白酒酒醅中兩種多肽的鑒定及其抗氧化和降血壓功能評(píng)價(jià)

孫金沅，姜云松，劉國(guó)英，李賀賀，吳繼紅，孫嘯濤，孫寶國(guó)*

1(北京工商大學(xué)，北京食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048) 2(北京工商大學(xué)，食品質(zhì)量與安全北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048) 3(安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州，236800)

酒醅是白酒釀造過(guò)程中，高粱、小麥、糯米、玉米、大麥等原料蒸煮后與糖化發(fā)酵劑混合，并在微生物的作用下發(fā)酵后，預(yù)備蒸餾取酒的原料[1]。由于制作酒醅的原料中存在較高的蛋白含量，其中一定含量的蛋白能夠在微生物的作用下分解為多肽。目前，對(duì)酒醅中功能性多肽的分析研究較少，僅有課題組前期研究中在芝麻香型白酒酒醅中分離鑒定出了多肽Val-Asn-Pro(VNP)和Tyr-Gly-Asp(YGD)，并進(jìn)行了初步的生物活性研究[2]。

生物活性肽的來(lái)源廣泛，可以直接從動(dòng)植物蛋白中獲取，如魚(yú)肉[3]、火腿[4]、稻米[5]和麥芽[6]等。目前，多肽常用的提取分離方法有酶解法[7]、堿提酸沉淀法[8]、堿酶兩步法[9]、超聲輔助酶解法[10]等復(fù)合法以及微生物發(fā)酵法[11]，常用的分離純化方法有大孔吸附樹(shù)脂純化[12]、凝膠層析[13]、制備型液相色譜和蛋白純化儀[14]，而多肽結(jié)構(gòu)鑒定通常采用氨基酸分析儀[15]、高效液相-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(high performance liquid chromatography- quadruple-time of fly -mass spectrum/mass spectrum, HPLC-Q-TOF-MS/MS)[16]、聚丙烯酰胺凝膠電泳[17]、基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜[18]等方法。

抗氧化功能是多肽具有的主要功能之一[19]。2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸法(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl, DPPH)、還原力法、氧化自由基吸收能力法(oxygen radical absorbance capacity, ORAC)和亞鐵螯合力測(cè)定法[20]等是較為常用的抗氧化能力測(cè)定方法。隨著對(duì)多肽研究的不斷深入[21-22]，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制活性同樣也是部分多肽所具有的功能之一， ACE抑制肽可以同時(shí)阻礙ACE催化水解血管緊張素I以及使緩激肽失活這2種生化反應(yīng)過(guò)程，來(lái)達(dá)到降血壓的作用[22]。目前，吳繼紅等[23]已從白酒中鑒定出具有ACE抑制活性的多肽脯氨酸-組氨酸-脯氨酸(PHP)，其半抑制濃度(ICSO)為446 mmol/L。

多肽沸點(diǎn)較高，但是由于白酒采用獨(dú)特的固態(tài)甑桶蒸餾方式，蒸餾過(guò)程中甑內(nèi)酒醅中的酒精及其他微量成分經(jīng)過(guò)多次汽化-冷凝-汽化的過(guò)程達(dá)到多組分濃縮和提取的效果，也會(huì)有少量難揮發(fā)的組分進(jìn)入酒中[24]，例如多肽以及一些高沸點(diǎn)的酸類(lèi)等，但是含量非常少。本研究將在前期對(duì)芝麻香型白酒酒醅研究[2]的基礎(chǔ)上，以濃香型白酒古井貢酒酒醅為研究對(duì)象進(jìn)行未知多肽的提取、純化和鑒定，并對(duì)其體外抗氧化活性和ACE抑制活性進(jìn)行測(cè)定，旨在進(jìn)一步研究白酒酒醅中對(duì)人體健康有益的物質(zhì)，為后期通過(guò)改進(jìn)蒸餾工藝增加其在白酒中的含量，為提高白酒的健康屬性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒酒醅，由安徽古井貢酒股份有限公司提供；XAD-16非離子型大孔樹(shù)脂、NaOH(純度≥ 96%)，麥克林上海有限公司；Sephadex G-15 凝膠，北京索萊寶科技有限公司；甲酸(HPLC級(jí)，純度≥ 99%)、乙腈(HPLC級(jí)，純度≥ 99.9%)，北京迪馬科技有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(hyaluronyl-histidyl-leucine，HHL)、馬尿酸(hippuric acid，HA),(純度≥99.0%)，上海源葉生物科技有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(1UN)、ABTS試劑盒、DPPH試劑盒、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, Trolox)，美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司;Val-Pro-Asp(VPD)、Leu-Gly-Ala(KGP)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥ 98%)，上海吉爾生化有限公司；H2SO4(純度≥ 98%)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；FeCl2(純度>98%)，北京伊諾凱科技有限公司；FeCl3(純度≥98%)、鐵氰化鉀(純度≥99.5%)、過(guò)硫酸鉀(純度≥ 98%)、苯酚，西隴科學(xué)股份有限公司；2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(2,2′-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride，AAPH) (純度≥ 98%)，比利時(shí)Acros試劑公司；EDTA Na2(純度≥ 99%)，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；pH值為7.4和6.6的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline， PBS)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；啡咯嗪(ferrozine)，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；三氯乙酸，阿法埃莎(中國(guó))化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Pellicon超濾裝置，德國(guó)Merck Millipore公司；1 kDa超濾膜，EMD Millipore有限公司；MB99-2自動(dòng)液相色譜分離層析儀、HD-3紫外檢測(cè)器，上海青浦滬西儀器廠；Agilent1 260液相色譜、Agilent 1200制備型液相、Agilent1 290高效液相-四級(jí)桿-6 530飛行時(shí)間質(zhì)譜，美國(guó)Agilent公司；Xbridge Peptide BEH C18反相色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Xbridge Peptide BEH C18反相色譜柱(150 mm×10 mm，5 μm)，愛(ài)爾蘭Waters公司；FD-1B-80型冷凍干燥機(jī)，南京普森儀器；Molecule M2酶標(biāo)儀，美國(guó)分子儀器有限公司。

1.3 酒醅中肽的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取-20 ℃冷凍狀態(tài)保存的酒醅400 g，在50 ℃下烘干至恒重，粉碎后與色譜純正己烷以1∶5(g∶mL)的比例混合，脫脂3 h，烘干后加入到pH值為9的超純水中，在57 ℃下提取1 h后，超聲輔助(40 kHz、500 W)提取33 min，抽濾，得到濾液，濃縮后得到酒醅水溶性提取物。向其中加入等體積15%(體積分?jǐn)?shù))的三氯乙酸，混合靜置1 h，在4 ℃、6 500 r/min條件下離心25 min，沉淀大分子蛋白質(zhì)，所得上清液即為酒醅肽提取液。

1.4 超濾

在室溫，壓力0.05 MPa條件下，使用1 kDa超濾膜應(yīng)用Pellicon超濾裝置對(duì)酒醅水溶性提取物進(jìn)行超濾，選取分子質(zhì)量<1 kDa的組分[25]。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在0.09 MPa，50 ℃條件下濃縮，隨后-4 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)酒醅肽的分級(jí)洗脫及除糖

根據(jù)ZHANG等[2]的方法選用XAD-16樹(shù)脂對(duì)多肽提取液進(jìn)行分級(jí)洗脫,并在50 ℃，0.1MPa條件下真空濃縮得到除去糖分的酒醅多肽溶液。

1.6 凝膠過(guò)濾層析純化酒醅肽

將Sephadex G-15 凝膠裝入Φ1.6 cm×70 cm層析柱中，加入4 mL樣品，用超純水以0.5 mL/min的速度進(jìn)行洗脫，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)214 nm下吸光度，按峰收集洗脫液，并將各組分進(jìn)行冷凍干燥獲得多肽凍干粉。

1.7 半制備高效液相色譜制備酒醅肽

將各個(gè)組分樣品凍干粉配制成5 000 mg/L的樣品溶液，經(jīng)0.45 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾，手動(dòng)進(jìn)樣。色譜條件參考前期的研究方法[2]。

1.8 HPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定多肽氨基酸序列及含量測(cè)定

在HPLC-Q-TOF-MS/MS上對(duì)各個(gè)純化組分進(jìn)行序列鑒定。具體色譜條件與ZHANG等[2]的方法一致。采用外標(biāo)法測(cè)定酒醅提取液中多肽濃度，通過(guò)合成標(biāo)準(zhǔn)品配制50，100，250，500，1 000，2 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并通過(guò)高效液相色譜建立峰面積-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測(cè)定樣品中多肽的濃度。高效液相色譜方法參考前期的工作[2]。

1.9 體外抗氧化活性測(cè)定

氨基酸殘基位置對(duì)多肽抗氧化能力的影響實(shí)驗(yàn)同樣以ABTS、DPPH、ORAC、還原力和亞鐵螯合力5種方法進(jìn)行測(cè)定。合成另外4條與已經(jīng)鑒定出的多肽氨基酸組成相同，但排列順序不同的多肽，即Gly-Lys-Pro, Gly-Pro-Lys、Val-Asp-Pro、Pro-Asp-Val，對(duì)它們采用與上述一致的方法進(jìn)行抗氧化能力的測(cè)定。

1.10 ACE抑制活性的體外評(píng)價(jià)方法

參考吳繼紅等[23]采用的方法，使用高效液相色譜法測(cè)定兩種多肽的ACE抑制活性。

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)定實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。數(shù)據(jù)通過(guò)IBM SPSS Statistics 19.0進(jìn)行單因素方差分析，并以Duncans多重比較法進(jìn)行顯著性差異的分析,不同字母表示不同組別之間存在顯著性差異(P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹(shù)脂XAD-16分離純化酒醅肽

采用對(duì)酒醅中多肽吸附效果較好的XAD-16樹(shù)脂對(duì)樣品進(jìn)行分離，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看到，在體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、和60%的乙醇水溶液的解吸過(guò)程中，整體出峰情況呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，出峰效果較為明顯。

a-20%乙醇解吸；b-40%乙醇解吸；c-60%乙醇解吸圖1 大孔吸附樹(shù)脂XAD-16洗脫圖Fig.1 Macroporous adsorption resin XAD-16 elution diagrams

2.2 凝膠過(guò)濾層析分離純化酒醅肽

為進(jìn)一步分離純化，將已除去糖分的酒醅肽溶液通過(guò)凝膠色譜依據(jù)分子質(zhì)量進(jìn)行分離，最終得出經(jīng)過(guò)體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇水溶液洗脫后的組分分離效果較好，并在其P3組分中分離出A、B、C 3種組分，如圖2所示。

2.3 半制備高效液相色譜分離純化酒醅多肽

使用半制備液相色譜將經(jīng)過(guò)凝膠層析的A、B、C 3個(gè)組分進(jìn)行分離，為了保證每個(gè)組分的純度，舍棄分離度較低、雜峰過(guò)多的組分。從圖3中可以看出，通過(guò)半制備高效液相色譜分離過(guò)后，凝膠柱洗脫分離組分A中收集到了A1～A5五個(gè)組分，組分B中收集到了B1～B2兩個(gè)組分，組分C中收集到了C1、C2兩個(gè)組分。

圖2 40%乙醇洗脫組分凝膠層析色譜圖Fig.2 Gel permeation chromatogram of 40% ethanol elution fractions

a-A組分半制備液相圖;b-B組分半制備液相圖;c-C組分半制備液相圖圖3 A、B和C組分半制備液相色譜圖Fig.3 Semi-preparation liquid chromatography diagrams of components A, B and C

2.4 HPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定多肽序列

通過(guò)Agilent Masshunter B.06.00電腦工作站對(duì)A、B、C 3個(gè)組分中的子組分分別進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，其中發(fā)現(xiàn)A4中m/z=330.180 5([M+H+])的組分峰。將m/z=329.180 5的離子作為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜解析。母離子m/z=330.180 5的MS/MS結(jié)果如圖4所示。

圖4 VPD MS/MS質(zhì)譜圖Fig.4 MS/MS spectrum of VPD

采用從頭測(cè)序法解析各個(gè)離子的二級(jí)質(zhì)譜碎片信息。肽鍵的酰胺鍵斷裂，C端形成y型離子，N端形成b型離子。分析母離子m/z=329.180 5的二級(jí)質(zhì)譜圖推測(cè)m/z=197.090 4的離子碎片為y2離子，可能是Val-Pro;推測(cè)m/z=229.112 1的離子碎片為b2離子，可能是Pro-Asp;推測(cè)m/z=116.070 2的離子碎片為y1離子，可能是Val；推測(cè)m/z=132.115 6的離子碎片為b1離子，可能是Asp。綜上所述，推測(cè)m/z=330.180 5的氨基酸序列可能是Val-Pro-Asp。采用同樣的方法發(fā)現(xiàn)B1中m/z=300.95([M+H+])的組分峰。將m/z=300.95的離子作為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜解析。母離子m/z=300.95的MS/MS結(jié)果如圖5所示。分析母離子m/z=300.95的二級(jí)質(zhì)譜圖推測(cè)m/z=114.11的離子碎片為b1離子，可能是Pro;推測(cè)m/z=186.29的離子碎片為y2離子，可能是Lys-Gly；推測(cè)m/z=242.29的離子碎片為b2離子，可能是Gly-Pro。綜上所述，推測(cè)m/z=300.95的氨基酸序列可能是Lys-Gly-Pro。

圖5 KGP MS/MS質(zhì)譜圖Fig.5 MS/MS spectrum of KGP

與合成的多肽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，從保留時(shí)間和質(zhì)譜結(jié)構(gòu)上并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別，因此可以確定，鑒定出的兩種多肽的結(jié)構(gòu)分別為Val-Pro-Asp和Lys-Gly-Pro。

2.5 酒醅中KGP和VPD提取含量的計(jì)算

對(duì)首次從酒醅中鑒定出的兩種多肽KGP和VPD的含量通過(guò)高效液相色譜外標(biāo)法進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖6所示，最終測(cè)得酒醅提取液中VPD的含量為 569.5 mg/L，而KGP的含量為463.9 mg/L。目前已有研究[23]檢測(cè)出白酒中存在多肽Pro-His-Pro(PHP)，但其存在于白酒中的含量極低。酒醅中存在的相對(duì)較高含量的多肽可以為后續(xù)調(diào)整蒸餾條件，提高多肽蒸餾入酒的含量奠定基礎(chǔ)。

2.6 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用ABTS、DPPH、ORAC、還原力、亞鐵離子螯合能力5種抗氧化能力評(píng)價(jià)方法對(duì)多肽的抗氧化能力進(jìn)行了測(cè)定，Trolox和EDTA-Na2作為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑，結(jié)果如圖7所示。

a-VPD標(biāo)準(zhǔn)曲線;b-KGP標(biāo)準(zhǔn)曲線;c-多肽提取量圖6 KPG和VPD標(biāo)準(zhǔn)曲線及提取量Fig.6 Standard curves and extraction contents of KPG and VPD注：組間不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

a-KGP、GKP、GPK抗氧化能力;b-VPD、VDP、PDV抗氧化能力圖7 多肽的體外抗氧化活性Fig.7 The results of antioxidant activity of peptides in vitro

由圖7可以看出，VPD的ABTS自由基清除能力要強(qiáng)于KGP，這可能與VPD兩端的殘基Val-和Asp-與ABTS作用，從而抑制了ABTS+·的形成有關(guān)。在ORAC實(shí)驗(yàn)中VPD的螯合能力同樣略高于KGP。在DPPH實(shí)驗(yàn)中VPD的TE值(0.778 μmol TE/μmol VPD)高于KGP的TE值(0.656 μmol TE/μmol KGP)。兩種多肽的還原力和亞鐵螯合能力實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出一定的活性，VPD和KGP的TE值和EE值分別為0.445 μmol TE/μmol VPD，0.369 μmol EE/μmol VPD和0.448 μmol TE/μmol KGP，0.258 μmol EE/μmol KGP。從以上結(jié)果可以看出，Val-和Asp-相比于Lys-和Pro-在多肽兩端時(shí)能夠表現(xiàn)出更高的ABTS、DPPH自由基清除能力、還原力以及螯合力。

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，VPD和KGP兩種多肽在3種濃度下均表現(xiàn)出了一定的體外抗氧化能力。兩種多肽之間存在的抗氧化能力上的差異很可能是由于多肽C端和N端的氨基酸殘基的不同造成的。同種多肽之間的氨基酸排列順序的差異也會(huì)對(duì)最終的抗氧化能力造成一定的影響。鑒于2種多肽是從酒醅樣品中分離提取鑒定出來(lái)的，氨基酸的種類(lèi)已經(jīng)決定，因此對(duì)多肽中氨基酸排列對(duì)多肽抗氧化性造成的影響進(jìn)行了一定的研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中測(cè)得了具有明顯不同的排列順序的另外2種多肽的抗氧化活性，并與原始多肽的抗氧化能力進(jìn)行了比較。在KGP多肽中分別選擇了GKP和GPK作為不同氨基酸排列的多肽進(jìn)行了5種抗氧化能力的測(cè)定。其中在ABTS實(shí)驗(yàn)中GKP表現(xiàn)出了最強(qiáng)的抗氧化能力，其TE值為1.384 μmol TE/μmol GKP，同樣GPK也表現(xiàn)出了強(qiáng)于KGP的抗氧化能力，其TE值為1.256 μmol TE/μmol GPK。而在DPPH實(shí)驗(yàn)中,GKP和GPK的抗氧化能力分別為0.457和0.531 μmol TE/μmol GPK，兩者都低于KGP，因此Lys-在C端和Pro-在N端能夠起到強(qiáng)DPPH自由基清除能力。在ORAC實(shí)驗(yàn)中所表現(xiàn)出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ABTS中基本一致，GKP具有最高的TE值1.236 μmol TE/μmol GKP，GPK略低，TE值為1.115 μmol TE/μmol GPK。在還原力實(shí)驗(yàn)中GKP具有最高的TE值為0.665 μmol TE/μmol GKP，而GPK的還原力TE值最弱為0.236 μmol TE/μmol GPK。在亞鐵螯合能力實(shí)驗(yàn)中GPK表現(xiàn)出了相對(duì)較強(qiáng)的能力，其EE值為0.334 μmol EE/μmol GPK，而GKP的亞鐵螯合能力最低EE值為0.158 μmol EE/μmol GPK。在VPD多肽中分別選擇了VDP和PDV作為不同氨基酸排列的多肽進(jìn)行了5種抗氧化能力的測(cè)定。不同于KGP，在VPD的實(shí)驗(yàn)中，3種多肽并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的差異性，僅在DPPH實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了最為明顯的區(qū)別，其中VDP表現(xiàn)出了3種多肽中最強(qiáng)的能力，其TE值為0.961 μmol TE/μmol VDP，PDV次之，其TE值為0.884 μmol TE/μmol PDV，兩者都高于酒醅中已鑒定出的多肽VPD。在亞鐵螯合能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中,VDP表現(xiàn)出了略強(qiáng)于其他兩種多肽的抗氧化能力，其EE值為0.387 μmol EE/μmol VDP，其他兩種多肽的抗氧化能力并沒(méi)有顯著性的差異。

通過(guò)對(duì)以上的結(jié)果進(jìn)行分析可以得出，多肽之間不同的氨基酸排列順序?qū)τ诙嚯牡目寡趸芰τ兄欢ǔ潭鹊挠绊?。在KGP結(jié)構(gòu)關(guān)系實(shí)驗(yàn)中，以GKP為基準(zhǔn)對(duì)比其他兩種多肽，GKP在AAPH實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了最強(qiáng)的抗氧化能力，由此可以推斷Pro-在N端和Gly-在C端所表現(xiàn)出的ABTS自由基清除能力要更強(qiáng)一些。在DPPH實(shí)驗(yàn)中酒醅肽KGP具有最強(qiáng)的抗氧化能力，由此推斷Lys-在N和C端都可以表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。在ORAC實(shí)驗(yàn)中可以看出GKP具有最強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)比3種多肽結(jié)構(gòu)可以推斷出Gly-在C端和Pro-在N端具有較高的抗氧化能力。在還原力實(shí)驗(yàn)中可以推斷出Gly-在C端對(duì)還原力具有一定的促進(jìn)作用。在亞鐵螯合力實(shí)驗(yàn)中可以看出，Lys-在C端和N端都具有較強(qiáng)的抗氧化能力。在VPD的結(jié)構(gòu)關(guān)系實(shí)驗(yàn)中，3種多肽只有在DPPH和亞鐵螯合能力實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了一定的差異，通過(guò)比較可以得出，Pro-在多肽的兩端是能夠表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。在亞鐵螯合能力實(shí)驗(yàn)中同樣可以推斷出Pro-在N端時(shí)能夠體現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的抗氧化能力。以上研究為后續(xù)依據(jù)氨基酸的種類(lèi)和排列順序初步確定酒醅中多肽的抗氧化能力提供了參考。

2.7 ACE半抑制濃度測(cè)定

用 0.1 mol/L pH 8.3 的硼酸-硼砂緩沖液配制40、20、10、5及2.5 mmol/L的Lys-Gly-Pro和Val-Pro-Asp標(biāo)準(zhǔn)品溶液來(lái)測(cè)定其對(duì)ACE酶的半抑制濃度IC50。以lg(ACEI)對(duì)lg[R/(1-R)]作圖，如圖8所示，得到KGP的方程y=0.164 5x-0.176 5，當(dāng)Y=0時(shí)X為1.07，IC50為2.91 mmol/L；VPD的方程y=0.178 9x-0.134 2，當(dāng)Y=0時(shí)，X為0.75，IC50為2.11 mmol/L。因此兩種多肽具有一定的ACE抑制活性。

a-KGP的ACE抑制活性標(biāo)準(zhǔn)曲線;b-VPD的ACE抑制活性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖8 KGP和VPD的ACE抑制活性標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 ACE inhibitory activity standard curves of KGP and VPD

多肽的ACE抑制活性的強(qiáng)弱與組成多肽片段的氨基酸的種類(lèi)、疏水性以及其在肽鏈中的位置都密切相關(guān)。CHEUNG等[29]認(rèn)為，ACE抑制肽的活性主要取決于C端的氨基酸種類(lèi)，若C端氨基酸為芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)和脯氨酸時(shí)，其抑制活性較高。此外，N端為疏水性的纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或堿性氨基酸，與ACE的親和力較強(qiáng)，因此抑制活性也較高。而高親水性氨基酸由于親水性使其無(wú)法接近ACE活性部位，從而導(dǎo)致氨基酸的抑制活性較弱或無(wú)抑制活性[30]。本研究中VPD和KGP肽段具有一定的ACE抑制活性，推測(cè)可能與其結(jié)構(gòu)中C端存在的脯氨酸、天冬氨酸和N端存在的疏水性纈氨酸、賴氨酸有關(guān)。

3 結(jié)論

本文以濃香型白酒古井貢酒酒醅為研究對(duì)象，通過(guò)超濾、大孔吸附樹(shù)脂、凝膠層析和反向高效液相色譜法等方法對(duì)酒醅水溶性提取物進(jìn)行多步分離制備，從而獲得高純度肽。實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC-Q-TOF-MS/MS首次鑒定出兩種肽，其氨基酸序列分別為Val-Pro-Asp和Lys-Gly-Pro，并發(fā)現(xiàn)2種多肽具有一定的抗氧化能力和ACE抑制能力，以及不同種類(lèi)的氨基酸處于C端和N端時(shí)對(duì)抗氧化能力有一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)酒醅中存在具有生物活性的小分子肽，這將為白酒企業(yè)后續(xù)改進(jìn)蒸餾方式從而增加白酒中多肽含量提供理論基礎(chǔ)。

在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，需要研究KGP和VPD兩種多肽中的每一種氨基酸分別在C端和N端時(shí)對(duì)抗氧化能力的影響，以及這2種多肽的細(xì)胞水平和動(dòng)物水平的抗氧化和降血壓實(shí)驗(yàn)，同時(shí)酒醅中存在的其他尚未確定結(jié)構(gòu)及活性的多肽仍有待研究。