高效液相色譜法測定染發(fā)劑中對苯二胺等32種染料組分

倪 琳,歐陽曉玫,李若綺,武 悅,徐勤科,杜 興

(甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 73000)

染發(fā)類化妝品具有改變頭發(fā)顏色的作用[1]. 染發(fā)劑依據(jù)染發(fā)效果可分為三類：暫時性、半持久性和持久性. 其中以氧化型染發(fā)劑最為流行，屬于永久性染發(fā)劑，染料中間體主要成分多為苯胺類化合物，使用后可能引起不良反應(yīng)[2]. 2017年國家化妝品不良反應(yīng)監(jiān)測系統(tǒng)中共收到染發(fā)類化妝品不良反應(yīng)/事件報告2 688份，占收集到全部特殊類化妝品不良反應(yīng)報告的21.02%. 染發(fā)類化妝品不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為皮損紅斑、丘疹等癥狀，使用者自覺癥狀以瘙癢為主，其次為灼熱感、疼痛、緊繃感、干燥、頭暈、頭痛等. 頻繁使用染發(fā)產(chǎn)品可能帶來的安全性問題一直受到廣泛關(guān)注，染發(fā)產(chǎn)品也一直是化妝品管理和研究的重點之一[3-7]. 在我國染發(fā)類產(chǎn)品屬于具有特殊用途的化妝品，為加強對染發(fā)劑使用安全和質(zhì)量的管理,《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015 年版)中規(guī)定了化妝品的 75 種準(zhǔn)用染發(fā)劑和在使用時的最大允許濃度, 并將鄰苯二胺、鄰氨基苯酚、對苯二胺、 2-硝基對苯二胺、甲苯-3,4-二胺、間苯二胺、氫醌、N,N-二乙基對苯二胺硫酸鹽、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺鹽酸鹽等多種染料組分列為禁用組分. 目前，對染料組分的測定主要采用高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、毛細管電泳-間接化學(xué)發(fā)光法[8-13]. 其中高效液相色譜法因儀器普及率較高、靈敏度高以及分析速度快等特點而被廣泛應(yīng)用于染發(fā)劑染料組分的分析測定. 同時, 規(guī)范中也推薦了適用于染發(fā)類化妝品中對苯二胺等 8 種氧化型組分的含量測定方法和適用于染發(fā)類化妝品中對苯二胺等 32 種組分含量的測定方法[14-15]. 但在實際工作中發(fā)現(xiàn),按照規(guī)范中檢測32種染料組分的方法測定，有3個組分未達到基線分離. 并且由于染發(fā)劑的基質(zhì)較復(fù)雜，按照規(guī)范方法制備的供試品溶液無法過濾. 本研究優(yōu)化了《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中高效液相色譜法測定染發(fā)劑中對苯二胺等 32 種組分含量的方法,隨機抽取了50 批市售染發(fā)劑進行檢測, 并根據(jù)檢驗結(jié)果對染料組分的種類、用量等使用情況進行統(tǒng)計分析.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Alliancee2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ME204電子天平(瑞士梅特勒公司)；XS205DU電子天平(瑞士梅特勒公司).

隨機抽取甘肅地區(qū)27個市、州、縣地區(qū)專賣店、商場、超市、美容美發(fā)場所、集散市場等出售的染發(fā)劑共計50批次.

32種染發(fā)劑標(biāo)準(zhǔn)品的信息如表1所列.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取各染料標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，精密稱定，加入2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-無水乙醇(體積比為1:1)的混合溶液，制成質(zhì)量濃度為10 g/L的各染料標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液. 分別用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液溶解甲苯-2,5-二胺硫酸鹽和2-氯對苯二胺硫酸鹽并定容，甲苯-3,4-二胺使用無水乙醇定容. 精密稱定2-硝基對苯二胺和4-硝基鄰苯二胺25 mg，使用無水乙醇定容，配成質(zhì)量濃度為2.5 g/L的溶液. 2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、對甲基氨基苯酚硫酸鹽、2,6-二氨基吡啶、N,N-二乙基對苯二胺硫酸鹽使用流動相(磷酸鹽混合溶液) 溶解. 2～4 ℃保存，2天內(nèi)使用.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對32種標(biāo)準(zhǔn)品依照組分進行分組，并根據(jù)分組情況，分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量于10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為500 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液. 取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用無水乙醇稀釋，配制成濃度分別為50、100、250、500、600、700、800 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液應(yīng)于使用前配制. 取各標(biāo)準(zhǔn)系列溶液5 μL注入高效液相色譜儀，分別采用3種流動相進行分析，記錄各色譜峰面積，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4 供試品溶液的制備

取樣品0.5 g，準(zhǔn)確稱量至0.000 1 g，置25 mL具塞比色管中，加入無水乙醇-水(體積比為1∶1)的混合溶液至刻度，渦旋1 min，冰浴超聲提取15 min，低溫離心(5 000 r/min)5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液.

1.5 色譜條件[16]

第一組：儀器型號：Waters Alliancee2695高效液相色譜儀；二極管陣列檢測器；色譜柱：SUPELCO Solutions within C16(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫:25 ℃,流動相：乙腈-磷酸鹽混合溶液(稱取十二水合磷酸氫二鈉1.8 g，磷酸二氫鉀2.8 g和庚烷磺酸鈉1.0 g，用水稀釋至1 L，用磷酸調(diào)pH至6，體積比為10∶90)；檢測波長：280 nm；運行時間：35 min,進樣量：標(biāo)準(zhǔn)品5 μL，樣品10 μL，流速：1.0 mL/min.

第二組：儀器型號、色譜柱、柱溫、檢測波長、進樣體積及流速同第一組. 流動相：甲醇-磷酸鹽混合溶液(配制方法同第一組，體積比為10∶90)；運行時間：40 min.

第三組：儀器型號：LC-20A高效液相色譜儀；二極管陣列檢測器；色譜柱、柱溫、檢測波長、進樣體積及流速同第一組；流動相：乙腈-磷酸鹽混合溶液(配制方法同第一組，體積比為40∶60)；運行時間：35 min.

表1 32種染發(fā)劑標(biāo)準(zhǔn)品信息Table 1 Information of 32 reference substances in dye

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

取同一批號樣品，按照供試品及混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的方法制備，使用 CAPCELLPAK C18色譜柱、Diamonsil C18色譜柱、Phenomenex C18色譜柱和SUPELCO Solutions within C164 個不同品牌色譜柱進行測定,試驗結(jié)果表明SUPELCO Solutions within C16色譜柱能實現(xiàn)所有染料的基線分離,且重現(xiàn)性較好，故選用該色譜柱.

2.2 流動相的選擇

因流動相中加入離子對試劑，對色譜柱的使用壽命影響較大，故試驗了流動相中不加離子對試劑(庚烷磺酸鈉)，結(jié)果樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)品中部分染料組分在色譜柱上無保留，因此，流動相中需要加離子對試劑.

2.3 染發(fā)劑中32種染料組分分組情況

分組依據(jù)：將同分異構(gòu)體、結(jié)構(gòu)相似的組分重新分組，不易分離的物質(zhì)分到不同組中進行檢測. 試驗中發(fā)現(xiàn)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)方法中第一組的間苯二酚、苯基甲基吡唑啉酮、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺鹽酸鹽未達到基線分離，將上述三種組分分到第三組，分離效果較好(如表2所列、圖1～3所示).

表2 32種染料組分分組情況Table 2 Distribution of 32 constituents in dye

圖1 第一組混合標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC of group Ⅰof mixed standard products

圖2 第二組混合標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig. 2 HPLC of group Ⅱ of mixed standard products

圖3 第三組混合標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig. 3 HPLC of group Ⅲ of mixed standard products

2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限和定量限結(jié)果如表3所列. 由表3可知，在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，各染料組分峰面積和對應(yīng)的濃度具有良好的線性關(guān)系，R2均高于0.99. 對標(biāo)準(zhǔn)溶液進行逐級稀釋，以S/N=3確定檢出限(LOD)，以S/N=10確定定量限[LOQ,參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)]中染發(fā)劑的使用限度，該方法的檢出限低于規(guī)范規(guī)定的限度，滿足實際樣品的分析要求.

2.5 精密度和準(zhǔn)確度試驗

對高、中、低3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行平行測定6次，計算32種染料組分峰面積的RSD，均小于4%. 故精密度滿足分析要求.

由于染發(fā)劑空白樣品較難得到，故制備不含氧化型染料的空白樣品，均加入高、中、低3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行加標(biāo)回收，每個濃度水平重復(fù)測定2次，結(jié)果各染料組分低濃度水平的加標(biāo)回收率為74%～114%，中濃度水平的加標(biāo)回收率為79%～110%，高濃度水平的加標(biāo)回收率為83%～104%.

2.6 穩(wěn)定性試驗

將高、中、低3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液置于室溫下，每個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液于0,2,4,6,8,10 h各測定1次，計算各組分峰面積的RSD均小于3%，結(jié)果32種染料組分在10 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.7 染發(fā)劑中32種染料組分的含量測定結(jié)果

對50批染發(fā)劑中32種組分的含量進行測定，其中有2批次檢出禁用組分鄰氨基苯酚,有1批次的苯基甲基吡唑啉酮超出規(guī)定的限量. 對50批次染發(fā)劑中32種組分的檢測中檢出的各組分進行統(tǒng)計，結(jié)果表明：染發(fā)劑使用染料組分頻率最高的是對苯二胺、間苯二酚、間氨基苯酚和對氨基苯酚，其次是2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、苯基甲基吡唑啉酮、2-甲基間苯二酚、4-氨基-2-羥基甲苯、2-氨基-3-羥基吡啶、4-氨基間甲酚、6-羥基吲哚、N,N-雙(2-羥乙基) 對苯二胺硫酸鹽、1-萘酚和4-氯間苯二酚等.

表3 32種染料組分的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Regression equations,linearity ranges,correlation coefficients,detetion limits and limits of quantification of 32 dye components

2.8 染發(fā)劑質(zhì)量評價[17]

50批次染發(fā)劑中有25批次不合格，其中，未超過規(guī)定限量但存在問題的樣品有22批次，其使用頻率較高的間氨基苯酚不合格率高達42%，對苯二胺不合格率高達26%. 50批染發(fā)劑中有12批次產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)識與批件配方信息雖然一致，但存在以下問題：(1)檢出批件及標(biāo)簽未標(biāo)識的染發(fā)劑.(2)未檢出批件及標(biāo)簽標(biāo)識的染發(fā)劑.(3)同時存在檢出和未檢出的情況.此類產(chǎn)品雖然未超過規(guī)定限量，依然視為有問題的樣品，即不合格. 還有13批次產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)識與批件配方信息不一致，存在未檢出批件標(biāo)識的染發(fā)劑、未檢出標(biāo)簽標(biāo)識的染發(fā)劑、檢出批件未標(biāo)識的染發(fā)劑、檢出標(biāo)簽未標(biāo)識的染發(fā)劑以及同時存在檢出和未檢出等情況，即使未超規(guī)定限量，也為有問題的樣品，即不合格.

2.9 染發(fā)劑采樣地點情況分析

因甘肅沒有染發(fā)劑生產(chǎn)廠家，生產(chǎn)環(huán)節(jié)沒有采集到樣品. 采樣來自集散市場、商店、商場、藥店、超市和美容美發(fā)場所. 除專賣店外，其他采樣點均有不合格樣品. 因采集到的樣品有限，可能不具備代表性. 采集到的50批次樣品，其中國產(chǎn)樣品44批次，進口樣品6批次. 經(jīng)檢驗，進口樣品全部合格，因抽樣批數(shù)較少，只能做參考數(shù)據(jù). 44批國產(chǎn)樣品中25批不合格，合格率僅為43%，說明國產(chǎn)染發(fā)類化妝品質(zhì)量有待進一步提高. 不合格樣品中產(chǎn)地來自廣東22批次，浙江2批次，上海1批次. 本次抽樣中自廣東的染發(fā)類產(chǎn)品共25批次，不合格樣品占76%，需引起監(jiān)管部門的重視.

3 結(jié)論

對《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)染發(fā)類產(chǎn)品的檢測方法進行改進，同時對50批染發(fā)類化妝品的檢驗結(jié)果進行分析，可以看出存在以下問題：(1)生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品包裝上隨意標(biāo)識信息，誤導(dǎo)欺騙消費者. (2)染發(fā)類化妝品不按照批件規(guī)定的配方生產(chǎn)，生產(chǎn)企業(yè)對《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)規(guī)定允許使用的染料組分及禁用組分不明確.建議有關(guān)部門應(yīng)規(guī)范染發(fā)類化妝品的包裝標(biāo)簽標(biāo)識，加強產(chǎn)品批件配方信息與包裝標(biāo)簽識的一致性監(jiān)管，進一步完善染發(fā)類化妝品的質(zhì)量和規(guī)范銷售市場.