尤溪苦茶資源苦澀味物質(zhì)測定與分析

唐 琴，孫威江,,*，陳志丹*，沈詩鈺，周 喆，陳佳佳，陳翠翠

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省安溪縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 泉州 362400；3.福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；4.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400）

我國是茶樹的原產(chǎn)地，栽培茶樹已有3 000余年的歷史，擁有極其豐富的茶樹種質(zhì)資源，其中野生茶樹是一類較為寶貴的資源，經(jīng)過長期的進(jìn)化，野生茶樹蘊(yùn)含著抵抗各種逆境所需的基因?？嗖枋俏覈赜械囊活惒铇滟Y源，早期多以野生茶樹形式存在并被發(fā)現(xiàn)和利用，多分布于粵、湘、贛毗鄰區(qū)，尤其以南嶺山脈兩側(cè)最多[1]?？嗖柰ǔ＞哂休^為獨(dú)特的品質(zhì)風(fēng)味和保健功效。近年來針對苦茶資源挖掘和產(chǎn)品開發(fā)的研究也日漸增多，研究較多的有江華苦茶[2-3]和以苦茶堿為優(yōu)勢嘌呤堿的苦茶（Camellia assamica var. kucha Chang et Wang）[4]，從理化分析到分子生物技術(shù)等均有涉及，闡述了苦茶的獨(dú)特性及其相應(yīng)的形成機(jī)理[5]。福建蘊(yùn)含豐富的特異性苦茶茶樹種質(zhì)資源，尤溪苦茶便是其中一類優(yōu)質(zhì)資源，距今已有200多年栽培生產(chǎn)歷史。尤溪苦茶生長地區(qū)年均氣溫為15.5～16 ℃，日均最高氣溫僅23.5 ℃，海拔600～1 000 m，相對濕度84%以上。尤溪苦茶群體資源生長于當(dāng)?shù)睾瑤r石碎屑的肥沃土壤中，四周植被資源豐富。發(fā)芽期較晚，一般在4月中旬，樹型以灌木為主，少數(shù)為小喬木，樹姿較直立，葉片形態(tài)為披針或長橢圓大葉，葉劇尖，葉緣有鋸齒，芽頭大多為紫色[6]，耐寒力、抗凍性等抗逆能力強(qiáng)，滋味苦、略澀、回甘，是當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)民間藥茶，具有重要的研究與保護(hù)價值[7]。

茶葉中苦澀味物質(zhì)主要有茶多酚、兒茶素、花青素、生物堿、茶皂素和氨基酸形成的復(fù)合物等[8]。兒茶素中以酯型兒茶素含量最為豐富，呈苦澀味，且苦味比澀味強(qiáng)，花青素是紫芽茶苦澀味的主要影響物質(zhì)；茶葉中生物堿主要有咖啡堿、可可堿和茶堿，是茶葉中主要的苦味物質(zhì)；茶皂素味苦而辛辣，除此之外少部分的黃酮類物質(zhì)也具有明顯的苦味，茶葉苦味是多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果[9-11]。由于苦茶的獨(dú)特性及其藥用價值而受到越來越多生產(chǎn)企業(yè)和研究單位的關(guān)注，本研究從尤溪苦茶群體資源中采集33 株茶樹資源對其苦澀物質(zhì)及功能成分分析研究，探明引起苦澀味的功能物質(zhì)成分，為尤溪苦茶的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集福建省尤溪縣33 株長勢好，持嫩性強(qiáng)的尤溪苦茶單株茶樹的一芽二葉鮮葉，編號分別為CMC01～CMC33，以福云六號、福鼎大白、黃旦和鐵觀音為對照，參照文獻(xiàn)[12]的方法，采用烘干固樣法制成樣品，保存于冰箱待測。

咖啡堿、可可堿、茶葉堿、沒食子酸（gallate，GA）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechingallicacid，EGCG）和兒茶素（catechin，C）標(biāo)樣（純度≥98%）美國Sigma公司；表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸（epicatechingallate，ECG）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、兒茶素沒食子酸（catechingallate，CG）、沒食子兒茶素沒食子酸（gallocatechingallate，GCG）標(biāo)樣（純度≥98%） 成都德思特生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜級） 德國Merck公司；甲酸（色譜級，純度≥98%） 美國Aladdin公司；水為超純水，其他試劑為市售分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀、2998型二極管陣列檢測器、X-select-T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）美國Waters公司；TU-1810PC紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA1004型電子天平、MA150C-000230V1快速水分測定儀 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；STARTER 3100 pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；UNIQUE-R20純水系統(tǒng) 廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司；SB-5200DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；PULVERISETTE23微型研磨 德國飛馳儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素、可溶性糖和黃酮成分測定

花青素含量的測定參照周瓊瓊[13]和Pang Yongzhen[14]等方法提取花青素測定液進(jìn)行測定并計算；可溶性總糖測定參照蒽酮比色法。總黃酮含量測定參照AlCl3比色法。實(shí)驗設(shè)3 次重復(fù)，取平均值。

1.3.2 兒茶素組分和咖啡堿測定

采用高效液相色譜法，參照彭靜等[15]的方法；咖啡堿前處理參照GB/T 8312—2013《茶咖啡堿測定》，兒茶素前處理參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法》，設(shè)置3 次重復(fù)，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

酯型兒茶素總量=ECG+EGCG+GCG+CG；非酯型兒茶素（簡單兒茶素）總量=C+EC+EGC+GC；兒茶素品質(zhì)指數(shù)=（EGCG+ECG）×100/EGC[16]。數(shù)據(jù)分析采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計，采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Origin 2017軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 尤溪苦茶資源主要苦澀味物質(zhì)成分分析

通過對33 份尤溪苦茶資源的主要苦澀味物質(zhì)進(jìn)行基本的統(tǒng)計分析，3 個生物堿組分和9 個兒茶素組分標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖如圖1所示，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。尤溪苦茶主要苦澀味物質(zhì)含量均具有一定差異，20 個指標(biāo)變異系數(shù)在9.74%～73.08%之間，以GCG差異最大，EGCG最小，除EGCG外其余變異系數(shù)均大于10%，其中，花青素、可可堿、茶堿、生物堿總量以及除EGCG外兒茶素各組分的變異系數(shù)均超過20%，由此可見，尤溪苦茶苦澀味物質(zhì)成分的變化幅度和變異系數(shù)均較大，遺傳多樣性豐富[17]。

表1 尤溪苦茶資源主要苦澀味成分生化統(tǒng)計分析Table 1 Statistical results of biochemical components of tea germplasm resources for Youxi bitter tea

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig. 1 HPLC choromatograms of various standards

2.2 尤溪苦茶資源花青素與黃酮類和可溶性糖物質(zhì)成分含量分析

紫色茶樹芽葉中含量較高的花青素是其制茶苦澀味較強(qiáng)的主要原因之一[18]。由表1可以看出，花青素的變化幅度為0.93～3.62 mg/g，平均值為1.86 mg/g，變異系數(shù)為29.03%，花青素含量最高的單株為CMC28（3.6 2 m g/g），花青素含量最低的為C M C 2 0（0.93 mg/g），參照周喆等[19]紫化茶樹品種C18-1春季含量（2.19 mg/g），篩選出花青素特異單株8 株（CMC18、CMC21、CMC22、CMC23、CMC26、CMC28、CMC32和CMC33）。由圖2可知，與4 個對照樣相比，苦茶資源花青素含量均值高于其對照，并與黃旦差異顯著。茶葉中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，呈柔和的澀味感覺，閾值低，對茶湯苦味起增強(qiáng)作用，通常的味感是“苦而不甘”[20]，由表1可知，黃酮類物質(zhì)變化幅度為2.92～4.85 mg/g，平均值為3.72 mg/g，變異系數(shù)為13.17%，黃酮類物質(zhì)含量最高的為CMC13（4.85 mg/g），最低的為CMC12（2.92 mg/g），與對照相比，尤溪苦茶黃酮類物質(zhì)含量均值低于對照，差異不顯著（除黃旦）。茶鮮葉中的糖類物質(zhì)包括單糖、寡糖、多糖及其他糖類，可溶性糖是構(gòu)成茶湯甜味的主要成分，與甜度呈中度正相關(guān)[21]。可溶性糖還能緩解茶多酚和咖啡堿等物質(zhì)引起的苦澀味，增加茶湯滋味的厚味和協(xié)調(diào)性。由表1可知，尤溪苦茶可溶性糖的含量變化幅度為5.24%～9.54%，平均值為7.65%，變異系數(shù)為18.95%，含量均值低于對照，并與黃旦、鐵觀音差異顯著（圖2）。

圖2 尤溪苦茶花青素、黃酮、可溶性糖含量分析Fig. 2 Analysis of the contents of anthocyanin, flavonoid and soluble sugar in Youxi bitter tea in comparison with four control teas

2.3 尤溪苦茶資源生物堿組分含量分析

在一般茶種植物中，咖啡堿含量通常占干質(zhì)量的2%～4%，可可堿約0.05%，茶葉堿約0.002%[22]。咖啡堿是單一的苦味物質(zhì)，且閾值低，其含量與茶湯苦味呈高度正相關(guān)，可可堿和茶葉堿也呈現(xiàn)苦味，但相比咖啡堿苦味較弱[23]。由表1可以看出，尤溪苦茶中生物堿總量總變幅為3.10%～6.95%，均值為4.64%；咖啡堿總變幅為2.81%～5.49%，均值為3.98%，變異系數(shù)為15.02%，其中咖啡堿含量最高的單株為CMC24（5.49%），屬于咖啡堿含量具有特異單株[24]，含量最小的單株為CMC11（2.81%）；可可堿總變幅為0.22%～1.18%，變異系數(shù)為36.63%，均值為0.62%，其中可可堿含量最大單株為CMC24（1.18%），含量最小單株為CMC11（0.22%），茶堿總變幅為0.01%～0.08%，均值為0.05%。由表1和圖3可以看出，尤溪苦茶生物堿分布模式與茶種植物基本一致，均值含量明顯高于4 組對照，并與對照差異顯著。

圖3 尤溪苦茶生物堿組分含量分析Fig. 3 Analysis of alkaloids content in Youxi bitter tea in comparison with four control teas

2.4 尤溪苦茶資源兒茶素組分含量分析

兒茶素作為茶多酚的主體成分，與茶葉滋味品質(zhì)密切相關(guān)，分為簡單（非酯型）兒茶素和復(fù)雜（酯型）兒茶素，在兒茶素組分構(gòu)成中以酯型兒茶素為主。在茶葉中，一般含量較高的是EGCG和ECG，約占兒茶素總量的75%。兒茶素同時具有苦味和澀味，苦味相對較強(qiáng)，且苦澀味隨著兒茶素的濃度增強(qiáng)而呈線性增強(qiáng)，其中苦味的增強(qiáng)速度大于澀味[25]。其中，簡單兒茶素稍有澀味，收斂性弱，回味爽口。酯型兒茶素是茶葉苦澀味的主體，尤其是EGCG，對茶葉的苦澀起決定性的作用。兒茶素品質(zhì)指數(shù)越高，鮮葉的嫩度和茶葉品質(zhì)相對越好，特級綠茶的兒茶素品質(zhì)指數(shù)一般大于500[26]。由表1可以看出，尤溪苦茶在兒茶素組分含量配比上有差異，兒茶素組分含量中含量最高的是EGCG，含量最低的是CG，兒茶素組分含量大小的總體趨勢為EGCG＞ECG＞EGC＞GC＞C＞EC＞GCG＞CG，兒茶素總量變幅為16.44%～27.59%，平均值為22.14%，酯型兒茶素的總變幅為13.76%～20.85%，平均值為18.01%，EGCG總變幅為11.83～17.52%，平均值為15.26%，其中EGCG含量最大的單株為CMC33（17.52%），EGCG含量最低的單株為CMC25（11.83%），根據(jù)林金科等[27]特異單株的篩選標(biāo)準(zhǔn)（≥13%），尤溪苦茶基本表現(xiàn)為EGCG特異，其中含量不小于15%的特異單株有21 份。所有尤溪苦茶兒茶素品質(zhì)均大于500，說明尤溪苦茶適制綠茶，與當(dāng)?shù)赜认嗖杵毡橹瞥沙辞嗑G茶的現(xiàn)狀一致[6]。

表2 尤溪苦茶資源兒茶素組分含量Table 2 Catechin contents in Youxi bitter tea leaves

由表2可知，兒茶素品質(zhì)結(jié)果顯示尤溪苦茶兒茶素指標(biāo)與4 種對照茶樹各兒茶素指標(biāo)均存在一定差異，尤溪苦茶中總兒茶素含量明顯高于4 種對照茶樹，但均以酯型兒茶素為主，EGCG含量最高，與王冬梅等[28]研究結(jié)果一致。其中，EGCG含量、兒茶素總量和酯型兒茶素含量均顯著高于對照，這3 類物質(zhì)均表現(xiàn)為苦澀味重，其中苦味大于澀味，進(jìn)一步說明了尤溪苦茶苦味突出的原因?，F(xiàn)有研究顯示茶葉是EGCG的唯一來源，因此尤溪苦茶可作為茶樹品種改良的親本資源，也可作為直接提取EGCG的特異資源加以研究利用。

2.5 尤溪苦茶資源總體差異性成分分析

圖4 尤溪苦茶資源與對照總體差異性成分熱圖分析Fig. 4 Heat map analysis of the differential components of Youxi bitter tealeaves and control teas

為直觀地展示20 個苦澀味物質(zhì)成分在尤溪苦茶單株及對照間的差異，對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖和聚類分析，顏色偏向藍(lán)色說明含量越高。如圖4所示，茶樹品種第1聚類分為2 個大類，一類是對照樣品（黃旦、鐵觀音、福云六號和福鼎大白），一類是尤溪苦茶單株，說明尤溪苦茶與對照存在明顯的差異，主要體現(xiàn)尤溪苦茶花青素、咖啡堿、可可堿、茶葉堿、生物堿、GA、GC、EGCG、兒茶素總量和酯型兒茶素具有較高的含量，而可溶性總糖、EGC和EC含量則低于對照，進(jìn)一步說明尤溪苦茶具有其獨(dú)特性，并在花青素、生物堿、EGCG、酯型兒茶素等苦澀味物質(zhì)有別于一般茶葉，是尤溪苦茶味苦味濃的內(nèi)在因子。尤溪苦茶中，CMC24獨(dú)聚一類，與其他尤溪苦茶分開，結(jié)合表1和圖4可以看出其在生物堿含量存在較為明顯的特異，具有后續(xù)尤溪苦茶特異性重要的研究價值。

3 結(jié)論與討論

3.1 尤溪苦茶的遺傳多樣性

尤溪苦茶群體資源的不同單株的主要苦澀味物質(zhì)含量均具有一定差異，20 個物質(zhì)成分指標(biāo)變異系數(shù)在9.74%～73.08%之間，以GCG最大，EGCG最小，說明尤溪苦茶苦澀味生化成分存在豐富的多樣性和變異性。根據(jù)王新超等[29]對我國苦茶資源研究表明，兒茶素組分中EC和C含量以及兩者之和占總兒茶素比例能夠體現(xiàn)茶樹品種的進(jìn)化程度，尤溪苦茶中EC和C的遺傳變異系數(shù)分別為41.05%和45.73%，變異類型豐富，表明參試材料既有進(jìn)化比較原始的類型，也有進(jìn)化較高的類型，說明尤溪苦茶具有較多樣的遺傳基礎(chǔ)。

3.2 尤溪苦茶苦味形成的生化機(jī)理

紫芽綠茶的滋味較苦澀是由于其特征成分花青素與兒茶素含量較高，咖啡堿本身呈現(xiàn)苦味，紫色芽葉苦澀味成分閾值呈咖啡堿＜花青素＜兒茶素，苦澀味指數(shù)表現(xiàn)為兒茶素＞咖啡堿＞花青素[30]。Yin Junfeng等[31]研究結(jié)果表明EGCG和咖啡堿之間具有苦味協(xié)同作用，且咖啡堿對EGCG的澀味具有增強(qiáng)作用。本研究結(jié)果顯示尤溪苦茶的花青素、咖啡堿、可可堿、茶堿、EGCG、兒茶素總量和酯型兒茶素含量的均值均高于對照組，解釋了尤溪苦茶苦澀味突出的原因是高含量的花青素、咖啡堿和兒茶素（特別是酯型兒茶素）以及它們的相互協(xié)同作用。研究表明尤溪苦茶可溶性糖總量的均值低于對照組，推測低含量的可溶性糖可能對尤溪苦茶苦味的產(chǎn)生起到一定的作用。研究還表明尤溪苦茶中黃酮含量均值略低于對照，因此推測黃酮物質(zhì)可能并不是導(dǎo)致尤溪苦茶苦味的主要原因。

3.3 尤溪苦茶特異性單株的挖掘篩選

綜合比較尤溪苦茶的苦味物質(zhì)成分，篩選出含量大于5%高咖啡堿特異性資源1 份，含量大于1%的高可可堿特異性資源1 份，含量大于15%的高EGCG資源21 份，花青素含量較高的資源8 份，可作為后續(xù)深入開展苦茶苦味形成分子調(diào)控機(jī)理以及特異性茶樹種質(zhì)資源選育和利用的重要材料。為今后的雜交育種、創(chuàng)新加工、功能性成分開發(fā)與次生代謝機(jī)理的相關(guān)研究提供良好的材料基礎(chǔ)。

3.4 尤溪苦茶資源研究與開發(fā)利用展望

近年，在相關(guān)部門和企業(yè)的重視和指導(dǎo)下，尤溪苦茶的獨(dú)特品質(zhì)受到了越來越多的關(guān)注，苦茶茶樹資源也得到了一定的保護(hù)，并初步開展了一些繁育、引種和茶葉試制試驗，但是尤溪苦茶這一特異性茶樹種質(zhì)還未得到系統(tǒng)保護(hù)、科學(xué)鑒定和充分利用，其特異性狀形成的機(jī)理以及利用其開發(fā)獨(dú)特功能性的茶葉產(chǎn)品的相關(guān)研究還比較缺乏。本研究收集保存了一批尤溪苦茶茶樹種質(zhì)并進(jìn)行繁育，通過對尤溪苦茶的苦澀味物質(zhì)含量展開研究，闡釋尤溪苦茶苦味形成的化學(xué)機(jī)理，科學(xué)論證尤溪苦茶資源的特異性和珍稀性。在本研究的基礎(chǔ)上，今后應(yīng)重點(diǎn)研究和探析尤溪苦茶苦澀味形成的分子機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制，可充分結(jié)合目前快速發(fā)展的多組學(xué)分析技術(shù)，全面深入地解析尤溪苦茶資源苦澀味突出的特異機(jī)理，為開發(fā)功能性產(chǎn)品和創(chuàng)新利用尤溪苦茶資源提供科學(xué)支撐。