LPS對(duì)A549和Hela細(xì)胞SPLUNC1蛋白表達(dá)的影響

曹留霞，武澗松，陳 潔

上腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate, lung and nasal epithelium clone, PLUNC)，是一類由呼吸道黏膜特異分泌且與固有免疫應(yīng)答密切相關(guān)的蛋白家族，短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate, lung and nasal epithelium clone 1, SPLUNC1)是新近發(fā)現(xiàn)的PLUNC家族成員，與殺菌滲透增強(qiáng)蛋白結(jié)構(gòu)類似[1，2]，能夠?qū)Ω鞣N理化生刺激做出反應(yīng)，與脂多糖結(jié)合，參與抗微生物和抗腫瘤的免疫過程[3，4]。近年來，其在呼吸道疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已引起越來越多的關(guān)注。SPLUNC1主要在黏膜上皮、腺上皮等內(nèi)胚層起源上皮組織中表達(dá)。已有研究表明，SPLUNC1在小細(xì)胞肺癌中呈高表達(dá)現(xiàn)象，可能參與非小細(xì)胞肺癌的早期防御[5，6]。然而，SPLUNC1是否在人宮頸癌上皮細(xì)胞中表達(dá)、炎性反應(yīng)與SPLUNC1表達(dá)是否存在關(guān)聯(lián)等問題尚未見報(bào)道。本研究就SPLUNC1在A549、Hela細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)及其與炎性刺激的反應(yīng)關(guān)系進(jìn)行初步觀察，探討SPLUNC1的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺腺癌A549細(xì)胞、人子宮頸癌Hela細(xì)胞由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，DMEM-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自HYCLONE公司，0.25 %胰酶、DAB顯色劑等試劑購自化晟科技有限公司，大腸桿菌LPS購自Sigma公司，CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自BestBio公司，一抗兔抗人SPLUNC1多克隆抗體購自美國Abcam公司，二抗PV-9000試劑盒購自博奧森公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及增殖活性檢測(cè)(CCK-8法) A549、Hela細(xì)胞復(fù)蘇后于含胎牛血清的10% DMEM-1640培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、擴(kuò)增，取指數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)、接種于96孔板培養(yǎng)12 h，100 μl/孔，細(xì)胞濃度7×103/100 μl。兩類細(xì)胞均隨機(jī)分為對(duì)照組和LPS組，對(duì)照組只加入培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組同時(shí)分別加入終濃度為5、10、20、40、80 mg/L的LPS，并設(shè)空白對(duì)照組(等體積的培養(yǎng)液中無細(xì)胞)，對(duì)照組、空白對(duì)照組及每個(gè)濃度組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。恒溫37 ℃、5 % CO2飽和濕度下分五批分別培養(yǎng)3、6、12、24、48 h后取出培養(yǎng)板，PBS沖洗10 min×3次，加入10 μl CCK-8試劑，按照CCK-8說明操作，酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處各孔的吸光度值(A490值)，細(xì)胞相對(duì)增值率(P%)=(實(shí)驗(yàn)組A490-空白組A490)/(對(duì)照組A490-空白組A490)×100 %。

1.2.2 SPLUNC1免疫組織化學(xué)分析 將濃度為5×108/L的A549、Hela細(xì)胞等量接種于預(yù)先含有多聚賴氨酸包被小玻片的平皿中培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)5個(gè)平皿，對(duì)照組只加入培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別另加入兩類細(xì)胞各自最佳效應(yīng)濃度的LPS，恒溫37℃、5% CO2飽和濕度下孵育一個(gè)最佳效應(yīng)周期后取出。冷丙酮溶液室溫固定30 min，PBS沖洗10 min×3次，0.1 %TritonX-100室溫孵育30 min，PBS沖洗后3%過氧化氫37 ℃孵育15 min，滴加一抗SPLUNC1(1∶100)4 ℃過夜，生物素標(biāo)記的二抗依次37 ℃孵育3 h，PBS充分沖洗，DAB染色、蘇木精復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明、中型樹膠封片。以細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性反應(yīng)，隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，Image-pro Plus軟件量化分析陽性信號(hào)熒光強(qiáng)度(signal intensity, SI)，以SI代表SPLUNC1的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 LPS與細(xì)胞增殖的時(shí)效和量效關(guān)系 在不同濃度LPS作用下隨著時(shí)間的延長(圖1A)，A549細(xì)胞吸光度值OD逐漸增大，6 h已有較為突出的顯色，12 h時(shí)最大，其后明顯下降，細(xì)胞相對(duì)增殖率的時(shí)間反應(yīng)特征與OD類似(圖1B)，12 h為LPS刺激A549細(xì)胞的最佳處理時(shí)間，在整個(gè)觀察期間，20 mg/L的LPS刺激A549細(xì)胞增殖的效應(yīng)最強(qiáng)，為最佳效應(yīng)濃度。Hela細(xì)胞的OD值隨LPS作用時(shí)間延長逐漸增大，12 h即達(dá)到或接近峰值(圖2A)，但12～24 h改變幅度微小，24 h后則明顯下降，可以認(rèn)為12～24 h均為合適的處理時(shí)間，可供選擇的時(shí)間范圍較寬，增殖率的時(shí)間反應(yīng)特征同樣也與OD類似(圖2B)，40 mg/L的LPS為Hela細(xì)胞的最佳效應(yīng)濃度。

圖1 LPS對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(CCK-8法)

2.2 LPS刺激前后SPLUNC1表達(dá)的變化 分別以20 mg/L、40 mg/L的LPS與A549細(xì)胞和Hela細(xì)胞共孵育12 h。SPLUNC1免疫組化染色顯示，對(duì)照組A549、Hela細(xì)胞胞質(zhì)及部分胞核呈現(xiàn)黃色，LPS實(shí)驗(yàn)組A549、Hela細(xì)胞呈現(xiàn)黃棕色(圖3)，兩組均呈陽性表達(dá)；蛋白信號(hào)熒光強(qiáng)度檢測(cè)顯示，LPS刺激后A549、Hela細(xì)胞SPLUNC1的熒光強(qiáng)度(SI)分別為264.25±13.03和345.17±12.81，均顯著高于對(duì)照組(130.54±11.97，145.52±12.35，P<0.05)，兩類細(xì)胞SPLUNC1的相對(duì)表達(dá)均明顯上調(diào)。不同細(xì)胞間的比較顯示，對(duì)照組兩類細(xì)胞SI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組Hela細(xì)胞SI高于A549細(xì)胞(P<0.05)。

圖2 LPS對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響(CCK-8法)

圖3 A549細(xì)胞、Hela細(xì)胞SPLUNC1蛋白免疫組化染色(×400)

A.A549細(xì)胞(對(duì)照組)；B.A549細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)；C.Hela細(xì)胞(對(duì)照組)；D.Hela細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)

2.3 LPS刺激A549、Hela細(xì)胞SPLUNC1表達(dá)的效應(yīng)差別 以LPS處理后SPLUNC1蛋白信號(hào)強(qiáng)度(SI)的增量值(Δ)為參數(shù)，量化觀察LPS對(duì)兩類細(xì)胞SPLUNC1表達(dá)的效應(yīng)，ΔSI=SI實(shí)驗(yàn)組-SI對(duì)照組，在A549細(xì)胞ΔSI=133.71±9.55，Hela細(xì)胞ΔSI=199.65±10.26，兩類細(xì)胞ΔSI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.59，P<0.05)，Hela細(xì)胞ΔSI明顯高于A549細(xì)胞ΔSI。

3 討 論

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[7]，宮頸癌已成為婦女第二大常見惡性腫瘤，其發(fā)病呈逐年上升和年輕化的趨勢(shì)[8]，嚴(yán)重威脅人類健康。炎性反應(yīng)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切[9，10]，被認(rèn)為是很多腫瘤的驅(qū)動(dòng)，甚至是始發(fā)因素，不僅促進(jìn)腫瘤發(fā)生，甚至“協(xié)助”癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[11]，近年來，多項(xiàng)研究從流行病學(xué)、臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的角度證實(shí)了炎性反應(yīng)在肺癌[12]和宮頸癌[13，14]中的重要作用?；谛陆l(fā)現(xiàn)，探討新的“炎-癌”機(jī)制，尋找早期診斷標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)對(duì)深化兩類癌癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知、指導(dǎo)臨床防治意義重大。

SPLUNC1是新發(fā)現(xiàn)的呼吸道特異性天然免疫分子，生理上主要參與宿主的呼吸道防御反應(yīng)，其表達(dá)呈現(xiàn)出一定的組織特異性，主要見于呼吸道內(nèi)胚層上皮，但其具體分泌部位及其他內(nèi)胚層起源的上皮是否也存在分泌仍待更多深入細(xì)致的研究，漿液細(xì)胞、黏液細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞和杯狀細(xì)胞等外分泌組織似乎都能檢測(cè)到SPLUNC1的表達(dá)[15]；病理上已有研究報(bào)道了SPLUNC1與呼吸道疾病和部分腫瘤的關(guān)聯(lián)性[ 6]。Zhang等[16]課題組證實(shí)SPLUNC1下調(diào)microRNA-141表達(dá)，影響鼻咽癌細(xì)胞的凋亡、生長、轉(zhuǎn)移和侵襲過程，推測(cè)SPLUNC1可能是一種抗癌因子，在非小細(xì)胞肺癌中Teeguarden等[5，6]發(fā)現(xiàn)SPLUNC1高表達(dá)的現(xiàn)象，Benlloch 等[17]則認(rèn)為SPLUNCl是一種有效的非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)記物。

作為一種表面分泌蛋白，SPLUNC1不僅可以將病原微生物表面的病原相關(guān)分子模式遞呈給宿主免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，還可以產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)來協(xié)助抵御外來物質(zhì)的入侵[4，6，18]。宮頸上皮為內(nèi)胚層起源的上皮，所處組織與外界環(huán)境相通，具有外分泌功能，其癌變與炎性反應(yīng)存在很大相關(guān)性，研究證實(shí)，包括HPV在內(nèi)的病原體的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因[13，14]。本研究細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度的LPS對(duì)Hela細(xì)胞均顯示了不同程度的增殖活性，且呈現(xiàn)濃度越高，增殖活性越高的趨勢(shì)，進(jìn)一步提示炎性反應(yīng)在宮頸上皮細(xì)胞癌變?cè)鲋尺^程中的重要作用。免疫組化分析可見，Hela細(xì)胞中SPLUNC1呈陽性表達(dá)，在LPS炎性反應(yīng)模型中其相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，提示SPLUNC1不僅特異表達(dá)于呼吸道黏膜，在宮頸癌上皮細(xì)胞中也存在表達(dá)，炎性刺激后表達(dá)的上調(diào)表明SPLUNC1可能是宮頸癌“炎-癌”過程中的重要反應(yīng)因子，結(jié)合其表面分泌免疫蛋白的特征，推測(cè)SPLUNC1的分泌可能是宮頸上皮癌變過程中的一種自我防御機(jī)制或預(yù)警信號(hào)，監(jiān)測(cè)SPLUNC1表達(dá)或表達(dá)量的異?？赡苡兄趯m頸癌的早期發(fā)現(xiàn)。

腺癌是非小細(xì)胞肺癌的一種類型，炎性反應(yīng)與腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后都有著密切的關(guān)系[9-12]。腺癌主要起源于較小的支氣管黏膜黏液上皮，這些上皮能夠分泌SPLUNC1，參與形成黏膜免疫屏障。本研究發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞中SPLUNC1呈陽性表達(dá)，在LPS炎性反應(yīng)模型中表達(dá)上調(diào)，表明SPLUNC1在腺癌細(xì)胞分泌，炎性刺激癌細(xì)胞增殖的同時(shí)，SPLUNC1分泌增加，提示SPLUNC1可能參與到腺癌的病變過程中。綜述其生物特性[6、19]和生物效應(yīng)[6、17、20]的報(bào)道，支持SPLUNCl可能是一種抗癌因子，可以作為非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)記物的判斷，但其抗癌機(jī)制及表達(dá)的調(diào)控尚缺乏足夠的數(shù)據(jù)支持，對(duì)肺癌細(xì)胞的凋亡、生長、轉(zhuǎn)移和侵襲過程的影響尚不清楚，有待于進(jìn)一步深入探討。此外，本文不同類型細(xì)胞SPLUNC1表達(dá)的比較顯示，Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞SPLUNC1的本底表達(dá)并無差異，但LPS刺激后Hela細(xì)胞SPLUNC1表達(dá)明顯高于A549細(xì)胞，其表達(dá)的增量(Δ)也較A549細(xì)胞高，這可能與細(xì)胞種系或?qū)嶒?yàn)條件的差別有關(guān)[21-22]，揭示其差異化表達(dá)的分子機(jī)制有助于深化對(duì)SPLUNC1生物功能和表達(dá)調(diào)控的認(rèn)知。

需要指出的是，本研究的報(bào)道只是基于實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)，研究結(jié)論的外推尚缺乏充分完整的證據(jù)鏈加以支撐，進(jìn)一步的研究應(yīng)在細(xì)胞學(xué)研究中匹配正常的細(xì)胞株系，引入SPLUNC1與炎性刺激量效關(guān)系和分子機(jī)制的設(shè)計(jì)，并開展組織水平的檢測(cè)和在體的實(shí)驗(yàn)觀察。