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    探針底物法評價柚皮苷對大鼠肝臟CYP3A1/2酶代謝活性的影響

    2019-10-09 02:38:14程可羚吳灝白楊樊威洋蘇薇薇李沛波
    藥學(xué)研究 2019年9期
    關(guān)鍵詞:柚皮苷工作液標(biāo)樣

    程可羚,吳灝,白楊,樊威洋,蘇薇薇,李沛波

    (中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510275)

    細(xì)胞色素P450(CYP450)酶是肝臟和腸中最為重要的Ⅰ相代謝酶,可催化大多數(shù)臨床藥物代謝;藥物對CYP450酶活性的誘導(dǎo)或抑制是引發(fā)藥物相互作用的常見機制[1]。目前,超過90%的治療藥物被認(rèn)為主要是由CYP 3A4/5、2D6、2C9、2C19、2E1、1A2等亞型酶所代謝的[2-4]。其中,CYP3A4是非常重要的亞型酶之一,參與了約50%的上市藥物的代謝清除[5]。

    柚皮苷為二氫黃酮苷類化合物,骨架結(jié)構(gòu)由5,7,4′-三羥基-二氫黃酮苷元(柚皮素)與蕓香糖[2-O-(α-L-鼠李糖)-β-D-葡萄糖]構(gòu)成。柚皮苷廣泛存在于蕓香科植物葡萄柚、桔、橙等水果植物及化橘紅、骨碎補、枳實、枳殼、橘紅、菝葜、枸櫞等中藥材中;日常食用的橙汁及葡萄柚汁也普遍含有柚皮苷[6-7]。目前,關(guān)于柚皮苷對CYP3A 酶代謝活性的影響,有關(guān)文獻報道說法不一。如,Bailey等[8]以12位健康男性為研究對象,研究柚皮苷對尼索地平口服藥代動力學(xué)的影響,結(jié)果表明,柚皮苷不會影響尼索地平口服藥代動力學(xué)過程;Edwards等[9]用睪酮作為CYP3A的探針底物,采用大鼠肝微粒體體外研究體系研究了葡萄柚汁、鮮榨酸橙汁和柚皮苷對CYP3A的抑制作用,結(jié)果表明,葡萄柚汁抑制CYP3A活性的主要成分不是柚皮苷和柚皮素;Bailey等[10]以12位健康男性為研究對象,研究柚皮苷對非洛地平代謝的影響,結(jié)果表明,柚皮苷不是葡萄柚汁與非洛地平發(fā)生代謝性相互作用的主要活性物質(zhì);Ho等[11]的研究表明,柚皮苷和柚皮素對人肝微粒體CYP3A4有較弱的抑制作用;Kim等[12]的研究表明,柚皮苷可能通過抑制CYP3A的活性而減少維拉帕米在家兔體內(nèi)的代謝;Choi等[13]的研究表明,柚皮苷可能通過抑制CYP3A和 P-gp而提高他莫西芬在大鼠體內(nèi)的生物利用度??梢?,明確柚皮苷是否會通過影響CYP3A4的代謝活性而與其他藥物產(chǎn)生相互作用,是十分必要的。體內(nèi)探針底物法是研究CYP450亞型酶活性的重要方法之一,該法通過給予實驗動物CYP450 酶的特異性底物(探針底物),通過考察藥物或者其他外源性物質(zhì)對探針底物的主要藥動學(xué)參數(shù)的影響,間接反映藥物或者其他外源性物質(zhì)對CYP450 酶活性的誘導(dǎo)或抑制效應(yīng)[14-15]。

    CYP3A4酶的底物眾多,據(jù)統(tǒng)計約有150多種藥物,其中,咪達唑侖是美國FDA推薦的常用探針?biāo)幬?。在大鼠體內(nèi),CYP3A1/2與人CYP3A4功能相當(dāng)[16],且有著相同的探針底物[15]。因此,本實驗采用體內(nèi)探針底物法,以咪達唑侖為底物,評價柚皮苷連續(xù)7 d給藥后對大鼠肝臟CYP3A1/2活性的影響,為柚皮苷臨床安全合理用藥提供參考。

    1 材料

    1.1 試藥 咪達唑侖(純度99.9%,批號:171250-201002,中國食品藥品檢定研究院);皮質(zhì)酮(純度98.73%,批號:2750129,德國Calbiochem公司);甲醇(HPLC級,批號:AH230-4,美國Honeywell B&J公司);乙腈(HPLC級,批號:AH015-4,美國Honeywell B&J公司);甲酸(LC-MS級,批號:2017011811A,廣州飛恩新材料科技公司);肝素鈉(185 USP U·mg-1,上海阿拉丁);柚皮苷(純度為98.4%,由本團隊委托廣東環(huán)球制藥有限公司生產(chǎn),批號:160901)。

    1.2 儀器 1200SL HPLC-6410 Triple Quad 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);Centrifuge 5430R 臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);Vortex-Genie 2 渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司);MS105DU 電子分析天平(美國 Mettler Toledo公司);Arium mini 超純水系統(tǒng)(德國Sartorius公司);精密移液器(美國Rainin公司)。

    1.3 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠,體重(250±20)g,動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2013-0002。飼養(yǎng)于中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院時珍堂,實驗動物使用許可證號為SYXK(粵)2014-0020。

    2 方法

    2.1 溶液與試藥配制

    2.1.1 咪達唑侖對照品儲備液的配制 精密稱定咪達唑侖對照品10 mg,置于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解后,加甲醇至刻度線,配制成1 mg·mL-1的對照品儲備液。

    2.1.2 皮質(zhì)酮(內(nèi)標(biāo))對照品儲備液和內(nèi)標(biāo)工作液的配制 精密稱定皮質(zhì)酮對照品10 mg,置于10 mL棕色容量瓶中,加入適量甲醇,超聲溶解,繼續(xù)加甲醇定容,配制成1 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲備溶液。精密移取內(nèi)標(biāo)對照品儲備液400 μL于10 mL棕色容量瓶中,加入70%乙腈定容,配制成40 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

    2.1.3 校正標(biāo)樣工作液的制備 精密移取適量咪達唑侖對照品儲備液于10 mL棕色容量瓶中,用70%乙腈稀釋成濃度分別為20 000、8 000、4 000、2 000、800、400、200、100 ng·mL-1的8個不同濃度的校正標(biāo)樣工作液。

    2.1.4 質(zhì)控樣品工作液的制備 精密移取適量咪達唑侖對照品儲備液于10 mL棕色容量瓶中,用70%乙腈稀釋成濃度分別為15 000、3 000、240 ng·mL-1的高、中、低濃度質(zhì)控樣品工作液。

    2.1.5 探針?biāo)幬镞溥_唑侖注射溶液的配制 精密稱定咪達唑侖,溶于生理鹽水中,配制成濃度為0.8 mg·mL-1的咪達唑侖注射溶液,用于大鼠尾靜脈注射,現(xiàn)配現(xiàn)用。

    2.1.6 柚皮苷混懸液配制 稱取柚皮苷粉末適量,少量多次加入超純水,超聲混勻,制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.025、0.05和0.1 mg·mL-1的柚皮苷混懸液,供各劑量組大鼠灌胃使用。

    2.2 動物分組與給藥 大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d后開始實驗。將大鼠隨機分為空白對照組和4個柚皮苷給藥組,每組7只。給藥期間,自由飲水進食??瞻讓φ战M的大鼠灌胃給予等體積的超純水,柚皮苷給藥組分別按50、125、250和500 mg·kg-1的劑量灌胃給藥,給藥體積均為5 mL·kg-1,每天1次,連續(xù)7 d。最后一次灌胃后,大鼠禁食24 h,然后按2.5 mg·kg-1的劑量尾靜脈注射咪達唑侖溶液。

    2.3 采血與血漿樣品處理 準(zhǔn)備1%肝素鈉浸泡、烘干過的1.5 mL離心管和毛細(xì)玻璃管,于注射咪達唑侖溶液前及注射后5、10、20、30、45、60、90、120、180和270 min時用毛細(xì)玻璃管于大鼠眼底靜脈叢取血0.3~0.4 mL,置于1.5 mL離心管中。全血樣品于室溫下3 500 rpm離心15 min,移取上層血漿100 μL于新的離心管中,備用。

    2.4 色譜條件 采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(3.0 mm×30 mm,2.7 μm),柱溫為25 ℃,流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈,流速為0.4 mL·min-1,進樣量為10 μL。梯度洗脫程序為:0~1.7 min,乙腈40%→46%;1.7~1.8 min,乙腈46%→90%;1.8~2.8 min,乙腈90%;2.8~2.9 min,乙腈90%→40%;2.9~7.0 min,乙腈40%。

    2.5 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化(ESI)電離、正離子模式檢測、多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行,霧化器溫度(Gas temp.)為325 ℃,霧化器流速(Gas flow)為12 L·min-1,霧化器壓力(Nebulizer)為30 psi。待定量的離子對及MRM條件(裂解電壓/碰撞能量)為:咪達唑侖m/z326.1→291.1,205 V/28 eV;皮質(zhì)酮(內(nèi)標(biāo))m/z347.2→121,140 V/24 eV。

    2.6 樣品制備

    2.6.1 血漿校正標(biāo)樣的制備 精密移取空白血漿100 μL,加入不同濃度的校正標(biāo)樣工作液10 μL,加內(nèi)標(biāo)工作液10 μL,混勻,加乙腈280 μL,制成質(zhì)量濃度分別為500、200、100、50、20、10、5和2.5 ng·mL-1的血漿校正標(biāo)樣,渦旋1 min,15 000 rpm離心10 min,精密移取上清液100 μL到液相小瓶套管,進樣。

    2.6.2 血漿質(zhì)控樣品的制備 精密移取空白血漿100 μL,加入不同濃度的質(zhì)控樣品工作液10 μL,加內(nèi)標(biāo)工作液10 μL,混勻,加乙腈280 μL,制成質(zhì)量濃度分別為375、75和6 ng·mL-1的質(zhì)控樣品,渦旋1 min,15 000 rpm離心10 min,精密移取上清液100 μL到液相小瓶套管,進樣。

    2.6.3 分析批的接受標(biāo)準(zhǔn) 一個分析批包括兩條隨行標(biāo)曲(按“2.6.1”項下的方法制備)、兩份血漿質(zhì)控樣品(按“2.6.2”項下的方法制備)、待測樣品、空白樣品和零濃度樣品。進樣時,血漿質(zhì)控樣品均勻分散于分析批中。至少75%的校正標(biāo)樣的準(zhǔn)確度在±15%以內(nèi)(定量下限在±20%以內(nèi)),至少67%的質(zhì)控樣品且每一濃度水平至少有50%的質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度在±15%以內(nèi),則接受該分析批。

    2.6.4 血漿樣品的制備 大鼠血漿樣品和零濃度樣品的制備方法為:精密移取待測血漿樣品或空白血漿樣品100 μL,加入內(nèi)標(biāo)10 μL,混勻,加70%乙腈10 μL,加乙腈280 μL,渦旋1 min,15 000 rpm離心10 min,精密移取上清液100 μL到液相小瓶的套管,進樣。空白樣品的制備方法為:精密移取空白溶劑樣品100 μL,加入70%乙腈20 μL,加乙腈280 μL,渦旋1 min,精密移取100 μL到液相小瓶的套管,進樣。

    2.7 方法學(xué)考察

    2.7.1 選擇性 按“2.6”項下的方法制備空白血漿樣品和校正標(biāo)樣中的定量下限樣品,空白血漿來自6只不同的大鼠,進樣分析并評價干擾。

    2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 按“2.6”項下的方法,在不同天分別制備校正標(biāo)樣進樣。以目標(biāo)分析物的濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo),以目標(biāo)分析物的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo),采用加權(quán)最小二乘法進行擬合,得到咪達唑侖的線性回歸方程。

    2.7.3 精密度和準(zhǔn)確度 按“2.6”項下的方法制備校正標(biāo)樣、定量下限樣品及低、中、高濃度質(zhì)控樣品各6份,以上樣品組成一個分析批,于制備當(dāng)日進樣分析。第2天、第3天重復(fù)制備前述分析批并進樣分析。

    2.7.4 殘留 在定量上限樣品進樣后進樣空白血漿樣品來估計殘留。

    2.7.5 基質(zhì)效應(yīng) 按“2.6”項下的方法,將100 μL的空白血漿替換為100 μL甲醇,制備不含血漿基質(zhì)的低濃度和高濃度純?nèi)芤簶悠犯?份,進樣。按照“2.6.4”項下的方法,制備低濃度和高濃度基質(zhì)效應(yīng)樣品各6份(空白血漿來自6只不同的大鼠,在最后上清液中按照比例加入質(zhì)控樣品工作液),進樣分析。計算基質(zhì)效應(yīng)樣品和純?nèi)芤簶悠分心繕?biāo)分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子,再以目標(biāo)分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子,得到經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。

    2.7.6 提取回收率 按“2.6”項下方法,制備低濃度質(zhì)控樣品和高濃度質(zhì)控樣品各6份,進樣,得到咪達唑侖在低濃度質(zhì)控樣品和高濃度質(zhì)控樣品中的響應(yīng)值(R質(zhì)控樣品),按照“2.7.5”項下的方法,制備低濃度和高濃度的基質(zhì)效應(yīng)樣品各6份,進樣,得到咪達唑侖在低濃度基質(zhì)效應(yīng)樣品和高濃度基質(zhì)效應(yīng)樣品中的響應(yīng)值(R基質(zhì)效應(yīng)),以R質(zhì)控樣品/ R基質(zhì)效應(yīng)得到咪達唑侖的回收率,計算RSD值評價回收率。

    2.7.7 穩(wěn)定性 根據(jù)實驗中樣品的儲存時間,需考察樣品在4 ℃儲存24 h和36 h、樣品在自動進樣器溫度下儲存24 h和36 h、樣品在-20 ℃儲存2周和3周共六種不同情況下的穩(wěn)定性。按照“2.6”項下的方法制備低濃度質(zhì)控樣品(6 ng·mL-1)和高濃度質(zhì)控樣品(375 ng·mL-1)各3份,在所評價的儲存條件下儲存后進樣分析,將測得濃度與標(biāo)示濃度比較。

    3 結(jié)果

    3.1 選擇性 咪達唑侖及皮質(zhì)酮(內(nèi)標(biāo))的提取離子流圖如圖1所示。由表1可見,干擾組分的響應(yīng)值低于定量下限樣品中咪達唑侖響應(yīng)值的20%,并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%,符合生物樣品定量分析方法的要求。

    A.空白血漿樣品;B.空白血漿樣品+混標(biāo)+內(nèi)標(biāo);C.尾靜脈注射探針底物后1 h的血漿樣品+內(nèi)標(biāo)圖1 咪達唑侖及皮質(zhì)酮(內(nèi)標(biāo))的提取離子流色譜圖

    表1 咪達唑侖及皮質(zhì)酮(內(nèi)標(biāo))在空白血漿樣品和定量下限樣品中的響應(yīng)值

    3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 由表2可見,校正標(biāo)樣的準(zhǔn)確度均在±15%以內(nèi),定量下限在±20%以內(nèi),符合生物樣品定量分析方法的要求;咪達唑侖在濃度范圍為2.5~500 ng·mL-1的線性回歸方程為Y=0.033X+0.266(r=0.994),線性良好。

    3.3 精密度和準(zhǔn)確度 質(zhì)控樣品的批內(nèi)和批間精密度均小于15%,批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度均在±15%以內(nèi),定量下限樣品的批內(nèi)和批間精密度均小于20%,批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度均在±20%以內(nèi),符合生物樣品定量分析方法的要求,結(jié)果見表3。

    表2 血漿校正標(biāo)樣中測定咪達唑侖的準(zhǔn)確度

    表3 質(zhì)控樣品和定量下限樣品的準(zhǔn)確度和精密度

    3.4 殘留 由表4可見,在定量上限樣品后所注射的空白樣品中,咪達唑侖的殘留值不超過定量下限的20%,且不超過內(nèi)標(biāo)的5%,符合生物樣品定量分析方法的要求。

    表4 咪達唑侖和皮質(zhì)酮(內(nèi)標(biāo))在空白血漿樣品中的殘留值

    3.5 基質(zhì)效應(yīng) 進樣分析結(jié)果表明,低濃度和高濃度質(zhì)控樣品中咪達唑侖從6批基質(zhì)計算的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)分別為5.65%、4.54%,均小于15%,表明基質(zhì)效應(yīng)符合生物樣品定量分析方法的要求。

    3.6 提取回收率 提取回收率實驗結(jié)果見表5,由表5可見,低濃度樣品和高濃度樣品的平均提取回收率分別為80.02%、78.19%,RSD值分別為3.94%、4.18%,均小于15%,表明提取回收率符合生物樣品定量分析方法的要求。

    3.7 穩(wěn)定性 由表6可見,血漿樣品在4 ℃儲存24 h和36 h、樣品在自動進樣器溫度下放置24 h和36 h、樣品在-20 ℃儲存2周和3周共6種不同情況下,所測得的咪達唑侖濃度的準(zhǔn)確度均在±15%范圍內(nèi),表明穩(wěn)定性良好。

    表5 血漿樣品中咪達唑侖的提取回收率

    3.8 藥動學(xué)參數(shù) 各組咪達唑侖的平均藥時曲線見圖2、藥動學(xué)參數(shù)見表7。由表7可見,與對照組比較,柚皮苷4個劑量組的咪達唑侖的藥代動力學(xué)參數(shù)AUC0~t、AUC0~∞、MRT0~t、MRT0~∞、t1/2、V、Cl和Cmax均無顯著性差異(P>0.05)。說明口服劑量在50~500 mg·kg-1范圍內(nèi)的柚皮苷給藥7 d對大鼠體內(nèi)CYP3A4活性無明顯影響。

    表6 血漿樣品中咪達唑侖的穩(wěn)定性考察

    圖2 咪達唑侖的平均藥時曲線圖(n=7)

    4 討論

    近年來,柚皮苷因具有廣泛的藥理活性而受到關(guān)注,大量研究表明,柚皮苷或柚皮素具有抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、改善神經(jīng)功能障礙、抗炎、改善糖脂代謝紊亂、抗動脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌等多種藥理作用[17-18]。由于柚皮苷廣泛存在于葡萄柚、桔、橙等水果植物及化橘紅、骨碎補、枳實、枳殼、橘紅、菝葜、枸櫞等中藥材中[6-7],因此,研究柚皮苷與其他藥物之間的相互作用是十分必要的。

    表7 咪達唑侖藥代動力學(xué)參數(shù)(n=7)

    在藥物代謝研究中,液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用廣泛,其具有操作簡單、分析速度快、所需樣品量少、靈敏度高、特異性好、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好等特點[19]。本文根據(jù)《中國藥典》2015年版(四部)中的“9012-生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則”,采用一種基于探針底物法和高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法的方法來測定大鼠血漿中咪達唑侖的含量,評價了柚皮苷對大鼠肝臟細(xì)胞色素P450 同工酶CYP3A1/2代謝活性的影響,結(jié)果表明,與對照組比較,柚皮苷四個劑量組(50、125、250和500 mg·kg-1)的咪達唑侖的主要藥代動力學(xué)參數(shù)AUC0~t、AUC0~∞、MRT0~t、MRT0~∞、t1/2、V、Cl和Cmax均無顯著差異,說明柚皮苷連續(xù)灌胃給藥7 d(給藥劑量在50~500 mg·kg-1范圍內(nèi))對大鼠肝臟CYP3A1/2酶活性無明顯影響。有文獻報道[20],柚皮苷及其苷元柚皮素會抑制腸道某些藥物轉(zhuǎn)運體(OATPs轉(zhuǎn)運體、P-gp)的活性,因此,為排除柚皮苷可能對探針?biāo)幬镞溥_唑侖的吸收產(chǎn)生復(fù)雜的影響,在本實驗中,咪達唑侖采用靜脈注射的方式給藥。

    由于CYP3A4亞型酶的表達調(diào)控機制存在明顯種屬差異[21],因此,不能簡單地由動物實驗結(jié)果外推到人體。關(guān)于柚皮苷對人體內(nèi)CYP3A4亞型酶活性的影響,仍需要進一步研究并加以驗證。

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