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    兩階段轉速控制對糞腸乳酸球菌合成γ-氨基丁酸的影響

    2019-10-09 01:47:34張敏薛正蓮余飛劉艷王洲
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年17期
    關鍵詞:糞腸菌體球菌

    張敏,薛正蓮,余飛,劉艷,王洲

    (安徽工程大學 生物與化學工程學院,微生物發(fā)酵安徽省工程技術研究中心,安徽 蕪湖,241000)

    γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然非蛋白質類氨基酸,存在于動物、植物及微生物內,具有降血糖、降血壓及抗抑郁等重要的生理功能,目前主要作為功能性食品應用,在市場上具有較廣前景[1-4]。其主要是由谷氨酸脫羧酶(GAD)催化L-谷氨酸形成。目前獲取GABA的方法主要為化學合成法、植物富集法及微生物發(fā)酵法[5-7],但化學合成的GABA不能用于食品領域,只能用于化工和醫(yī)藥領域;植物富集法得到的GABA產量較低,不能大量提取;通過微生物發(fā)酵能夠產生大量的GABA,已報道的有酵母菌、乳酸菌、大腸桿菌[8-10]等,因大腸桿菌存在安全隱患,乳酸菌為食用菌且口感好,受到人們的廣泛青睞,因此利用乳酸菌生產GABA較為常見。

    發(fā)酵動力學能夠研究發(fā)酵過程中底物的消耗速率、菌體的生長速率與產物的合成速率之間的關系,通過分析發(fā)酵動力學,可進一步了解微生物的生理特性、菌體生長與產物合成的最適條件,為后續(xù)工業(yè)化中發(fā)酵罐的過程控制以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供理論依據[11-12]。

    糞腸乳酸球菌是兼性厭氧微生物,在有氧和無氧條件下均可生長,但在厭氧條件可促進GAD表達,并有利于乳酸菌的GABA合成,因而搖瓶水平一般采取靜置發(fā)酵的形式[13-14]。但是轉速直接影響基質的利用,通常靜置發(fā)酵時菌株生長緩慢且生物量較低,限制了GABA的大量合成。本文通過分析不同轉速下(0和100 r/min)的發(fā)酵曲線和動力學參數,基于不同轉速發(fā)酵過程中菌體生長及產物合成的變化,發(fā)現72 h、0 r/min產量最高,穩(wěn)定期、100 r/min生物量最高。提出了兩階段轉速調控策略,并對影響此調控策略的發(fā)酵條件(階段時間、裝液量及轉速)進行正交優(yōu)化,進一步提高糞腸乳酸球菌合成GABA的產量,為進一步大規(guī)模生產GABA提供了基礎條件。

    1 材料與方法

    1.1 菌種

    糞腸乳酸球菌En1202由本實驗室保藏。

    1.2 試劑與材料

    新華一號濾紙、正丁醇、冰醋酸、茚三酮、無水乙醇、CuSO4·5H2O,均購于上海生工(分析純)。

    層析液:V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=2∶1∶1,并在層析液中添加8 g/L的茚三酮。

    洗脫液:V(75%乙醇)∶V(6 g/L CuSO4·5H2O)=39∶1。

    1.3 培養(yǎng)基

    斜面培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母浸出粉10,葡萄糖5,吐溫-80 0.1 mL,K2HPO40.2,檸檬酸二銨0.2,MgSO40.2,MnSO40.05,三水合乙酸鈉5,瓊脂粉20,pH 6.5;115 ℃,滅菌30 min。

    種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母浸出粉10,葡萄糖5,吐溫-80 0.1 mL,K2HPO40.2,檸檬酸二銨0.2,MgSO40.2,MnSO40.05,三水合乙酸鈉5,pH 6.5;115 ℃,滅菌30 min,100 mL/250 mL搖瓶。

    發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨5,酵母浸出粉5,葡萄糖10,丁二酸鈉5,MSG 10,pH 6.5;115 ℃,滅菌30 min,75 mL/250 mL搖瓶。

    1.4 培養(yǎng)方法

    將斜面活化后的糞腸乳酸球菌接種于種子培養(yǎng)基中,30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。以10 %(體積分數)接種量將種子液接入75 mL/250 mL搖瓶中,30 ℃靜置或100 r/min厭氧發(fā)酵72 h。

    1.5 分析方法

    1.5.1 生物量測定

    按1.4培養(yǎng)方法,每隔2 h取樣在酶標儀600 nm處檢測吸光度,并將菌液適當稀釋后涂布于斜面上于30 ℃培養(yǎng)48 h,觀察并計算平板單菌落數(×109CFU/mL),建立菌液吸光度與生物量的標準曲線[15],后續(xù)操作按此方法測定生物量。

    1.5.2 GABA產量的測定

    采用紙層析-酶標儀法[16],用微量取樣器吸取1 μL發(fā)酵上清液滴在濾紙上,待濾紙干后將濾紙放進已飽和12 h的層析缸內進行層析,一段時間后取出并吹干,然后將GABA斑點剪下并放進5 mL洗脫液中洗脫,洗脫條件為40 ℃、80 r/min洗脫30 min,用酶標儀于512 nm處測定吸光度。

    1.5.3 殘余還原糖的測定

    利用3,5-二硝基水楊酸法檢測[17]。

    2 結果與分析

    2.1 菌體生物量標準曲線的建立

    圖1 菌體生物量標準曲線Fig.1 Standard curve of bacterial biomass

    由圖1可見,糞腸乳酸球菌菌液的吸光度與平板單菌落數(×109CFU/mL)之間的線性關系良好,回歸方程為y=2.263 5×x-0.202 9 (R2=0.997 8),后續(xù)試驗的菌體生物量可用平板單菌落數(×109CFU/mL)表示。

    2.2 不同轉速下GABA發(fā)酵曲線及動力學參數分析

    試驗研究了不同的轉速下(0和100 r/min)菌體生長與產物合成的關系,結果見圖2,圖中各試驗點為3組重復試驗后的平均值±標準差。可以看出,當轉速為0時,菌體生長緩慢,32 h才達到穩(wěn)定期(此時生物量為(2.755±0.055)×109CFU/mL,穩(wěn)定期僅能維持4 h);GABA產量在72 h達到最大((5.985±0.116)g/L)且趨于穩(wěn)定,此時葡萄糖已基本消耗殆盡,無法繼續(xù)提供菌體生長所需能量,菌體大量衰亡(此時生物量僅為(0.751±0.017)×109CFU/mL),雖然菌體自溶會釋放一定量的GAD,但由于之前GABA的積累、GAD參與的耐酸機制[18](主要體現在2方面:一是細胞進入GABA合成期時,谷氨酸脫羧合成GABA需要消耗H+,二是生成的產物GABA的堿性強于底物L-谷氨酸)對環(huán)境pH起到了調節(jié)效果,pH呈上升趨勢,此時pH接近中性(pH=6.80±0.05),GAD失去活性[19],無法繼續(xù)催化L-谷氨酸合成GABA。

    圖2 不同恒定轉速條件下糞腸乳酸球菌產GABA發(fā)酵進程曲線Fig.2 Times courses of GABA production by Enterococcus lactic acid faecalis at various constant rotational speed

    而適當增加轉速(100 r/min)時,12 h內菌體迅速生長,20 h便達到穩(wěn)定期(此時生物量為(3.964±0.079)×109CFU/mL,穩(wěn)定期能維持28 h);GABA產量在72 h后仍再繼續(xù)增長,雖然此時葡萄糖已基本消耗殆盡,無法繼續(xù)提供菌體生長所需能量,菌體開始衰亡(此時生物量為(3.484±0.065)×109CFU/mL),發(fā)酵初期由于厭氧發(fā)酵導致乳酸等有機酸積累,引起pH下降并激活GAD開始生產GABA,雖然GAD參與的耐酸機制會對環(huán)境pH起到調節(jié)效果,使pH呈上升趨勢,但此時pH=4.70±0.04(LI等[20-24]研究發(fā)現發(fā)酵過程中控制pH=5.0左右,更有利于GABA的合成),還未衰亡的菌體仍可利用L-谷氨酸繼續(xù)合成GABA。

    綜上所述,最適菌體生長和GABA合成的最佳轉速并不一致,0 r/min有利于GABA的合成,100 r/min有利于菌體的生長,發(fā)酵過程中設定單一的轉速,不能使菌體生長和產物合成同時達到理想狀態(tài)。為在保證菌體生長的同時提高GABA產量,提出了一種兩階段轉速控制策略。

    2.3 不同轉速下發(fā)酵動力學模型的建立與分析

    發(fā)酵動力學是研究菌體生長、底物消耗以及產物生成之間的關系,通過數學建模的方法來分析參數變化及發(fā)酵規(guī)律,將復雜的發(fā)酵過程通過數學方程簡化,有利于進一步探究菌體新陳代謝過程,從而對發(fā)酵過程中的參數進行準確地預測或對現有工藝進行改進[11-12]。

    本試驗通過建立不同轉速下(0和100 r/min)的發(fā)酵動力學模型,比較不同轉速發(fā)酵過程中菌體生長及產物合成的變化,并驗證菌體生長與產物合成之間是否為偶聯或部分偶聯關系,為后續(xù)兩階段轉速調控策略的優(yōu)化提供理論基礎。

    2.3.1 菌體生長模型

    Logistic方程是典型的S型曲線,可以很好地反應菌體濃度的增加對自身生長產生的抑制作用,且達到穩(wěn)定期后菌體停止生長,因此微生物生長過程可以用Logistic方程來描述[25],如公式(1)所示:

    (1)

    式中:X,菌體生物量(×109CFU/mL);μm,最大菌體比生長速率(h-1);Xm,最大菌體濃度(×109CFU/mL)。

    2.3.2 產物生成模型

    菌體生長與產物形成之間的關系有3種,當α≠0,β=0時為一類發(fā)酵,又稱偶聯模型;當α≠0,β≠0時為二類發(fā)酵,又稱部分偶聯模型;當α=0,β≠0時為三類發(fā)酵,又稱非偶聯模型。由式2可知,菌體生長與產物合成之間符合部分偶聯型的特征,因此可以采用Luedeking-Piret方程來描述產物的積累過程并進一步驗證其是否為部分偶聯關系[25]:

    (2)

    式中:P,產物濃度(g/L);α,菌體生長有關的產物生成比例常數;β,菌體濃度有關的產物生成比例系數。

    2.3.3 底物消耗模型

    GABA發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗主要用于菌體生長及細胞代謝,假設葡萄糖參與產物的形成過程,那么還原糖消耗模型可以表示為公式(3)[26]:

    (3)

    式中:S,葡萄糖濃度,g/L;Yx/s,對基質的細胞得率系數;Yp/s,對基質的產物得率系數,即產物GABA得率系數;ms,微生物維持系數;此模型主要反映關鍵底物消耗與菌體生長、產物形成的關系。

    2.3.4 發(fā)酵動力學公式的求解

    當t=0時,X=X0,P=P0,S=S0求得的方程(4)、(5)和(6)分別為:

    (4)

    (5)

    (6)

    選取48 h的發(fā)酵參數作為試驗數據,此階段菌體生長達到穩(wěn)定期且有衰退趨勢,符合Logistic方程所描述的模型,用1stOpt軟件對上述動力學方程采用Levenberg-Marquardt加通用全局優(yōu)化算法,以方程誤差的平方和最小化為目標,無需設置初始值,根據試驗所得數據求出模型最優(yōu)參數估計值,結果見表1與表2。

    由表1和表2可以看出,0 r/min分批發(fā)酵的參數估計值明顯小于100 r/min,進一步說明0 r/min分批發(fā)酵比100 r/min分批發(fā)酵的合成GABA多,但生物量低;2種培養(yǎng)的參數估計值均不等于0,證實了菌體生長與產物合成之間為部分偶聯關系,部分相關型發(fā)酵過程較復雜,數學模型只能描述其動態(tài)趨勢;對于以獲得更大GABA產量的菌種培育工作來講,從1-3式可知,通過培養(yǎng)條件和培養(yǎng)工藝的改善,盡可能降低維持系數ms,獲得更大的u值及更長um維持時間,以及更高菌體生物量X,是提高GABA產量的有效手段,因此ms在工業(yè)上要求越小越好,所以100 r/min分批發(fā)酵相對0 r/min分批發(fā)酵更加耦合動力學模型;通過比較0與100 r/min分批發(fā)酵的實驗值與模型擬合值,從表3和表4可看出,細胞的生長、產物的合成和底物的消耗均能很好地與實驗值吻合,說明該模型均能較好地反映糞腸乳酸球菌在250 mL搖瓶水平上0和100 r/min分批發(fā)酵過程中的生物反應動力學。

    表1 0 r/min分批發(fā)酵動力學模型參數估計值Table 1 Parameter estimation of the shake flask (0 r/min)batch fermentation kinetics model

    表2 100 r/min分批發(fā)酵動力學模型參數估計值Table 2 Parameter estimation of the shake flask (100 r/min)batch fermentation kinetics model

    表3 0 r/min分批發(fā)酵實驗值與模型預測值比較Table 3 The experimental value of zhake flask (0 r/min) fermentation was compared with the predicted value

    表4 100 r/min分批發(fā)酵實驗值與模型預測值比較Table 4 The experimental value of shake flask(100 r/min) fermentation was compared with the predicted value

    表5 試驗因素水平表Table 5 Factor level table

    2.4 兩階段轉速控制策略發(fā)酵條件的優(yōu)化

    根據上述不同轉速下(0和100 r/min)GABA發(fā)酵曲線及動力學參數分析可知72 h、0 r/min時產量最高,穩(wěn)定期、100 r/min時生物量最高;結合不同轉速下發(fā)酵動力學模型的理論驗證,證實了菌體生長與產物合成之間為部分偶聯關系?,F提出兩階段轉速調控策略,并對影響其的發(fā)酵條件(階段時間、裝液量及轉速)進行正交優(yōu)化,試驗設置3個水平,采用L9(34)正交試驗設計方法[27],每組試驗設置3個重復。

    由表6正交試驗結果的極差分析可知,3個因素影響糞腸乳酸球菌發(fā)酵產GABA的主次順序為A(階段時間/h)、B(裝液量/mL)、C(轉速/(r/min))。正交試驗的最優(yōu)組合為試驗3,且從表中可以直觀看出試驗3最優(yōu):裝液量100 mL,在發(fā)酵前期(0~12 h)控制轉速150 r/min,發(fā)酵后期(12~72 h)控制轉速0 r/min,GABA產量可達到(6.713±0.135)g/L,比優(yōu)化前(0 r/min和100 r/min分批發(fā)酵)分別提高了12.2%與60.1%。由此可見,該方案穩(wěn)定可行,兩階段轉速控制策略可以有效地提高糞腸乳酸球菌合成GABA的能力,對GABA工業(yè)化生產具有重要的參考價值和指導意義。

    表6 L9(34)正交試驗結果Table 6 The Orthogonal test result of Shake flask fermentation

    3 結論

    本文通過分析不同轉速下發(fā)酵曲線和動力學參數,基于不同轉速發(fā)酵過程中菌體生長及產物合成的變化,且利用建立的發(fā)酵動力學模型驗證了菌體生長與產物合成之間為部分偶聯關系,提出了兩階段轉速控制策略,并對影響此調控策略的發(fā)酵條件進行正交優(yōu)化。結果表明,裝液量100 mL,在發(fā)酵前期(0~12 h)控制轉速150 r/min,發(fā)酵后期(12~72 h)控制轉速0 r/min,GABA產量可達到(6.713±0.135)g/L,比優(yōu)化前(0和100 r/min分批發(fā)酵)分別提高了12.2%與60.1%?;趦呻A段轉速控制策略,糞腸乳酸球菌合成GABA的能力顯著提高,為下一步大規(guī)模生產GABA提供了基礎條件和理論依據。

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