應(yīng)用生物信息學(xué)定向篩選產(chǎn)角鯊烯的微生物研究分析

陳 筆，陳良強(qiáng)，胡光源，王和玉，王 莉，楊 帆

（貴州茅臺(tái)酒股份有限公司技術(shù)中心，貴州仁懷 564500）

角鯊烯是一種高度不飽和直鏈三萜烯類化合物，具有抗癌、抗腫瘤、抗氧化等生物活性[1]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等工業(yè)領(lǐng)域[1-2]。角鯊烯雖廣泛存在于動(dòng)物[3]、植物和微生物[4]體內(nèi)，但是深海鯊魚(yú)的肝油目前仍是角鯊烯最為主要的來(lái)源。通過(guò)篩選高產(chǎn)或基因改造微生物菌株[5]發(fā)酵獲取角鯊烯具有生產(chǎn)周期短、不受時(shí)間和地域限制、易操作等優(yōu)點(diǎn)[6-7]，為解決角鯊烯資源的匱乏問(wèn)題開(kāi)辟了一條新途徑。

目前，文獻(xiàn)中篩選高產(chǎn)角鯊烯菌株的方法主要是通過(guò)非目標(biāo)性的大量篩選，然后再測(cè)定角鯊烯的產(chǎn)量。例如，王曉龍[6]從紅樹(shù)林的腐葉中分離得到高產(chǎn)角鯊烯菌株P(guān)seudozymasp.SD301，Bhattacharjee 等[9]從蜂蜜中分離得到產(chǎn)角鯊烯德氏孢圓酵母，Brid 等[10]在漢遜德巴利酵母、深紅螺菌和構(gòu)巢曲霉等微生物中檢出角鯊烯。同時(shí)，隨著微生物基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等數(shù)據(jù)的日益豐富[11]，大量數(shù)據(jù)表明微生物有非常豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇，運(yùn)用任何一種單一的培養(yǎng)基均無(wú)法完全反映菌株的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力[12]。為激活沉默基因，充分挖掘微生物產(chǎn)角鯊烯的潛力，需根據(jù)不同微生物的特點(diǎn)嘗試多種培養(yǎng)基，并不斷優(yōu)化培養(yǎng)基配方[13-14]。這種傳統(tǒng)非目標(biāo)性的篩選和培養(yǎng)優(yōu)化方法周期較長(zhǎng)，并且檢測(cè)角鯊烯的方法較為復(fù)雜，會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間、精力與資金[15-16]。因此，利用生物信息學(xué)提高篩選效率和挖掘微生物產(chǎn)角鯊烯的潛力有著重要的經(jīng)濟(jì)意義。

茅臺(tái)酒作為醬香型白酒典型代表，存在多種生物活性成分，而角鯊烯就是其中之一[8]，這表明茅臺(tái)酒釀造過(guò)程中可能存在具有合成角鯊烯能力的微生物。因此，利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)角鯊烯的合成代謝途徑及關(guān)鍵基因進(jìn)行分析，再與茅臺(tái)酒釀造過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)酵母代謝通路數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，篩選獲得具有完整角鯊烯合成代謝通路的候選菌株；并根據(jù)候選菌株產(chǎn)角鯊烯代謝通路的關(guān)鍵酶特性和底物要求，優(yōu)化候選菌株的培養(yǎng)基，激活沉默基因，充分挖掘微生物產(chǎn)角鯊烯的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

候選菌株：扣囊復(fù)膜孢酵母（SaccharomycopsisfibuligerasMT001）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharo-mycespombe MT002）和庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzeviiMT003），均從茅臺(tái)酒的釀造過(guò)程中分離，且已全基因組測(cè)序并保藏于茅臺(tái)微生物菌種庫(kù)。本文報(bào)道的3 株酵母的原始序列數(shù)據(jù)已保存在中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所大數(shù)據(jù)中心(BIGD)的GSA 檔案中，登記號(hào)為CRA001596，可在http://bigd.big.ac.cn/gsa上公開(kāi)查閱。

試劑：角鯊烯（色譜純），美國(guó)sigma 公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸錳、乙酸和無(wú)水乙醇均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)。

儀器設(shè)備：KS4000i 搖床，德國(guó)艾卡公司；380R離心機(jī)，德國(guó)Hettich 公司；LRH-250 恒溫培養(yǎng)箱，上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；IEC61010-1 超凈工作臺(tái)，新加坡藝思高科技有限公司；CL-32L 全自動(dòng)蒸汽滅菌器，日本ALP 株式會(huì)社；G1888A-7890A-5975C 頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HS-GC-MS)，美國(guó)Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 代謝通路與關(guān)鍵酶查詢

利用KEGG pathway 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢角鯊烯代謝途徑，并明確其代謝通路及參與反應(yīng)所需關(guān)鍵催化酶。

1.2.2 候選菌株關(guān)鍵酶基因的完備性

基于3 株候選菌株全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)及其預(yù)測(cè)的氨基酸序列，再與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，確定每株候選菌株產(chǎn)角鯊烯關(guān)鍵酶基因的完備性。

1.2.3 候選菌株的發(fā)酵驗(yàn)證

發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取葡萄糖50 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鈉1 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸錳0.05 g于容器中，加入1 L純水，溶解后分裝到250 mL三角瓶，每瓶100 mL，于121 ℃滅菌15 min。挑取1 環(huán)候選菌株的菌苔于發(fā)酵培養(yǎng)基，以30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)16 h 作為種子液。用血球計(jì)數(shù)板對(duì)種子液的酵母數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，再將種子液接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，接種后培養(yǎng)液中的菌落數(shù)量約為1×106cfu/mL，培養(yǎng)條件為30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。每組設(shè)3個(gè)平行。

1.2.4 基于生物信息學(xué)激活沉默基因

配制好發(fā)酵培養(yǎng)基，檸檬酸在滅菌前加入，乙酸在滅菌后加入，使發(fā)酵培養(yǎng)基中乙酸和檸檬酸終濃度為0、2 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、30 g/L、40 g/L和60 g/L，每組設(shè)3 個(gè)平行。接種候選菌株的種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后培養(yǎng)液中的菌落數(shù)量約為1×106cfu/mL，培養(yǎng)條件為30 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.5 角鯊烯含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]，采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HS-GC-MS）測(cè)定發(fā)酵液中角鯊烯的含量。具體方法為：將發(fā)酵液8000 r/min 離心10 min 后進(jìn)行液液微萃?。↙LME），取上清液10 mL，加適量Na-Cl過(guò)飽和，再加1 mL的戊烷-乙醚（1∶3）萃取劑，迅速旋緊瓶蓋，渦旋振蕩1 min，靜置分層后，吸取有機(jī)相0.5 mL 于液相小瓶中，氮吹濃縮至0.1 mL，吸取1 μL 濃縮有機(jī)相進(jìn)GC-MS 分析。采用標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì)和標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 角鯊烯代謝途徑的關(guān)鍵酶

通過(guò)查詢KEGG pathway 數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)角鯊烯的骨架成分合成主要有兩條代謝途徑：一是MVA（mevalonate pathway，甲羥戊酸）途徑，該途徑在20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)[17]，主要存在于高等真核生物和個(gè)別細(xì)菌中[18]；另一條是MEP/DOXP（1-deoxy-Dxylulose-5-phosphatepathway，脫氧木酮糖-5-磷酸）途徑，其主要存在于細(xì)菌和原生動(dòng)物中[19]，在高等動(dòng)物和真菌中不存在，但在綠色植物中，MEP/DOXP 和MVA 途徑共存于分離的細(xì)胞室中。這兩條代謝通路所需關(guān)鍵酶如圖1所示。

其中，MVA 途徑是以乙酰Co-A 為底物，乙酰乙酰CoA 經(jīng)過(guò)HMG-CoA 酶催化縮合形成3-羥基-3 甲 基 戊 二 酰-CoA[20]，HMG-CoA 隨 后 被HMG-CoA 還原酶還原為甲羥戊酸[21]，再經(jīng)過(guò)一列系列生化反應(yīng)，甲羥戊酸被縮合形成法尼基焦磷酸（FPP）[20]；最后，角鯊烯合成酶將FPP 催化合成角鯊烯[22]，途徑中的關(guān)鍵酶如表1 所示。MEP 途徑是發(fā)生在質(zhì)體內(nèi)，以丙酮酸或3-磷酸甘油醛為底物，經(jīng)過(guò)中間體2-甲基赤蘚醇磷酸（MEP）和1-脫氧木酮糖-5-磷酸（DOXP），再合成異戊烯焦磷酸（IPP）和DMAPP[23]，之后合成角鯊烯的反應(yīng)通路與MVA 途徑相同[24]。

圖1 角鯊烯MVA和MEP產(chǎn)生途徑示意圖

表1 MVA途徑合成角鯊烯所需要的關(guān)鍵酶類

2.2 候選菌株關(guān)鍵酶基因的完備性

根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道[1]，真核微生物的角鯊烯合成能力高于原核微生物，因此本研究選取了茅臺(tái)酒釀造過(guò)程中的3 株優(yōu)勢(shì)酵母作為研究對(duì)象[25]。將3株候選酵母菌株的KEGG 功能注釋分析結(jié)果與角鯊烯代謝通路相關(guān)信息進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表2 所示：發(fā)現(xiàn)只有粟酒裂殖酵母（S.pombeMT002）具有完備的MVA 途徑合成角鯊烯所需關(guān)鍵酶基因；扣囊復(fù)膜孢酵母（S.fibuligerasMT001）缺少法尼基焦磷酸合成酶基因，庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（P.kudriavzeviiMT003）缺少磷酸甲羥戊酸激酶和法尼基焦磷酸合成酶基因。與其他研究結(jié)果相同[1，26]，全基因組解析結(jié)果顯示，酵母等真核微生物具有MVA途徑，不具備MEP途徑[19]。

表2 候選菌株MVA途徑關(guān)鍵酶基因注釋情況

2.3 候選菌株的產(chǎn)角鯊烯發(fā)酵驗(yàn)證

為驗(yàn)證候選菌株產(chǎn)角鯊烯的能力，并與生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，本研究以常規(guī)的葡萄糖為碳源，接種粟酒裂殖酵母（S.pombeMT002）、扣囊復(fù)膜孢酵母（S.fibuligerasMT001）和庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（P.kudriavzeviiMT003）進(jìn)行發(fā)酵，但在所有發(fā)酵液中均未檢測(cè)到角鯊烯（表3）。在MT001 和MT003 發(fā)酵液中未檢測(cè)到角鯊烯，可能是因?yàn)槿鄙俳酋徬┖铣申P(guān)鍵酶基因，與生物信息學(xué)分析結(jié)果相一致；而粟酒裂殖酵母MT002 沒(méi)有合成角鯊烯，則可能是相關(guān)代謝基因沒(méi)有表達(dá)，因此需要進(jìn)一步調(diào)整培養(yǎng)條件對(duì)其驗(yàn)證。

表3 發(fā)酵液中候選菌株的角鯊烯產(chǎn)量 (μg/g干菌體)

2.4 基于生物信息學(xué)激活沉默基因

基于粟酒裂殖酵母全基因組數(shù)據(jù)的KEGG 功能注釋分析，其代謝途徑中合成乙酰CoA的最直接底物有檸檬酸和乙酸，因此本研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了乙酸和檸檬酸以促進(jìn)乙酰CoA的產(chǎn)量。

對(duì)不同酵母菌株在不同有機(jī)酸濃度下發(fā)酵液中的角鯊烯含量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，角鯊烯含量分布存在較大差異。從表4 可以看出，添加檸檬酸均不能促進(jìn)3 株酵母生成角鯊烯，但在添加一定的乙酸（5～15 g/L）后，可以在粟酒裂殖酵母MT002的發(fā)酵液中檢測(cè)出疑似角鯊烯的物質(zhì)，經(jīng)過(guò)對(duì)發(fā)酵液中目標(biāo)峰進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)及NIST 譜庫(kù)比對(duì)，確認(rèn)檢測(cè)到角鯊烯（圖2）。

圖2 液液微萃取結(jié)合GC-MS檢測(cè)到發(fā)酵液中角鯊烯的總離子流圖

表4 不同乙酸和檸檬酸濃度下菌株產(chǎn)角鯊烯的含量 (μg/g干菌體)

當(dāng)乙酸濃度低于2 g/L 時(shí)，發(fā)酵液中檢測(cè)不到角鯊烯；當(dāng)乙酸濃度為10 g/L 時(shí)，角鯊烯含量最高可達(dá)14.71 μg/g菌體；當(dāng)乙酸濃度升到15 g/L時(shí)，角鯊烯含量開(kāi)始降低，可能是高濃度的乙酸會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)[27]，進(jìn)而減少角鯊烯的合成。由于茅臺(tái)酒發(fā)酵過(guò)程中最主要的有機(jī)酸是乳酸和乙酸[25]，因此酒醅中的乙酸可能是促進(jìn)茅臺(tái)酒中角鯊烯合成的重要條件。

目前，提高角鯊烯的產(chǎn)量主要通過(guò)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化，以及使用工程改造菌株。例如，通過(guò)添加鹽酸特比奈芬或茉莉酸甲酯來(lái)抑制角鯊烯單加氧酶的活力[28]；或者通過(guò)調(diào)節(jié)氧濃度、接種量、氮源和發(fā)酵時(shí)間等來(lái)提高釀酒酵母的角鯊烯產(chǎn)量[29-30]。生物信息學(xué)顯示，大部分微生物都有非常豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，但在傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下不能被表達(dá)，被稱為沉默基因[12]。本研究篩選得到的粟酒裂殖酵母雖然具有完備的角鯊烯MVA 代謝通路所需關(guān)鍵酶基因，但在含葡萄糖等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中不能合成角鯊烯；在培養(yǎng)基中加入特定濃度的乙酸之后，成功使粟酒裂殖酵母合成了角鯊烯。推測(cè)可能是因?yàn)橐宜岽碳ち怂诰屏阎辰湍副磉_(dá)乙酸-CoA連接酶，激活了這個(gè)沉默基因，提高了乙酰CoA的濃度，從而提高了角鯊烯產(chǎn)量。雖然粟酒裂殖酵母在乙酸刺激下的應(yīng)激反應(yīng)和代謝調(diào)控變化還需要進(jìn)一步的研究確定，但就我們所知，目前尚未有使用本研究思路以及通過(guò)添加乙酸促進(jìn)角鯊烯合成的研究報(bào)道。

3 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)角鯊烯的合成途徑及關(guān)鍵基因進(jìn)行分析，并結(jié)合已測(cè)序完成的白酒釀造過(guò)程中微生物全基因組數(shù)據(jù)，定向篩選出具有完備角鯊烯代謝途徑關(guān)鍵酶基因的粟酒裂殖酵母；然后根據(jù)其代謝途徑特征，添加特定濃度的乙酸促進(jìn)角鯊烯合成，推測(cè)這可能是激活了沉默基因。本研究提供了一條挖掘目標(biāo)菌株產(chǎn)角鯊烯潛力的新思路，避免了因非目標(biāo)性試驗(yàn)耗費(fèi)的時(shí)間、精力和金錢(qián)。雖然最終得到的菌株角鯊烯產(chǎn)量與文獻(xiàn)報(bào)道存在差距[31]，但本研究方法具有一定的針對(duì)性和有效性，對(duì)其他微生物代謝產(chǎn)物的挖掘也同樣具有重要的借鑒意義。