不同動(dòng)物宿主感染衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)后的抗體動(dòng)態(tài)變化

章樂(lè)生 王旗 李清越 張世清 楊榮笙 呼明闖 黃建國(guó) 汪天平*

肺吸蟲(chóng)病是由并殖吸蟲(chóng)感染引起的一種重要的人獸共患食源性寄生蟲(chóng)病[1]，流行于亞洲、非洲和美洲等25個(gè)國(guó)家或地區(qū)。目前全球已報(bào)道的并殖吸蟲(chóng)有50余種[2]，在我國(guó)寄生于人體的并殖吸蟲(chóng)主要有衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)和斯氏并殖吸蟲(chóng)[3]。其中衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)較早，分布廣泛，是人體最主要的致病蟲(chóng)種。依據(jù)衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)囊蚴在體內(nèi)是否發(fā)育成為成蟲(chóng)并產(chǎn)卵，可將宿主動(dòng)物分為適宜和非適宜宿主[4]。本實(shí)驗(yàn)擬用衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)囊蚴感染適宜宿主犬和非適宜宿主大鼠，并以衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原為探針，檢測(cè)適宜和非適宜宿主感染后的抗體，觀察抗體水平動(dòng)態(tài)變化情況。

材料與方法

一、衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)囊蚴獲取

從肺吸蟲(chóng)病歷史流行區(qū)安徽休寧縣藍(lán)田鎮(zhèn)采集溪蟹，將溪蟹搗碎后其碎渣倒入20目、40目、60目的三層網(wǎng)篩中，并用清水沖洗過(guò)篩；40目網(wǎng)篩及60目網(wǎng)篩中的細(xì)渣用清水沖入錐形量杯中，自然沉淀3～5 min，待上層水基本澄清后，輕輕棄去上層肉屑；錐形量杯中再次加入適量的清水，同樣自然沉淀，重復(fù)3～5次；錐形量杯中最后一次沉淀物倒入培養(yǎng)皿中，解剖鏡下觀察并挑取囊蚴，并在顯微鏡下進(jìn)行鑒定。

二、動(dòng)物感染與血清收集

家犬(市購(gòu))4只，體重約10 kg，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)改良加藤法對(duì)糞便進(jìn)行病原學(xué)檢查，均未發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵，經(jīng)口灌服阿苯達(dá)唑預(yù)防性驅(qū)蟲(chóng)治療(劑量：每只犬0.2 g/d，連續(xù)2 d)后，每只犬感染囊蚴100只，于犬下肢靜脈收集1～3號(hào)犬感染前和感染后1～16周的血清，4號(hào)犬感染84 d后解剖取成蟲(chóng)。

SD大鼠6只(購(gòu)自合肥史文斯試驗(yàn)用品銷(xiāo)售部)，隨機(jī)分配為感染組和對(duì)照組(每組各3只)；感染組每只大鼠口飼法感染囊蚴20只，對(duì)照組不予感染；于感染前和感染后1～16周收集大鼠尾末梢血清。

三、成蟲(chóng)收集及抗原提取

4號(hào)犬囊蚴感染84 d后，解剖，從肺中分離出肺吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，用0.9%生理鹽水洗凈后挑取蟲(chóng)體。加入0.01%硫柳汞生理鹽水，并用組織研磨器進(jìn)行研磨處理。凍融3 d，每天2次，低溫離心10 000 g 30 min后取上清，即為成蟲(chóng)可溶性抗原，BCA測(cè)定蛋白含量為9 μg/μl。

四、ELISA體系建立及抗體檢測(cè)

將衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)可溶性抗原用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋為10 μg/ml，包被96孔酶標(biāo)板，每孔加抗原液100 μl，4℃過(guò)夜；PBST洗滌2次后用5%脫脂奶粉于37℃水浴箱封閉1 h，每孔加封閉液300 μl；再用PBST洗滌2次，加入經(jīng)pH 7.2 PBS稀釋后的待測(cè)血清，每孔100 μl，犬、鼠血清分別按1∶100、1∶3200稀釋?zhuān)瑫r(shí)設(shè)空白對(duì)照(加稀釋液100 μl)，陰性對(duì)照(100 μl未感染的犬、鼠血清)；加樣后酶標(biāo)板置于37℃水浴箱孵育30 min，再用PBST洗滌3次后，每孔加入100 μl稀釋后的酶標(biāo)二抗，其中二抗分別為羊抗狗IgG(Abcom公司，貨號(hào)：ab112840)和兔抗鼠IgG(上海生工，貨號(hào)：D110098-0100)，犬、鼠二抗分別按1∶50 000、1∶1 000稀釋?zhuān)?7℃水浴箱孵育30 min后，PBST洗滌3次，加入100 μl TMB室溫避光顯色15 min，最后加入50 μl 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，雙波長(zhǎng)測(cè)定OD值(檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參考波長(zhǎng)630 nm)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：樣本OD值/陰性對(duì)照OD值(S/N)≥2.1時(shí)，判定為陽(yáng)性(犬0周血清為陰性對(duì)照，鼠的陰性對(duì)照為同時(shí)期3只對(duì)照鼠血清OD值的平均值)。

結(jié) 果

一、衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)囊蚴和成蟲(chóng)觀察

現(xiàn)場(chǎng)采集的溪蟹經(jīng)搗碎過(guò)濾和沉淀后，于解剖鏡下觀察并挑取囊蚴。囊蚴在解剖鏡下呈乳白色球形，囊壁較厚，直徑約300～400 μm，內(nèi)含后尾蚴，顯微鏡下可見(jiàn)蟲(chóng)體黑色的排泄囊和2個(gè)彎曲的腸支。

感染84 d犬解剖后，見(jiàn)心臟及肺臟周?chē)衬ど吓家?jiàn)小孔，肺臟上有明顯囊腫。解剖剪剪開(kāi)囊腫囊后，可見(jiàn)每個(gè)囊內(nèi)有1～2條肺吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，見(jiàn)圖1。成蟲(chóng)體型橢圓，肉紅色，口腹吸盤(pán)大小略等；壓片鏡檢見(jiàn)卵巢位于腹吸盤(pán)兩側(cè)，5～6葉，睪丸4～6葉，卵巢較睪丸長(zhǎng)而大[5]。其他3只犬于飼養(yǎng)16周后不同時(shí)期解剖，在肺臟中均發(fā)現(xiàn)并提取出成蟲(chóng)。

圖1 衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)

二、抗體變化情況

1.犬抗體反應(yīng)

3只感染犬經(jīng)ELISA檢測(cè)，均出現(xiàn)抗體陽(yáng)性反應(yīng)。1號(hào)犬第6周抗體陽(yáng)性(OD值為1.124，S/N=2.24)，第12周抗體水平達(dá)到高峰(OD值為1.827，S/N=3.64)，其后維持在S/N=3.08～3.51；2號(hào)犬第3周抗體陽(yáng)性(OD值為1.847，S/N=2.57)，第5周抗體水平達(dá)到高峰(OD值為1.952，S/N=2.72)，其后維持在S/N=2.37～2.71；3號(hào)犬第3周抗體陽(yáng)性(OD值為1.314，S/N=2.15)，第15周抗體水平呈現(xiàn)高峰(OD值為1.641，S/N=2.68)，見(jiàn)圖2。

圖2 ELISA法檢測(cè)感染衛(wèi)生并殖吸蟲(chóng)犬血清抗體動(dòng)態(tài)變化

2.鼠抗體反應(yīng)

3只感染鼠1周檢測(cè)抗體陽(yáng)性(1-3號(hào)大鼠血清抗體檢測(cè)OD值分別為0.932、1.947和1.049，S/N范圍為5.39～11.26)，2～3周抗體水平即達(dá)到高峰；其后抗體逐漸下降，感染后8～16周仍呈陽(yáng)性，抗體水平維持較低水平，見(jiàn)圖3。

圖3 ELISA法檢測(cè)感染衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)大鼠血清

討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染犬于第3周左右檢測(cè)抗體陽(yáng)性，并在第5～12周抗體水平達(dá)到高峰，截至感染后的第16周，抗體仍維持在較高水平，此研究結(jié)果與章子豪、陳韶紅等[6,7]研究結(jié)果一致，與衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)囊蚴進(jìn)入犬體至發(fā)育為成蟲(chóng)的生理時(shí)間(60～90 d)相吻合。感染大鼠后1周檢測(cè)抗體陽(yáng)性，2～3周抗體水平達(dá)到高峰，后抗體水平有所下降，至第8周抗體經(jīng)ELISA檢測(cè)維持在較低的陽(yáng)性水平。大鼠感染肺吸蟲(chóng)囊蚴2～3周，童蟲(chóng)抗體被成蟲(chóng)可溶性抗原探針檢測(cè)到，說(shuō)明童蟲(chóng)和成蟲(chóng)存在共同抗原，與Yoon Kong等[8]試驗(yàn)結(jié)果一致；后期抗體水平下降并最終維持在一定水平，推測(cè)與童蟲(chóng)在機(jī)體移行過(guò)程中發(fā)生了免疫逃避[9]有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示，以衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)可溶性抗原做探針，可檢測(cè)適宜和非適宜宿主體內(nèi)抗體水平變化情況，為肺吸蟲(chóng)病的免疫學(xué)診斷提供理論依據(jù)。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)囊蚴感染后1周即檢測(cè)出衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)抗體，早于犬2周，可能與囊蚴感染數(shù)量、物種差異等有關(guān)所致，但還需要開(kāi)展進(jìn)一步研究。

安徽皖南山區(qū)為衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)的自然疫源地[10,11]，何毅勛等[12]通過(guò)對(duì)皖南兩種衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)品系特征的比較，認(rèn)為我國(guó)衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)存在大小兩種品系。小型品系對(duì)人體寄生不適應(yīng)，未能發(fā)育成熟而停留在童蟲(chóng)階段，因此人是小型品系的非適宜宿主；且通過(guò)本試驗(yàn)研究表明，人作為非適宜宿主對(duì)于衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)的感染存在通過(guò)抗體檢測(cè)達(dá)到診斷的可能。

章子豪等[6]曾以衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原做探針，采用IHA法檢測(cè)感染大鼠的血清，結(jié)果顯示成蟲(chóng)抗體陽(yáng)性反應(yīng)較弱，且出現(xiàn)時(shí)間較遲，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差別，這可能是ELISA檢測(cè)較IHA法更敏感有關(guān)。盡管抗體檢測(cè)可以作為衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)感染的免疫學(xué)診斷方法，但也存在早期診斷和療效考核等方面的不足，且成蟲(chóng)粗抗原與其他寄生蟲(chóng)存在共同抗原，因此應(yīng)著手開(kāi)始敏感性高、特異性強(qiáng)的診斷分子的篩選[13](如cDNA文庫(kù)建立及診斷分子的篩選等)以及分子生物學(xué)診斷方法的建立[14](如LAMP等)。

此外，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)收集自休寧的溪蟹囊蚴大小進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)了較大的衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)囊蚴，最大尺寸大小約541 μm×564 μm，可能為三倍體型囊蚴[15,16]。大型品系肺吸蟲(chóng)囊蚴一旦被人體誤食，極易引起咳嗽、咯血、咯痰及浸潤(rùn)性、囊腫和結(jié)節(jié)等較重的臨床癥狀，故應(yīng)引起科研人員以及臨床醫(yī)務(wù)人員的高度重視。