高效液相色譜法同時(shí)測定油脂中抗氧化劑TBHQ、BHT及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

王 毅，陳華鳳，劉 剛

（1 四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，四川 成都 610100）

（2資陽市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗(yàn)中心，四川 資陽641300）

1 引言

抗氧化劑提供的活潑氫可以與油脂氧化過程中產(chǎn)生的活性自由基結(jié)合，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，減緩油脂的氧化變質(zhì)。一般來說，食品抗氧化劑可分為天然抗氧化劑和合成抗氧化劑兩類[1]。目前天然抗氧化劑主要有維生素類，黃酮類、多酚類、皂苷類、鞣質(zhì)類等，但天然抗氧化劑提取困難，價(jià)格、用量和抗氧化效果都不能滿足現(xiàn)代食品工業(yè)的規(guī)模生產(chǎn)的需要[2]。相比之下，合成抗氧化劑的種類、價(jià)格和抗氧化效果均要優(yōu)于天然抗氧化劑，目前國際上已開發(fā)出上百種化學(xué)合成抗氧化劑，但被各國普遍認(rèn)可、較安全、高效且使用量較大的主要有叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）等合成酚類抗氧化劑。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)TBHQ和BHT的最大使用量做出了明確規(guī)定（≤0.2g/kg）[3]。

在諸多合成酚類抗氧化劑中，TBHQ在同等情況下的抗氧化劑性能優(yōu)于其他抗氧化劑，BHT價(jià)格較低，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且遇堿不變色，可以與TBHQ互補(bǔ)使用，基于以上優(yōu)點(diǎn)，TBHQ和BHT往往單一或者聯(lián)合用于油脂制品的抗氧化[4]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在加熱條件下，油脂中的TBHQ和BHT主要以揮發(fā)為主[5-6]。此外，還有少量的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生成。近年來，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)開展了TBHQ和BHT在加熱條件下轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的研究，Hamama[7]和李軍等[8]對(duì)含有TBHQ的油脂進(jìn)行加熱實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：TBHQ加熱時(shí)的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是2-叔丁基對(duì)苯醌（TQ）。Warner等[9]證實(shí)BHT經(jīng)高溫加熱后會(huì)有2,6-二叔丁基苯醌（BHT-Q）生成，Hamama等[7]將BHT置于185℃高溫下加熱1h后，通過GC-MS測試發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化產(chǎn)物2-叔丁基-4-甲基苯酚（TBP）。

盡管TBHQ和BHT轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的研究取得了一些成果，但分析檢測方法鮮有報(bào)道[10]。文中在前期研究的基礎(chǔ)上，以TBHQ、BHT轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TQ、BHT-Q和TBP作為主要分析對(duì)象，建立了高效液相色譜同時(shí)檢測TBHQ、BHT及其特征轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析方法，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)TBHQ和BHT使用全過程的監(jiān)控。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（DAD檢測器、二元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、Chemical Station 色譜工作站，美國Agilent公司）；TI-H5MF2型超聲波清洗器（德國Elma公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國 Millipore公司）；H2050R型高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；FA2004N型分析天平（感量0.0001g）（上海菁華公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑耗材

乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck公司）、超純水（Milli-Q純水系統(tǒng)制備）、微孔濾膜（有機(jī)系，0.22μm）、色譜柱：Sunfire C18，4.6mm×250mm，5μm（美國Waters公司）；ODS C18吸附劑,50μm, 60?, 100g（天津博納艾杰爾科技有限公）。

2.3 對(duì)照品

叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ，純度≥97.8%）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，純度≥99.9%）、2-叔丁基對(duì)苯醌（TQ，純度≥98.0%）購至上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；2-叔丁基-4-甲基苯酚（TBP，純度≥99.0%）和2,6-二叔丁基苯醌（BHT-Q，純度≥99.0%）購至北京百靈威科技有限公司。

2.4 色譜分析條件

色譜柱：Sunfire C18, 4.6mm×250mm,5μm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測波長：280nm；流動(dòng)相：（A水，B乙腈），運(yùn)行梯度洗脫程序：0.00min～3.00min 45%A～45%A，3.00min～7.00min 45%A ～ 25%A，7.00min～ 7.50min 25%A～2%A，12.00min～12.10min2%A ～45%A，12.10min～ 16.00min45%A ～ 45%A。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：精密稱定TBHQ、BHT、TQ、BHT-Q和TBP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.0250g，乙腈溶解并定容至25mL，得到濃度為1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：分別準(zhǔn)確吸取1mL TBHQ、BHT、TQ、BHT-Q和TBP的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000 mg/L）于10mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至10mL，得到質(zhì)量濃度為100mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)使用液。逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)使用液得到質(zhì)量濃度分別為0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L，20.0mg/L，50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.6 提取與凈化

準(zhǔn)確稱取1.0g油樣于在50mL離心管中，加入5mL正己烷，渦旋1min，加入5mL正己烷飽和乙腈超聲提取10min，冷凍離心10min，收集乙腈層于離心管中，重復(fù)用10mL正己烷飽和乙腈提取2次，合并3次提取液，提取液-10℃冷凍2h后加入5g C18吸附劑，振蕩提取10min，冷凍離心，過濾除去C18粉末，收集濾液40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入1ml乙腈溶解殘?jiān)?，過0.22μm有機(jī)濾膜，供液相色譜測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 加熱條件下TBHQ和BHT轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的可能轉(zhuǎn)化機(jī)理

如圖1所示，氧化反應(yīng)初期，TBHQ和BHT均可失去一個(gè)氫生成酚氧自由基中間體（中間體II和中間體IV），其中TBHQ的酚氧自由基中間體IV通過分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移可以生成較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TQ。BHT的酚氧自由基中間體II與III互為共振式，中間體III與過氧化物作用，通過分子內(nèi)消除反應(yīng)生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物BHT-Q。

BHT的轉(zhuǎn)化還有另外一條途徑，活性氫首先對(duì)BHT的苯環(huán)親電加成，生成中間體I，隨后脫去叔丁基生成轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TBP。

圖1 加熱條件下TBHQ和BHT轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的可能轉(zhuǎn)化機(jī)理

3.2 樣品前處理方案的選擇與優(yōu)化

油脂制品前處理時(shí)加入正己烷可以降低體系的粘度，這將有利于待測化合物的提取。此外，利用極性溶劑與油脂不相溶的特性，可以使用極性溶劑提取油脂中的待測極性組分[11]。前期研究結(jié)果表明，乙腈的提取效果優(yōu)于甲醇[12-13]，為了降低乙腈在正己烷中的溶解性，本實(shí)驗(yàn)采用正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑。

一般來說，脂類等非極性組分是樣品提取過程中的主要干擾物，文獻(xiàn)報(bào)道采用中性氧化鋁柱[14-15]，C18柱[16]等固相萃取方式凈化除去。雖然固相萃取的凈化效果較好，但實(shí)驗(yàn)成本較高，耗時(shí)較長，不利于大批量樣品的快速檢測。此外，凝膠滲透色譜[17]也用于了樣品前處理的研究，需要指出的是，該方法不但耗時(shí)長，而且凈化過程中還會(huì)用到大量的有機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境的污染極大。因此，上述前處理方法均不利于實(shí)驗(yàn)室大批量樣品的檢測。隨著QuEChERS技術(shù)的出現(xiàn)，快速、高效、低毒的前處理方式得到了人們的推崇，2018年，陳果等[18]設(shè)計(jì)了基于QuEChERS原理的前處理方案，采用C18-MgSO4作為凈化劑，C18反相色譜柱分離，獲得了理想的結(jié)果，各組分的回收率均在90%以上。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)MgSO4不是凈化油脂所必須的成分（MgSO4主要用于吸附樣品中多余的水分，但油脂制品中幾乎不含水），在多次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，提出了冷凍離心-C18吸附凈化的方案。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該方法具有快速、簡便、易操作，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，有利于實(shí)驗(yàn)室大批量樣品的快速檢測。

3.3 液相色譜條件選擇與優(yōu)化

已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道了TBHQ和BHT的液相色譜分離條件：使用甲醇/乙腈作為有機(jī)相，通過加入了不同比例的鹽[19]、酸[20-21]改善化合物的分離和峰形。筆者首先嘗試使用甲醇作為有機(jī)相，1.0%乙酸-水作為水相進(jìn)行分離，BHT和BHT-Q在此色譜條件下不能達(dá)到基線分離，有機(jī)相換用乙腈后，BHT和TBHQ獲得了較好的分離。為了減少酸體系對(duì)色譜柱的損害，提高色譜分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，筆者嘗試使用純水代替1.0%乙酸-水。如圖2所示，TBHQ、BHT及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在該色譜條件下均獲得了較好的分離效果。

圖2 TBHQ、BHT及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的液相色譜分離圖譜

3.4 方法線性范圍

分別配制TBHQ、BHT、TQ、BHT-Q和TBP不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度依次為0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L，20.0mg/L，50.0mg/L，按照2.4所示的色譜條件進(jìn)行檢測，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，各組分的線性回歸方程見表1所示。測試結(jié)果表明，在0.5mg/L～50.0mg/L范圍內(nèi)，TBHQ、BHT及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（2）大于 0.999。

表1 本方法的回歸方程、相關(guān)系數(shù)

3.5 方法精密度、回收率和檢出限

本實(shí)驗(yàn)采用空白大豆油加標(biāo)的方式進(jìn)行方法精密度、回收率和檢出限實(shí)驗(yàn)。TBHQ、BHT及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的添加水平為1.0mg/kg、10.0mg/kg，按2.4所示的色譜條件，2.6所示的前處理方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每一樣品重復(fù)平行測定6次。測試數(shù)據(jù)見表2所示，TBHQ、BHT及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的回收率在72.6%～101.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于4.5%，檢出限范圍為3mg/kg～10mg/kg。

表2 回收率、精密度和檢出限測定結(jié)果（平行測定6次）

4 結(jié)論

文中建立了同時(shí)測定TBHQ、BHT及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（TQ、BHT-Q、TBP）的前處理方法以及高效液相色譜定量分析方法。該方法簡單易操作，重現(xiàn)性較好，適用于實(shí)驗(yàn)室大批量樣品的快速檢測，通過檢測TQ、BHT-Q、TBP的含量，可以有效避免現(xiàn)行檢測方法測定TBHQ和BHT時(shí)檢測結(jié)果比實(shí)際測定值偏低的缺陷。