不同產(chǎn)區(qū)紫蘇種子發(fā)芽過程酶活力的研究

王菲 崔新爽 李曉雪 楊逢建

摘 要：為了比較分析不同產(chǎn)區(qū)紫蘇種子發(fā)芽過程中生化指標(biāo)的活力，本研究根據(jù)我國最新行政區(qū)劃分的7大區(qū)域，選擇7個產(chǎn)區(qū)的紫蘇種子，將其在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽，采用可見光比色和堿性滴定等方法測定種子發(fā)芽過程中的淀粉酶、蛋白酶、糖化酶以及脂肪酶的活力。結(jié)果顯示，各產(chǎn)區(qū)之間脂肪酶活力均在15～17 u/g之間;河南產(chǎn)區(qū)的紫蘇種子在發(fā)芽過程中酶活力均高于其他產(chǎn)區(qū)，淀粉酶活力在31.37 mg/（g·min），脂肪酶活力達(dá)到17 u/g，蛋白酶活力在180.96 u/g，而糖化酶活力最高的是甘肅和云南，均達(dá)到17.40 u/ml。本研究結(jié)果可為不同產(chǎn)區(qū)的紫蘇種子發(fā)芽過程中分析比較生化指標(biāo)的活力提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)區(qū);紫蘇種子;發(fā)芽;酶活力

中圖分類號：S567.219 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? 文章編號：1006-8023（2019）05-0022-05

Abstract：In order to compare and analyze the activity of biochemical indexes in the germination process of perilla seeds from different producing areas， this study selected perilla seeds from seven producing areas according to the seven major regions divided by the latest administrative regions of our country， germinated them in an incubator， and determined the activity of amylase， protease， glucoamylase and lipase in the seed germination process by visible light colorimetric method and alkaline titration method. The results showed that the lipase activity was between 15-17u/g in all production areas. The activities of perilla seeds in Henan production areas were higher than those in other production areas during germination， amylase activity was 31.37mg/（gomin）， lipase activity was17u/g， protease activity was 180.96u/g， while glucoamylase activity was highest in Gansu and Yunnan， both reaching 17.40 u/ml. The results of this study can provide some theoretical basis for analyzing and comparing the vitality of biochemical indexes in the germination process of Perilla friescens seed from different producing areas.

Keywords：Production areas; perilla seed; germination; enzyme activity

0 引言

紫蘇（Perilla frutescens）又名蘇子、紅蘇、赤蘇和引子等，紫蘇為唇形科，即使在生存條件較嚴(yán)苛的情況下都可以生長良好[1]，紫蘇是我國衛(wèi)生部第一批公布的既是60種藥品中之一同時又可作為食品的植物[2]。目前，在世界均有著顯著性的商業(yè)化栽植[3]，所以有著栽培歷史悠久、種質(zhì)資源豐富的特點(diǎn)[4]，其種子品質(zhì)除了主要受遺傳基因的控制，還受環(huán)境因子的影響[5]，并且已有3000多年的長久歷史[6]。近些年來，隨著人們對紫蘇更深入的認(rèn)識，研究熱點(diǎn)已成為紫蘇所含的活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分的開發(fā)利用[7]，紫蘇因?yàn)橛幸欢ǖ囊种蒲ㄐ纬伞⒚廊?、防治冠心病以及營養(yǎng)價值，所以人們對其開發(fā)利用研究越來越重視[8]。前人對紫蘇籽粒研究的方面主要集中于其油用價值[9-11]，但是對于紫蘇籽粒中其他的營養(yǎng)成分的研究鮮有報(bào)道[12]，尤其是對于紫蘇籽發(fā)芽過程中營養(yǎng)成分和生化指標(biāo)的研究鮮有報(bào)道。

第一個參與脂肪分解代謝反應(yīng)的就是脂肪酶，它可以催化水解天然油脂，是一種特殊性的酯鍵水解酶[13]，在脂肪的轉(zhuǎn)化速率起著調(diào)控的作用，從而導(dǎo)致脂肪水解反應(yīng)發(fā)生[14]。淀粉酶屬于水解酶類，因此可以水解糖原和淀粉等各種酶，并且是催化糖原和糊精中糖苷鍵等一類酶的總稱。曾有報(bào)道指出，在種子萌發(fā)過程中，蛋白酶的活力要先于其他的酶類，并且在發(fā)芽的過程中會明顯提高[15]。糖化酶的全稱是葡萄糖淀粉酶，它可以水解生成淀粉酶或者是一些低聚糖，而且是一種單鏈酸性的糖苷水解酶，同時具有淀粉外切酶活性。本研究主要是以紫蘇種子為實(shí)驗(yàn)原料，對不同產(chǎn)區(qū)的紫蘇種子發(fā)芽過程中酶的活性進(jìn)行比較分析，為進(jìn)一步研究開發(fā)利用紫蘇種子以及對其優(yōu)質(zhì)品種的篩選提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

根據(jù)中國7大地理分區(qū)，以東北地區(qū)的黑龍江、西北地區(qū)的甘肅、華中地區(qū)的河南、華東地區(qū)的安徽、西南地區(qū)的云南、華南地區(qū)的廣東和華北地區(qū)的河北等7個地區(qū)的紫蘇種子作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 儀器與設(shè)備

TB-215D型電子天平;北京中儀匯豐科技有限公司;TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī);上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;恒溫水浴鍋;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1種子發(fā)芽

選擇大小均勻，外觀完整且無病蟲害的紫蘇種子作為實(shí)驗(yàn)材料。將種子清洗干凈，浸泡4 h后，置于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，放于培養(yǎng)箱中，溫度在25～30 ℃，濕度不低于15%即可，濾紙每天保持濕潤，以第一顆種子發(fā)芽的時間開始計(jì)時為第一天。

1.3.2 淀粉酶活力測定

準(zhǔn)確稱取1 g發(fā)芽且已去皮的種子，加4 ml蒸餾水和少許石英砂，于冰浴中研磨至勻漿，然后轉(zhuǎn)移到15 ml的離心管中，再用6 ml蒸餾水洗滌研缽一并倒入離心管中，搖勻于25 ℃室溫放置15～20 min，在0～4 ℃、10 000 r/min下離心30 min，用吸管取上清液，作為酶提取液備用。

（1）α-淀粉酶活性的測定

取3支試管，其中2支為測定管，1支為對照管，然后每支試管內(nèi)加1 ml酶提取液，于79 ℃恒溫水浴中加熱15 min，取出迅速冷卻，在每支試管內(nèi)加入1 ml pH為5.6的檸檬酸緩沖液，為了鈍化酶的活性，在對照管中加入3，5一二硝基水楊酸試劑2 ml，然后將3支試管放在40 ℃水浴中保溫10 min，再向每支試管加入1 ml在40 ℃下預(yù)熱1 %的淀粉溶液，搖勻立即于40 ℃水浴中保溫5 min，取出后迅速向測定管內(nèi)加入3，5一二硝基水楊酸試劑2 ml。最后將3支試管放在沸水浴中煮沸5 min，冷卻后加10 ml蒸餾水，搖勻后立刻在540 nm波長下比色，測定吸光值。

（2）α+β-淀粉酶活性的測定

同樣取3支試管，標(biāo)明2支為測定管，1支為對照管，然后向每支試管加1 ml酶提取液，在對照管中加入3，5一二硝基水楊酸試劑2 ml，從而鈍化酶的活性。將3支試管放在40 ℃恒溫水浴中保溫10 min后加入預(yù)熱（40 ℃）的淀粉溶液1 ml，搖勻，迅速放入40 ℃水浴中準(zhǔn)確保溫5 min，取出后向測定管加入3，5一二硝基水楊酸試劑2 ml，搖勻后在沸水浴中煮沸5 min，迅速冷卻，然后在每支試管內(nèi)加入10 ml蒸餾水，搖勻在540 nm波長下比色，測定吸光值。

（3）計(jì)算：

α-淀粉酶活性=C×VTW×VS×t[mg/（g·min）]。

α+β-淀粉酶活性=C×VTW×VS×t[mg/（g·min）]。

式中：C為α-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖（在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的值），mg;C為α+β-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖（在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的值），mg;W為樣品重量， g;VT為淀粉酶原液的總體積， ml;VS為反應(yīng)所用淀粉酶原液體積， ml;T為反應(yīng)時間， min。

1.3.3 脂肪酶活力測定

采用傳統(tǒng)的橄欖油乳化法測定[16]。稱取1 g去皮的種子芽，加5 ml磷酸緩沖液（pH為7.5）于冰浴中研磨成勻漿，然后在12 000 r/min下離心10 min，用吸管將上面浮著的脂肪層除去，取上清液作為酶提取液備用。

取150 ml的三角瓶兩只，其中一只為空白瓶（A）另一只為樣品瓶（B），然后各加入4 ml PVA橄欖油乳化液和5 ml ?0.025 mol/L磷酸緩沖液（pH7.5），再向A瓶中加入15 ml的95%乙醇，將兩只三角瓶放在40 ℃水浴中保溫5 min后各加入1 ml酶提取液，立即計(jì)時，15 min后取出，向B瓶中加15 ml的95%乙醇，然后加入2滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為止。脂肪酶活力計(jì)算公式：

酶活力（U）= 氫氧化鈉消耗量（ml）反應(yīng)時間（min）×M×N（1）。

式中：M為1 m L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液所含的微克分子數(shù);N為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 糖化酶活力測定

準(zhǔn)確稱取去皮后的種子芽1 g，加乙酸緩沖液于研缽中研磨至勻漿，倒入并定容在50 ml的容量瓶，搖勻后用4層紗布過濾，濾液作為酶提取液備用。

取兩支比色管，其中一支為樣品管（B），另一支為空白管（A），然后向兩支試管中25 ml可溶性淀粉溶液和5 ml緩沖液，搖勻，置于40 ℃水浴中加熱5 min，向B管中加2 ml酶液，搖勻后立即在此溫度下反應(yīng)30 min，每支試管加入0.2 ml氫氧化鈉溶液，取出迅速冷卻，再向A管中加2 ml酶液，樣品管與空白管各取5ml置于兩個碘量瓶中，然后分別加入10 ml碘溶液和15 ml氫氧化鈉溶液，搖勻，加蓋，在暗處反應(yīng)15 min后加2 ml硫酸溶液，立刻用硫代硫酸鈉溶液滴定，藍(lán)色消失為終點(diǎn)。

計(jì)算公式：

X=（A-B）c×90.05×32.2/5×1/2×n×2=579.9×（A-B）c×n。

式中：X為樣品酶活力，u/ml;A為空白消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，ml;B為樣品消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，ml ;c為硫代硫酸鈉溶液的濃度;90.05為與1 ml硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mol/L），相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜钠咸烟堑馁|(zhì)量;32.2為反應(yīng)液的總體積 ;5為吸取反應(yīng)液的體積 ;1/2為吸取酶液2 ml，換算為1ml;n為稀釋倍數(shù);2為反應(yīng)30 min，換算為1 h的酶活力系數(shù)所得的結(jié)果表示至整數(shù)。

1.3.5 蛋白酶活力測定

稱取發(fā)芽并且已去皮的種子2 g，加入已4 ℃預(yù)冷pH 8.2的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸5 ml，在10 000 r/min、4 ℃離心15 min，吸取上清液作為酶提取液。

兩支試管，一支為調(diào)零對照，另一支為樣品，各加2 ml酶液，30%乙酸1 ml，再向樣品試管中加入0.4 mg/ml Na-苯甲酰-DL-精氨酸-4-硝基苯胺鹽酸鹽（BAPNA）3 ml（提前在37 ℃水浴中預(yù)熱），在37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)1h后在對照管內(nèi)加入0.4 mg/ml BAPNA 3 ml，在410 nm波長下進(jìn)行比色，測定吸光度值。

總蛋酶活性（U/（g·h））=（ΔA410×VT）/

（0.01×Fw×VS×t）

式中：ΔA410為410 nm 處吸光度值的變化 ;VT為提取液總體積，mL;Fw為稱取馬鈴薯樣品質(zhì)量，g;VS為測定時取用酶液體積，mL;t為反應(yīng)時間，h。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和繪圖，采用林肯方法進(jìn)行顯著性差異分析（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1淀粉酶活力分析

由圖1可知，不同產(chǎn)區(qū)紫蘇種子芽所含的α-淀粉酶和α+β-淀粉酶存在極顯著差異性，P=0.008。河南達(dá)到最高，分別為31.37 mg/（g·min）和24.13 mg/（g·min），其次是黑龍江地區(qū)，分別是24.26 mg/（g·min）和16.56mg/（g·min），活力最低的產(chǎn)區(qū)是甘肅，分別為19.62 mg/（g·min）和13.65 mg/（g·min）。安徽和云南產(chǎn)區(qū)的α-淀粉酶活力高低沒有明顯差異;安徽和廣東產(chǎn)區(qū)的α+β-淀粉酶活力差別不明顯。

2.2 脂肪酶活力分析

根據(jù)圖2可知，河南產(chǎn)區(qū)紫蘇種子芽脂肪酶活力最高，為17 u/g，黑龍江產(chǎn)區(qū)的達(dá)到17.67 u/g，僅次于河南，廣東和甘肅產(chǎn)區(qū)的脂肪酶活力一樣，均為15.33 u/g，云南和安徽產(chǎn)區(qū)差別不大。

從圖2可看出，在樣品瓶中后加入15 %的乙醇的做法的耗堿量要大于空白組，且酶活力也高于空白組，所以，在樣品組內(nèi)加入不含酶的緩沖液可以比較準(zhǔn)確的提高酶活力，也增加了此方法的可信度。

2.3 蛋白酶活力分析

由圖3可看出，7個地區(qū)間蛋白酶活差別明顯。河南地區(qū)的紫蘇種子芽蛋白酶活力顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，其酶活為180.96 u/g，其次是河北地區(qū)，為154.98 u/g，黑龍江產(chǎn)區(qū)的紫蘇種子發(fā)芽過程中蛋白酶活力為142.25 u/g，活力最低的是甘肅，為40.31 u/g。

2.4 糖化酶活力分析

從圖4可看出，各產(chǎn)區(qū)之間糖化酶活力無明顯差別。安徽地區(qū)的紫蘇種子發(fā)芽過程中糖化酶活力明顯低于其他地區(qū)，為8.7 u/ml，甘肅和云南地區(qū)無差異，均為17.4 u/ml，廣東與河南地區(qū)的酶活都為14.5 u/ml，而黑龍江與河北產(chǎn)區(qū)的酶活一樣，均為11.6 u/ml。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

種子在開始萌發(fā)的時候，它本身的一些水解酶會被激活，在種子萌發(fā)的初期酶量會比較少，但酶量會隨著發(fā)芽天數(shù)的增加而增長，因此，發(fā)芽時間越長，其活力也越強(qiáng)，所以就出現(xiàn)了不同的種子發(fā)芽天數(shù)，其酶活力的大小存在一定的差異[17]，另外，酶活的測定比較容易受環(huán)境因素的影響[18-19]，在不同環(huán)境測得的酶活可能會存在一定的差異。因?yàn)楦拭C年平均氣溫在0～15 ℃，大部分地區(qū)比較干燥，將該產(chǎn)區(qū)的紫蘇種子放在恒溫25 ℃和濕度15%的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽，可能種子本身不能很好的適應(yīng)從而導(dǎo)致發(fā)芽力低于其他地區(qū)，所以其酶活力較其他產(chǎn)區(qū)偏低。脂肪酶是種子萌發(fā)階段的最主要的能量來源，它主要存在于油料種子中[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，種子發(fā)芽速度與脂肪酶活力呈正相關(guān)。由于河南的濕潤-半濕潤季風(fēng)氣候，使該產(chǎn)區(qū)的種子能在一定條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽良好，所以其酶活較其他產(chǎn)區(qū)高。

種子的來源、樣品的處理、測定的時間和方法及在實(shí)驗(yàn)中的誤差都會對測定結(jié)果造成一定的影響，而主要與種子樣品來源的鑒定有關(guān)的就是它們之前的生長環(huán)境。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)選擇的是來自7個不同產(chǎn)區(qū)的紫蘇種子，又因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)是將7個不同產(chǎn)區(qū)的紫蘇種子同時放在相似的生長環(huán)境下進(jìn)行發(fā)芽測定，由于各個產(chǎn)區(qū)的地理位置、氣候環(huán)境等外界因素不一樣，導(dǎo)致種子的發(fā)芽力不同，從而影響各產(chǎn)區(qū)紫蘇種子在發(fā)芽過程中的酶活力。因此，不同產(chǎn)區(qū)的酶活會存在一定的差異，通過測定結(jié)果來看，發(fā)現(xiàn)種子的生長環(huán)境對各種酶活的測定有很大的影響。

3.2 結(jié)論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，河南產(chǎn)區(qū)的紫蘇種子在發(fā)芽過程中，其各種酶活均高于其他產(chǎn)區(qū);且本實(shí)驗(yàn)所采用測定方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度均符合樣品的測定要求，為以后的種子生產(chǎn)服務(wù)奠定了良好的基礎(chǔ)。

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