草魚(yú)jam-a分子在胚胎幼魚(yú)期及受GCRV感染PSF細(xì)胞的表達(dá)分析*

田園園 焦真真 孫成飛 董浚鍵 江小燕 胡 婕 葉 星

草魚(yú)分子在胚胎幼魚(yú)期及受GCRV感染PSF細(xì)胞的表達(dá)分析*

田園園 焦真真 孫成飛 董浚鍵 江小燕 胡 婕 葉 星①

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510380)

草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)可引發(fā)草魚(yú)()出血病，導(dǎo)致高死亡率。草魚(yú)吻端成纖維細(xì)胞(Grass carp snout fibroblast cells, PSF)是GCRV的敏感細(xì)胞系。JAM-A (Junctional adhesion molecule A)為免疫球蛋白超家族成員，是多種病毒的細(xì)胞受體。本研究在前期克隆到草魚(yú)3種基因，命名為1，2和3。在獲取ORF序列的基礎(chǔ)上，利用qRT-PCR分析了3種在草魚(yú)胚胎及幼魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期及PSF細(xì)胞中受GCRV(GD108株)感染前后的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，檢測(cè)的13個(gè)胚胎及幼魚(yú)發(fā)育時(shí)期中，1在未受精卵中高表達(dá)，在受精卵至出膜前的胚胎表達(dá)水平均較低；從出膜后1~3 d表達(dá)量開(kāi)始上升；出膜6~15 d均呈高水平表達(dá)。2與3在草魚(yú)胚胎及幼魚(yú)發(fā)育各階段表達(dá)水平較低。在無(wú)病毒感染的PSF細(xì)胞中，只有少量表達(dá)。受GCRV-GD108感染后，病毒基因在PSF細(xì)胞中的拷貝數(shù)隨時(shí)間呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，的表達(dá)量也有不同程度的上調(diào)，mRNA上調(diào)水平為1>2>3。本研究證實(shí)了3種基因在PSF細(xì)胞中的表達(dá)均與GCRV-GD108感染相關(guān)，其中，1的表達(dá)水平受GCRV-GD108感染影響最大，同時(shí)，它在孵化出膜后表達(dá)上升，推測(cè)它可能與病毒的感染更相關(guān)。1可作為下一步GCRV與宿主互作研究中的候選分子。

草魚(yú)吻端成纖維細(xì)胞；GCRV；；qRT-PCR；胚胎及幼魚(yú)發(fā)育；病毒受體

草魚(yú)()是全國(guó)最大宗的淡水養(yǎng)殖品種，2016年產(chǎn)量達(dá)589.88萬(wàn)t，約占淡水養(yǎng)殖魚(yú)產(chǎn)量18.55% (王莎, 2017)，是我國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究的重要對(duì)象(趙睿等, 2016; 曾本和等, 2017)。草魚(yú)養(yǎng)殖期間尤其是魚(yú)種階段易暴發(fā)出血病，導(dǎo)致高死亡率，給草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。1983年，我國(guó)首次報(bào)道引起草魚(yú)出血病的主要病原為草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)。GCRV屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)、水生呼腸孤病毒屬()，代表株為GCRV873。GCRV被認(rèn)為是水生呼腸孤病毒中致病力最強(qiáng)的一個(gè)毒株(Rangel, 1999)。近年，本實(shí)驗(yàn)室在廣東地區(qū)養(yǎng)殖草魚(yú)病魚(yú)體中分離到的出血病致病原GCRV-GD108株，與GCRV873分子水平上具有顯著差異，與正呼腸孤病毒屬()病毒具有較近的進(jìn)化關(guān)系(Ye, 2012)。隨著越來(lái)越多GCRV毒株被分離并報(bào)道，根據(jù)基因組序列差異將它們分成GCRVⅠ、Ⅱ、Ⅲ3個(gè)型，GCRV-GD108被認(rèn)為是Ⅱ型的代表株(Zhang, 2017; Pei, 2014)。對(duì)廣東、福建、湖南、江蘇等地的草魚(yú)病毒流行株檢測(cè)結(jié)果顯示，它們均具有與GCRV-GD108相似的分子特征，提示GCRV-GD108株在南方流行株中具有代表性(遲妍妍等, 2011)。病毒感染的第一步是侵入宿主細(xì)胞，目前對(duì)GCRV入侵宿主機(jī)制的研究甚少，因此，深入研究GCRV-GD108的入侵及感染機(jī)制，明確其細(xì)胞受體，可為草魚(yú)出血病的治療和預(yù)防藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

JAM-A(Junctional adhesion molecule-A)為免疫球蛋白超家族的成員，是由突出于細(xì)胞表面的N端免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域連接形成的同源二聚體，屬于緊密連接(Tight junction, TJ)分子的一種(Severson, 2009)。哺乳動(dòng)物中，JAM-A參與一系列生理及病理活動(dòng)，包括細(xì)胞極性(Rehder, 2006)、炎癥反應(yīng)(Vetrano, 2008)、血腦屏障(Yeung, 2008)、白血球遷移(Bradfield, 2007)、血管再生(Zhao, 2017)等，并與浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移癌密切相關(guān)(Kurose, 2016)。在魚(yú)類中JAM-A的報(bào)道較少，斑馬魚(yú)()中的研究發(fā)現(xiàn)，JAM-A在造血干細(xì)胞分化及肌肉發(fā)育中起重要作用(Kobayashi, 2014)，紅鼓魚(yú)()中的研究表明，JAM-A可能是胞內(nèi)菌免疫逃逸的靶位點(diǎn)(Zhang, 2014)。某些病毒可利用宿主細(xì)胞緊密連接的不同組件以完成其感染周期，目前已經(jīng)證實(shí)，JAM-A是哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒(Mammalian reovirus, MRV) (Guglielmi, 2007)、貓杯狀病毒(Feline calicivirus) (Makino, 2006)以及輪狀病毒(Rotaviruses) (Torres-Flores, 2015)的受體。Du等(2013)首次在草魚(yú)中克隆到基因全長(zhǎng)，并推測(cè)JAM-A可能是GCRV的受體分子。Zhang等(2017)進(jìn)一步利用蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)方法分析蛋白之間基序-結(jié)構(gòu)域互作(Motif-domain interactions)，預(yù)測(cè)JAM-A與GCRV fiber蛋白的基序互相作用，并發(fā)現(xiàn)其互作類似于MRV與JAM-A的作用模式。

本課題組前期研究在草魚(yú)組織中克隆到3種JAM-A cDNA，分別命名為1，2，3，編碼294~295個(gè)氨基酸多肽，其推演氨基酸序列相似性為93%~97%，均具有2個(gè)JAM-A典型的免疫球蛋白Ig結(jié)構(gòu)域(田園園等, 2017)。在此基礎(chǔ)上，本研究利用qRT-PCR分析了3種在草魚(yú)胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，以及GCRV-GD108感染前后在病毒敏感株P(guān)SF細(xì)胞中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步明確GCRVⅡ型受體提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)：草魚(yú)吻端成纖維細(xì)胞(PSF)在75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃左右，經(jīng)2~3 d即可長(zhǎng)成致密單層貼壁細(xì)胞。

GCRV-GD108組織病毒液的制備和保存：實(shí)驗(yàn)室保存的毒價(jià)104.87LD50/ml的GCRV-GD108病毒液按照1︰10用生理鹽水稀釋，腹腔注射攻毒2月齡草魚(yú)(體長(zhǎng)約為10 cm, 體重為10~15 g)，觀察2周。發(fā)病草魚(yú)肌肉、腸道、口腔、下頜、鰓蓋充血，體表發(fā)黑，7 d后開(kāi)始死亡。收集發(fā)病草魚(yú)，取鰓、肝、腸、腎等充血組織約0.1 g，加入1 ml冷生理鹽水充分勻漿，于4℃ 12000 r/min離心30 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，保存于-70℃冰箱。

1.2 草魚(yú)胚胎及幼魚(yú)

實(shí)驗(yàn)用草魚(yú)胚胎取自廣東省佛山百容水產(chǎn)良種有限公司。取源自同一對(duì)草魚(yú)親本的受精卵，顯微鏡下觀察其胚胎發(fā)育時(shí)期，分別取未受精卵、受精卵、囊胚期、神經(jīng)胚期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心臟出現(xiàn)期、出膜期、出膜后第2、3、6、10、15天共13個(gè)時(shí)期的胚胎和幼魚(yú)，出膜前各期樣品10枚卵/組，出膜后幼魚(yú)4尾/組，每個(gè)時(shí)期各3組。

1.3 qRT-PCR分析胚胎發(fā)育時(shí)期gcjam-a表達(dá)模式

草魚(yú)胚胎發(fā)育各時(shí)期的樣品置于離心管中，經(jīng)Trizol快速潤(rùn)洗后，再加入1 ml Trizol (Invitrogen, 美國(guó))，勻漿后保存于?70℃。收集各發(fā)育時(shí)期的胚胎后，按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取RNA?？俁NA用DNaseⅠ(TaKaRa, 大連)去除基因組DNA。利用分光光度計(jì)Biophotometer (Eppendorf, 德國(guó))及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度及純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒First- Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (全式金, 北京)合成cDNA，反應(yīng)體系如下：總RNA 100 ng，5×Transcript All-in-One Super Mix 4 μl，gDNA Remover 1 μl，RNase-free H2O補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)程序：42℃ 15 min；85℃酶滅活 5 s；-20℃保存。所有反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均為2個(gè)重復(fù)。

設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增3種特異片段(qRT- primerA1, A2, A3, 表1)，18S作為內(nèi)參基因(定量引物18S, 表1)。利用草魚(yú)組織cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，經(jīng)膠回收、純化后連入pEASY-Blunt Zero克隆載體(全式金, 北京)進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)插入正確。純化質(zhì)粒經(jīng)Biophotometer濃度檢測(cè)后，進(jìn)行梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建(田園園等, 2017)。

表1 用于草魚(yú)、GCRV-GD108基因擴(kuò)增及qRT-PCR的引物

Tab.1 Primers of gcjam-a and GCRV-GD108 S7 used in PCR and qRT-PCR

qRT-PCR按以下步驟進(jìn)行：根據(jù)TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金，北京)說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)體系：cDNA模板1 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，2′Super Mix 10 μl，Passive Reference DyeⅠ(50′) 0.4 μl，ddH2O 8.8 μl。擴(kuò)增時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，循環(huán)體系如下：94℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)：94℃5 s，60℃30 s。溶解曲線：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s；60℃ 15 s。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本重復(fù)3次，所有樣本都與管家基因18S一同運(yùn)行，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)值均大于0.998，相應(yīng)的實(shí)時(shí)PCR效率為0.90~ 1.10。mRNA表達(dá)量用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法計(jì)算，用歸一化值表示，歸一化值=目的基因濃度均值/內(nèi)參基因濃度均值，用歸一化值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)的形式表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。利用Origin 6.0對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行作圖。

1.4 qRT-PCR分析GCRV-GD108在PSF細(xì)胞中的增殖

GCRV-GD108感染PSF細(xì)胞，具體步驟如下：25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning, 美國(guó))中培養(yǎng)的PSF細(xì)胞密度約為15.3×104個(gè)/ml時(shí)，倒去培養(yǎng)液，用3 ml PBS洗滌2次，加入1 ml胰酶(Difco, 美國(guó))消化，前后搖勻。細(xì)胞脫落后，將細(xì)胞吹打均勻，以1∶500體積比將組織病毒液加入15 ml無(wú)血清的M199細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco, 美國(guó))中，均分裝于3個(gè)25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，28℃吸附45 min后倒掉病毒液，每瓶加入5 ml含8%犢牛血清(Gibco, 美國(guó))的細(xì)胞培養(yǎng)液，28℃培養(yǎng)。

PSF細(xì)胞總RNA提取步驟如下：每24 h取3瓶PSF細(xì)胞棄培養(yǎng)液，連續(xù)取8 d。分別用3 ml預(yù)冷PBS洗2次，然后分別加入1 ml Trizol裂解，保存于-70℃。按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取RNA?？俁NA用DNaseⅠ去除基因組DNA并檢測(cè)其濃度及純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒First-Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR (全式金, 北京)合成cDNA，反應(yīng)體系如下：細(xì)胞總RNA 100 ng，5×Transcript All-in-One Super Mix 4 μl，gDNA Remover 1 μl，RNase-free H2O補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)程序：42℃ 15 min；85℃酶滅活5 s；-20℃保存。所有反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均為2個(gè)重復(fù)。

利用qRT-PCR引物(表1)，保存的全長(zhǎng)克隆載體為模板對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，經(jīng)膠回收、純化后連入pEASY-Blunt Zero克隆載體進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)插入正確。純化質(zhì)粒經(jīng)Biophotometer濃度檢測(cè)后，進(jìn)行梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建。采用絕對(duì)定量法檢測(cè)細(xì)胞中病毒表達(dá)量。

根據(jù)TransStart Tip Green qPCR SuperMix說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)體系：上述cDNA模板1 μl，上、下游引物(10 mmol/L)各0.4 μl，2′Super Mix 10 μl，Passive Reference Dye Ⅰ(50′) 0.4 μl，ddH2O 7.8 μl。擴(kuò)增時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，循環(huán)體系如下：94℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)：94℃ 5 s，60℃ 30 s。溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本重復(fù)3次，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)值均大于0.998，相應(yīng)的實(shí)時(shí)PCR效率為0.90~1.10。表達(dá)量以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)的形式表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Origin 6.0對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行作圖。

1.5 qRT-PCR分析GCRV-GD108感染前后gcjam-a表達(dá)模式

提取病毒感染前后PSF細(xì)胞總RNA做模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照1.3所述，利用特異引物(qRT- primerA1, A2, A3, 表1)，根據(jù)TransStart Tip Green qPCR SuperMix (全式金)說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，18S作為內(nèi)參基因(定量引物18S, 表1)。qRT-PCR反應(yīng)體系及數(shù)據(jù)處理參照1.3。

2 結(jié)果

2.1 gcjam-a胚胎幼魚(yú)期表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR對(duì)3種在草魚(yú)胚胎不同發(fā)育時(shí)期及幼魚(yú)期的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，其中，包括未受精卵、受精卵、囊胚期、心臟出現(xiàn)期等至出膜第15天共13個(gè)發(fā)育階段。結(jié)果顯示，1在未受精卵中的表達(dá)水平最高；受精卵至孵化出膜前的幼魚(yú)表達(dá)水平均較低；從出膜后1~3 d表達(dá)量開(kāi)始上升，出膜6~15 d均呈現(xiàn)高表達(dá)水平。2與3的結(jié)果相似，與1相比在草魚(yú)胚胎發(fā)育時(shí)期為極低水平表達(dá)(圖1)。

2.2 GCRV-GD108在PSF細(xì)胞中的增殖

病毒感染后，草魚(yú)PSF細(xì)胞中的表達(dá)量出現(xiàn)顯著變化，具體表現(xiàn)為感染后的第3天開(kāi)始出現(xiàn)上升趨勢(shì)，第5天出現(xiàn)顯著上升，到第8天達(dá)到最大值(為第1天的432倍) (圖2)。

2.3 GCRV-GD108感染PSF細(xì)胞前后gcjam-a的表達(dá)變化

在無(wú)感染的PSF細(xì)胞中，3種mRNA只有少量表達(dá)，維持在較低水平，其中，2表達(dá)水平高于其他2個(gè)分子(圖3)。GCRV-GD108感染PSF細(xì)胞后，3種在細(xì)胞中的表達(dá)量呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)趨勢(shì)(圖3)。各基因mRNA上調(diào)水平(表達(dá)量變化)為1>2>3。1表達(dá)量在病毒感染后第3天開(kāi)始上升，第7天達(dá)到最大值(為感染第1天的3329倍)，第8天有下降趨勢(shì)，但仍維持在較高水平；2的表達(dá)量自感染后第3天開(kāi)始出現(xiàn)上升趨勢(shì)，第6天開(kāi)始上升幅度變大，第7天時(shí)呈下降趨勢(shì)，在第8天時(shí)達(dá)到最大值(為感染第1天的784倍)；3自病毒感染后3 d開(kāi)始出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，從第4天開(kāi)始上升幅度變大，在6 d時(shí)達(dá)到最大值(為感染第1天的47倍)。

圖1 qRT-PCR分析gcjam-a1在草魚(yú)胚胎發(fā)育各時(shí)期及早期幼魚(yú)期中的相對(duì)表達(dá)量

1~13分別代表未受精卵、受精卵、囊胚期、神經(jīng)胚期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心臟出現(xiàn)期、出膜期、出膜第2、3、6、10、15天13個(gè)時(shí)期。mRNA表達(dá)量用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法計(jì)算，用歸一化值表示，歸一化值=目的基因濃度均值/內(nèi)參基因濃度均值，用歸一化值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)的形式表示

1~13 represent unfertilized egg, fertilized egg, gastrula stage, nerve embryonic stage, tail bud stage, muscle effecting phase, heart beating phase, hatching phase, 2 days post hatching (dph), 3 dph, 6 dph, 10 dph, and 15 dph, respectively. mRNA relative expression values were calculated by the relative quantification method using double standard curve, and results were showed as normalized values, normalized value=mean value of target gene concentration/mean value of internal reference gene, showed as normalized value±standard error (SE)

圖2 qRT-PCR分析GCRV-GD108 S7在病毒感染PSF細(xì)胞中的表達(dá)量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

圖3 qPCR分析gcjam-a在細(xì)胞中的表達(dá)情況(歸一化值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

3 討論

病毒感染宿主需要經(jīng)過(guò)一個(gè)完整的復(fù)制周期，包括病毒的吸附、穿入細(xì)胞內(nèi)、脫殼、生物合成、病毒顆粒裝配、釋放等過(guò)程(Schulz, 2012)。細(xì)胞表面受體在病毒吸附和侵入細(xì)胞時(shí)能特異性的與病毒表面衣殼蛋白結(jié)合，是病毒入侵的首要步驟，也被認(rèn)為是病毒宿主范圍的一個(gè)決定因素。有囊膜的病毒如人體免疫缺損病毒(艾滋病毒HIV)(Bartesaghi, 2013)、流感病毒(Influenza virus)(Skehel, 2000)等，其通過(guò)膜融合入侵宿主的機(jī)制已得到深入研究。在侵染過(guò)程中，病毒的磷脂雙分子層跟細(xì)胞膜融合，從而經(jīng)過(guò)內(nèi)吞作用入膜(Harrison, 2015)。無(wú)囊膜病毒中哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒MRV入侵宿主機(jī)制已有較為詳盡的研究(Banerjee, 2008)。MRV的outer-fiber蛋白σ1蛋白呈高度伸展的構(gòu)型，以帶有頭尾的長(zhǎng)纖維狀突出于病毒粒子表面，在病毒感染時(shí)結(jié)合宿主細(xì)胞(Danthi, 2010)。細(xì)胞表面受體JAM-A由突出于細(xì)胞表面的N端免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域連接形成同源二聚體結(jié)構(gòu)，病毒感染入膜時(shí)σ1破壞JAM-A二聚物，并與其中一個(gè)JAM-A分子連接，隨后細(xì)胞β1整合素介導(dǎo)病毒發(fā)生內(nèi)吞作用，接著病毒的核心顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中(Kirchner, 2008)。JAM-A二聚體的解體、σ1與JAM-A單體的連接是哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒感染開(kāi)始的觀點(diǎn)已被普遍接受(Danthi, 2013)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，JAM-A對(duì)病毒的血行性傳播起決定作用(Antar, 2009)。

水生呼腸孤病毒與正呼腸孤病毒親緣關(guān)系較近，蛋白序列間有較高的同源性，有9個(gè)同源蛋白，在結(jié)構(gòu)上也具有相似性(Kim, 2004; Nibert, 2013)。根據(jù)基因組序列分析，GCRV-GD108與其他已知水生呼腸孤病毒相比，與MRV進(jìn)化關(guān)系上更近(Ye, 2012)，在前期研究中，通過(guò)中和實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)GCRV-GD108編碼的σ1同源蛋白fiber可與PSF細(xì)胞穩(wěn)定結(jié)合，是病毒的細(xì)胞吸附蛋白(Tian, 2017)。并從草魚(yú)中克隆到1，2，3 cDNA序列，3個(gè)的跨膜結(jié)構(gòu)域D2序列完全一致，而病毒結(jié)合結(jié)構(gòu)域D1序列則稍有差別，其中，3與Du等(2013)報(bào)道的草魚(yú)JAM-A序列相同。qRT-PCR分析顯示，草魚(yú)幼魚(yú)受病毒感染后，3種mRNA在草魚(yú)鰓組織中的表達(dá)均出現(xiàn)顯著上調(diào)，而在肝臟、脾臟、腸、腎與腦中只有1的表達(dá)有不同程度的上調(diào)，說(shuō)明1與病毒感染關(guān)系更密切(田園園等, 2017)。

本研究發(fā)現(xiàn)，1在未受精卵中有較高表達(dá)，但在受精卵至心臟效應(yīng)期表達(dá)水平較低；出膜第1~3天的幼魚(yú)表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，第6~15天呈現(xiàn)高水平表達(dá)。其他2個(gè)在受精卵及檢測(cè)的胚胎發(fā)育階段及幼魚(yú)期的表達(dá)量均較低。本研究1在胚胎發(fā)育時(shí)期及幼魚(yú)的表達(dá)趨勢(shì)與Du等(2013)的研究相似。Du等(2013)研究發(fā)現(xiàn)，在未受精卵中表達(dá)，受精后48 h內(nèi)表達(dá)逐漸下調(diào)，受精后56 h表達(dá)水平又開(kāi)始升高，表現(xiàn)出母源性表達(dá)。斑馬魚(yú)在未受精卵中無(wú)表達(dá)，受精14 h后在側(cè)中胚層后部?jī)蓚?cè)表達(dá)，這個(gè)部位將發(fā)育成內(nèi)皮織及造血系統(tǒng)(Kobayashi, 2014)。對(duì)小鼠JAM-A在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析顯示，小鼠JAM-A也是在受精后才開(kāi)始表達(dá)(Aurrand- Lions, 2001)。

草魚(yú)吻端成纖維細(xì)胞是GCRV的敏感株，李煥林等(1988)建立了草魚(yú)吻端成纖維細(xì)胞系，許淑英等(1994)利用該敏感細(xì)胞系使用離體細(xì)胞培養(yǎng)法制備GCHV-841株弱毒疫苗，其免疫保護(hù)性高達(dá)100%。在對(duì)草魚(yú)出血病病原學(xué)、流行病學(xué)以及免疫學(xué)的研究過(guò)程中，研究人員建立了多株草魚(yú)細(xì)胞系，如草魚(yú)腎細(xì)胞系和草魚(yú)性腺細(xì)胞系等(王津津等, 2016)。李賢等(2016)利用GCRV HZ08株接種PSF細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與其他幾種細(xì)胞系相比，GCRVⅡ在PSF中增殖量較其他草魚(yú)細(xì)胞系大。GCRV-GD108感染PSF細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，不產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(Ye, 2012)，可能是因?yàn)镚CRVⅡ型缺少其他水生呼腸孤病毒如GCRVⅠ型中的“FAST”蛋白(Fusion-associated small transmembrane protein)，不能使被感染細(xì)胞形成合胞體從而產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(Nibert, 2013)，因此，增加了對(duì)病毒增殖觀察的難度。本研究通過(guò)檢測(cè)GCRV-GD108基因的表達(dá)量以了解病毒在PSF的增殖情況。

GCRV-GD108感染草魚(yú)PSF細(xì)胞后，病毒基因的拷貝數(shù)即病毒的增殖量隨時(shí)間呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，到感染后第8天達(dá)到最大值。PSF細(xì)胞感染病毒后，3種的表達(dá)量隨病毒增殖均有不同程度的上調(diào)趨勢(shì)，但其上升水平存在差異，1的表達(dá)量升幅最高，表明PSF細(xì)胞中3種表達(dá)均與病毒的感染相關(guān)，但1受病毒感染影響更大。這與病毒攻毒后在草魚(yú)幼魚(yú)鰓等組織中的表達(dá)量變化結(jié)果一致，說(shuō)明1與病毒感染關(guān)系更緊密。在本研究基礎(chǔ)上，已經(jīng)構(gòu)建了3種的真核表達(dá)載體以及RNAi載體，擬進(jìn)一步在細(xì)胞水平上了解與GCRV-GD108感染的相關(guān)性。

本研究采用qRT-PCR檢測(cè)3種在草魚(yú)胚胎發(fā)育期及幼魚(yú)期以及在PSF細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，3種隨病毒的感染呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)，證實(shí)它們與病毒感染密切相關(guān)。其中，1在草魚(yú)中呈母源性表達(dá)，在草魚(yú)幼魚(yú)組織和PSF細(xì)胞中的表達(dá)量均高于2和3，并且其在PSF細(xì)胞中的表達(dá)受病毒感染影響最大，因此，推測(cè)1與GCRV-GD108感染關(guān)系更密切。本研究為進(jìn)一步研究GCRV入侵機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，并為草魚(yú)出血病防治提供新靶標(biāo)和新途徑。

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Expression Analysis ofs in GCRV-infected Grass Carp () PSF Cells and During the Embryo and Juvenile Stages

TIAN Yuanyuan, JIAO Zhenzhen, SUN Chengfei, DONG Junjian, JIANG Xiaoyan, HU Jie, YE Xing①

(Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510380)

Grass carps are seriously threatened by GCRV (grass carp reovirus) that can cause high mortality to fingerling and yearling grass carps. Grass carp snout fibroblast cells (PSF) are highly sensitive to GCRV. Junctional adhesion molecule A (JAM-A), an immunoglobulin superfamily member, acts as a viral cell receptor. In our previous study, the cDNA sequences of grass carp1,2, and3 (named1,2, and3) were cloned. Based on this, qRT-PCR was used to analyze the expression pattern ofs at different embryonic and juvenile development stages and in GCRV-GD108-infected PSF cells. The results showed that the expression pattern of1, 2, and 3 differed during the embryonic development stages. mRNA expression of1 could be detected in unfertilized eggs and at a lower level from the fertilized egg stage to 1 dph (day post hatch). However, the mRNA was highly expressed at 1~3 dph and high levels were maintained from 3 dph to the end of the experiment (15 dph). The expression of2 and3 was very low at different embryonic development stages compared to that of1.s were only slightly expressed in non-infected PSF cells. After GCRV-GD108 infection, the expression ofin PSF cells increased significantly, and the expression ofs in PSF cells also increased to different levels after GCRV-GD108 infection. Upregulation of thes was in the order:1>2>3. The results showed that the expression ofs was related to GCRV infection in PSF cells and that the expression of1 was mostinfluenced by GCRV-GD108 infection. It is also expressed in early embryonic development, suggesting that1 is the most relevant to GCRV infection. This study will lay the foundation for further research on GCRV receptors.

PSF; GCRV;; qRT-PCR; Embryonic and juvenile development; Viral receptor

YE Xing, E-mail: gzyexing@163.com

* 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2016HY-ZC0602)和廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017B090901001)共同資助[This work was supported by Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2016HY-ZC0602), and Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China (2017B090901001)].田園園，E-mail: tianyuan320@163.com

葉 星，研究員，E-mail: gzyexing@163.com

2018-05-21,

2018-08-22

S917.4

A

2095-9869(2019)05-0126-08

10.19663/j.issn2095-9869.20180521001

http://www.yykxjz.cn/

田園園, 焦真真, 孫成飛, 董浚鍵, 江小燕, 胡婕, 葉星. 草魚(yú)分子在胚胎幼魚(yú)期及受GCRV感染PSF細(xì)胞的表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(5): 126–133

Tian YY, Jiao ZZ, Sun CF, Dong JJ, Jiang XY, Hu J, Ye X. Expression analysis ofs in GCRV-infected grass carp () PSF cells and during the embryo and juvenile stages. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(5): 126–133

(編輯 馬璀艷)