標(biāo)，研究了不同種類的離子液體和用量、K2HPO4的用量、體系pH及萃取時(shí)間等參數(shù)對(duì)番茄中抗氧化酶活性的影響，并與傳統(tǒng)的緩沖溶液法提取效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明：當(dāng)K2HPO4濃度為0.16 g/mL，[C4mim] Cl濃度為0.40 g/mL，pH為7.5，30 ℃ 200 r/min提取20 min時(shí)，提取的5種抗氧化酶活性比緩沖溶液法提取的酶活性高、穩(wěn)定性好且萃取時(shí)間縮短了10 min。該提取方法操作簡(jiǎn)單，且實(shí)現(xiàn)多種酶的同時(shí)、快速、高活性提取，為植物性農(nóng)產(chǎn)品的多酶快速提取提供了一種新的思路。

關(guān)鍵詞 離子液體;雙水相;抗氧化酶;萃取;酶活性

中圖分類號(hào) TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）17-0179-03

Abstract Based on the aqueous twophase system formed by ionic liquid chloro1butyl3methylimidazolium [C4mim]Cl and K2HPO4， a new method for extraction of five antioxidant enzymes（CAT， POD， SOD， AAO， PPO） from tomato was established. Taking the activity of antioxidant enzymes in tomato as the index， the effects of different kinds of ionic liquids， the amount of K2HPO4， the pH and the extraction time on the activities of antioxidant enzymes in tomato were studied. The results showed that the optimal condition was： K2HPO4 concentration was 0.16 g/mL， [C4mim] Cl concentration was 0.40 g/mL， pH 7.5， 30 ℃ 200 r/min for 20 min， time reduced by 10 min. The extraction method was simple in operation， and realized simultaneous， rapid and highactivity extraction of various enzymes， which provided a new idea for rapid extraction of multienzymes in plant agricultural products.

Key words Ionic liquid;Aqueous twophase;Antioxidant enzyme;Extraction;Enzyme activity

番茄（Lycopersicon esculentum）屬茄科茄屬，為草本植物，其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用途廣泛（生食、菜用及各種加工制品），是我國(guó)的主栽蔬菜[1]。番茄等果蔬采摘后，在后熟到衰老的過程中，其機(jī)體內(nèi)的活性氧和酶保護(hù)系統(tǒng)隨著果蔬的代謝活動(dòng)而發(fā)生變化[2-4]。其在貯藏運(yùn)輸?shù)倪^程中，由于呼吸代謝作用導(dǎo)致氧自由基含量、丙二醛（MDA）含量增加，激發(fā)抗氧化酶（過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、抗壞血酸氧化酶（AAO））等保護(hù)系統(tǒng)消除活性氧自由基等有害物質(zhì)，從而可以避免造成組織損傷、細(xì)胞衰老或死亡，同時(shí)延長(zhǎng)果蔬的貯藏期[4]。果蔬體內(nèi)抗氧化酶活性高低可以作為判定果實(shí)品質(zhì)劣變程度、貯藏貨架期以及成熟衰老的標(biāo)志[4-6]。目前，提取植物性農(nóng)產(chǎn)品抗氧化酶更多依賴于傳統(tǒng)的緩沖溶液法，該方法耗時(shí)長(zhǎng)、提取酶活性低、穩(wěn)定性較差。

離子液體（ionic liquid，ILs），作為一種新型的綠色溶劑，因具有不揮發(fā)、溶解性強(qiáng)等多種獨(dú)特的性質(zhì)，目前在分離萃取等領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[7]。離子液體雙水相體系是由親水性離子液體和無(wú)機(jī)鹽組成的兩相[8]。離子液體雙水相蒸氣壓極低，與有機(jī)溶劑萃取法相比不會(huì)因揮發(fā)而引發(fā)環(huán)境污染和威脅操作者健康等問題，體系的萃取分離條件溫和，能使絕大部分生物分子保持活性同時(shí)具備分相快、不易乳化、離子液體可循環(huán)使用等特性，是近年來(lái)出現(xiàn)的一種極有前途的新型分離技術(shù)[9-10]。目前，離子液體及離子液體雙水相體系被廣泛應(yīng)用于萃取分離重金屬離子[11-12]、生物活性物質(zhì)[13-15]、蛋白質(zhì)[16-18]、酶[19-21]等?；陔x子液體雙水相體系，陳靜等[20]成功地萃取了胰蛋白酶，并對(duì)其萃取機(jī)理進(jìn)行研究;曾穎等[21]萃取木瓜蛋白酶，并證明能保持較高的酶活力。目前，采用離子液體雙水相提取法對(duì)植物源農(nóng)產(chǎn)品中多種酶的同時(shí)、快速、高活性提取的研究較少。

筆者以親水性離子液體氯代1-丁基-3-甲基咪唑[C4mim] Cl和K2HPO4形成的雙水相體系對(duì)番茄中的抗氧化酶進(jìn)行萃取研究，以抗氧化酶的活性為指標(biāo)，考察了離子液體種類及濃度、萃取時(shí)間、無(wú)機(jī)鹽用量、體系pH、靜置時(shí)間對(duì)番茄中抗氧化酶活性的影響，并與傳統(tǒng)提取法相比較，提出了一種基于離子液體雙水相體系，實(shí)現(xiàn)多種抗氧化酶同時(shí)、快速、高效、高活性的萃取分離方法。

1 材料與方法

1.1 材料

過氧化氫酶（2 000 U/mg）購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司;磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、30%過氧化氫H2O2、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）均為分析純，購(gòu)自北京化工廠;氯代1-丁基-3-甲基咪唑（[C4mim]Cl），氯代1-乙基-3-甲基咪唑（[C2mim]Cl），四氟硼酸1-丁基-3-甲基咪唑（ [C4mim]PF4）均為分析純，購(gòu)自上海愛純生物有限公司。

1.2 儀器

Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）;渦旋混勻器（德國(guó)IKA公司）;紫外可見分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）;恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;PB-10型pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）;離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）;Synergy Mx酶標(biāo)儀（美國(guó) Bio-Tek公司）。

1.3 方法

1.3.1 離子液體雙水相萃取抗氧化酶。

準(zhǔn)確稱取一定量的離子液體和K2HPO4，加入到10 mL刻度比色管中，加水溶解，溶解完全觀察到體系分為上下兩相（圖1），上相富集離子液體，下相富集K2HPO4。用不同pH的緩沖溶液調(diào)節(jié)體系的酸堿度[22]，加入0.5 g研磨成漿的番茄泥，番茄位于兩相中間（圖2），于30 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩一定時(shí)間后靜置，取上清液進(jìn)行酶活性測(cè)定。

1.3.2 緩沖液法萃取分離抗氧化酶。

參考文獻(xiàn)[23]，基于緩沖溶液法對(duì)5種抗氧化酶進(jìn)行提取：取新鮮的番茄，洗凈晾干，于攪拌機(jī)中打碎10 min，再冰浴狀態(tài)下用研缽研磨至泥狀。分別配制pH 7.8的50 mmol/L PBS，緩沖溶液提取CAT、SOD、POD三種抗氧化酶和pH 6.0的50 mmol/L PBS緩沖液提取AAO、PPO兩種抗氧化酶，取4.5 mL酶提取液加入0.5 g研磨成漿的番茄泥，在4 ℃高速離心機(jī)中以 5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，取上清液放入4 ℃環(huán)境中待用。

1.3.3 抗氧化酶活性測(cè)定。

過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定：通過測(cè)定1 min內(nèi)H2O2在240 nm波長(zhǎng)下消耗量，可計(jì)算得CAT活性[24];抗壞血酸氧化酶（AAO）活性測(cè)定：通過測(cè)定AsA的氧化量，可計(jì)算得AAO活性;多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定：PPO 能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌，后者在 410 nm 有特征光吸收[23];過氧化物酶（POD）活性測(cè)定：采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[25];超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定：采用核黃素（NBT）法測(cè)定[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 離子液體種類和用量的選擇。

研究以CAT活性為考察指標(biāo)，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。將[C4mim]Cl、[C2mim]Cl及[C4mim]PF4與K2HPO4制備成相同濃度的雙水相體系，分別加入相同濃度的酶溶液進(jìn)行提取，通過檢測(cè)酶活性考察不同離子液體的提取效果。由圖3可知，[C4mim]Cl雙水相提取的酶活性最高，其次為[C2mim]Cl，[C4mim]PF4提取效果最差，因此選擇[C4mim]Cl作為雙水相體系中的離子液體。

制備濃度為0.26～0.47 g/mL的[C4mim]Cl離子液體雙水相體系，固定體系pH、提取時(shí)間以及K2HPO4的加入量，對(duì)離子液體的用量進(jìn)行考察。由圖4可知，在較低濃度時(shí)，酶的提取效果較差，隨離子液體濃度的提高，酶活性逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)0.40 g/mL時(shí)，提取效果最好，之后隨著離子液體濃度升高，酶活性逐漸降低，因此離子液體濃度應(yīng)控制在0.40 g/mL。

2.1.2 K2HPO4加入量的選擇。

隨著鹽量的增加，上下相體積比逐漸減小，鹽濃度過高或者過低，均不能形成雙水相。由此可知，無(wú)機(jī)鹽是雙水相體系成相的主要原因之一，控制鹽濃度為0.10～0.24 g/mL，保持pH不變，對(duì)CAT活性進(jìn)行測(cè)試。由圖5可知，隨著鹽濃度的增大，提取效果逐漸提高，在0.16 g/mL時(shí)達(dá)到最大。隨著無(wú)機(jī)鹽濃度增大，鹽析作用加強(qiáng)，酶更趨向于分配上相，但過多的鹽導(dǎo)致酶的活性下降，因此，鹽濃度最優(yōu)值為0.16 g/mL。

2.1.3 雙水相體系pH的確定。

配制pH為6.5～9.5的離子液體雙水相體系，考察體系中不同pH條件對(duì)酶活性的影響。由圖6可知，在離子液體溶液雙水相體系中，當(dāng)pH<7.5和pH>7.5 時(shí)，酶活性均較低，在酸性或堿性條件下接近酶的等電點(diǎn)導(dǎo)致溶解性變差，部分析出致使酶活性下降。故試驗(yàn)中為保持酶的活性，雙水相體系的pH應(yīng)保持在7.5左右。

2.1.4 萃取和靜置時(shí)間的確定。

準(zhǔn)確稱取0.5 g番茄泥于制備好的離子液體雙水相體系中，充分混合均勻后，置于30 ℃、200 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中提取CAT，通過考察不同萃取時(shí)間和靜置時(shí)間對(duì)提取的酶活性差異，確定最佳的萃取時(shí)間和靜置時(shí)間。由圖7可知，隨萃取時(shí)間增加，酶活性逐漸增加，當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)20 min后，酶活性逐漸穩(wěn)定，因此萃取時(shí)間選擇為20 min。

在確定萃取時(shí)間的條件下，考察不同靜置時(shí)間下提取的CAT活性的差異。由圖7可知，酶活性隨著靜置時(shí)間的增加而升高，并在15 min時(shí)達(dá)到最高，之后由于放置時(shí)間的延長(zhǎng)部分酶失活，導(dǎo)致酶活性有所下降，故選取的靜置時(shí)間為15 min。

2.2 離子液體雙水相法與緩沖溶液提取法的對(duì)比

對(duì)傳統(tǒng)的緩沖溶液提取法與離子液體雙水相法進(jìn)行對(duì)比。由表1可知，離子液體雙水相萃取得到的CAT、SOD、AAO、PPO這4種抗氧化酶活性高于傳統(tǒng)的緩沖溶液提取法。由于該研究以[C4mim] Cl/K2HPO4形成上相富集離子液體和下相富集無(wú)機(jī)鹽的雙水相體系，基于鹽析作用蛋白質(zhì)水溶液在高濃度的中性鹽中會(huì)析出產(chǎn)生沉淀，得到的蛋白質(zhì)一般不失活，一定條件下又可重新溶解，基于配位作用蛋白質(zhì)上的氨基酸會(huì)和離子液體發(fā)生配位反應(yīng)，從而大大增強(qiáng)了蛋白質(zhì)在離子液體中的溶解度，使蛋白質(zhì)富集在上相的離子液體中[9]。然而，離子液體雙水相法提取的POD活性低于緩沖溶液提取方法，可能是由于離子液體雙水相體系pH較高，導(dǎo)致了部分酶活性喪失，后期將繼續(xù)對(duì)POD酶提取條件進(jìn)行優(yōu)化，但離子液體雙水相法提取的POD其標(biāo)準(zhǔn)差小于傳統(tǒng)方法得到的酶活性的標(biāo)準(zhǔn)差。總體來(lái)說，離子液體雙水相萃取法優(yōu)于傳統(tǒng)的緩沖溶液提取方法，且得到的酶活性更加穩(wěn)定，該方法受到的外界干擾更小。

3 結(jié)論

該研究基于[C4mim]Cl/K2HPO4雙水相體系，建立了萃取分離番茄中5種抗氧化酶（CAT、POD、SOD、AAO、PPO）的新方法。以抗氧化酶活性為指標(biāo)，對(duì)離子液體的種類及濃度、提取時(shí)間、無(wú)機(jī)鹽的用量、體系pH、萃取時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化，并與傳統(tǒng)的緩沖溶液提取法相比較。結(jié)果表明提取番茄中抗氧化酶的最佳條件是采用濃度為0.40 g/mL[C4mim]Cl離子液體，K2HPO4濃度為0.16 g/mL，pH為7.5，萃取時(shí)間為20 min，靜置時(shí)間為15 min。該研究建立的離子液體雙水相提取方法成功提取了番茄中5種抗氧化酶，酶活性比傳統(tǒng)提取方法高（除POD外），且穩(wěn)定性較好，萃取時(shí)間縮短了10 min。該研究提出了一種基于離子液體雙水相體系的快速、高效、高活性的抗氧化酶分離方法。

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