大腸桿菌 O157溶源性噬菌體的誘導(dǎo)及鑒定

李 雷，于 婧

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 第一手術(shù)室,吉林 長(zhǎng)春130021)

致病性大腸桿菌O157是重要的食源性致病微生物，O157:H7是腸出血性大腸桿菌常見(jiàn)的血清型,是以食物為主要傳播途徑的致病菌,牛、羊、豬和雞等家畜家禽是其主要宿主[1，2]，該菌致病性強(qiáng)、致死率高，引起全世界廣泛重視[3]。溶源性作為溫和噬菌體與宿主共存的一種現(xiàn)象廣泛存在于自然界中。目前，物理或化學(xué)的方法是誘導(dǎo)溶源狀態(tài)的噬菌體進(jìn)入裂解周期的重要手段。國(guó)內(nèi)外學(xué)者曾利用絲裂霉素C(MMC)誘導(dǎo)溶源性嗜鹽古生菌及溶源性單增李斯特菌產(chǎn)生噬菌體[4，5]，但對(duì)溶源性大腸桿菌 O157誘導(dǎo)的具體方法探討較少，本研究利用絲裂霉素C作為溶源狀態(tài)噬菌體的誘導(dǎo)劑,設(shè)定不同的濃度梯度和時(shí)間梯度，具體討論從大腸桿菌 O157中誘導(dǎo)產(chǎn)生噬菌體的條件及方法,并對(duì)誘導(dǎo)后的噬菌體基因組進(jìn)行初步鑒定，為今后從溶源性大腸桿菌O157中誘導(dǎo)噬菌體提供方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料13株大腸桿菌 O157(YJ01、YJ02、YJ03、YJ04、YJ05、YJ06、YJ07、YJ08、YJ09、YJ10、YJ11、YJ12、YJ13)分離自長(zhǎng)春地區(qū)養(yǎng)牛場(chǎng)，并經(jīng)VITEK-32全自動(dòng)微生物分析鑒定系統(tǒng)分析鑒定。

1.2 溶源性噬菌體誘導(dǎo)[6]①?gòu)钠桨迳咸羧〈竽c桿菌O157單菌落,接種于LB液管中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。②將活化的菌種以5%的接種量接入LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。③添加絲裂霉素C,使其終濃度達(dá)到0.5 μg/ml,靜置培養(yǎng)16 h,4 000×g離心30 min，上清用0.22 μm濾膜過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 噬菌體制備及電鏡觀察遵循噬菌體顆粒提取的經(jīng)典方法，制備噬菌體顆粒，參照Lu Z等的文獻(xiàn)[7]。在復(fù)膜銅網(wǎng)上滴15 μl左右噬菌體顆粒懸液，等待15 min，用1滴2%磷鎢酸染色，待銅網(wǎng)干燥后，于電壓80 kv的條件下，采用Hitachi透射電鏡觀察并拍照[8]。

1.4 噬菌體核酸的提取及酶切分析噬菌體全基因組的提取依照噬菌體基因組DNA提取的傳統(tǒng)方法進(jìn)行[9]。提取的噬菌體全基因組首先經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸提取質(zhì)量及其純度，然后分別用 DNA酶I、綠豆核酸酶、RNA酶A三種酶對(duì)噬菌體基因組進(jìn)行消化，最終再次通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，從而初步鑒定噬菌體核酸類(lèi)型。

2 結(jié)果

2.1 噬菌斑形態(tài)觀察誘導(dǎo)結(jié)果用瓊脂雙層鋪板檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，未經(jīng)過(guò)絲裂霉素C誘導(dǎo)的O157觀察不到噬菌斑，整塊平皿模糊、不透明，表明沒(méi)有噬菌體釋放。用絲裂霉素C 誘導(dǎo)后的細(xì)菌培養(yǎng)物的濾液，在濾液未作稀釋時(shí)，可以看到大量的噬菌斑連成一片。濾液稀釋10-1和10-2培養(yǎng)10-12 h，可以觀察到單個(gè)噬菌斑，噬菌斑較小，且噬菌斑周?chē)胁煌该鲿炄Γ删咧睆皆?.6-0.8 mm(圖1)。

2.2 電鏡觀察將噬菌體粗制顆粒經(jīng)負(fù)染，電鏡觀察并拍攝，電鏡觀察結(jié)果顯示，該噬菌體頭部直徑約80 nm、尾長(zhǎng)約180 nm(圖2)，將其命名為DM001，從而證實(shí)噬菌體誘導(dǎo)成功。根據(jù)ICTV的最新分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，噬菌體DM001隸屬于有尾噬菌體目肌尾病毒科[10，11]。

2.3 酶切分析提取的噬菌體基因組瓊脂糖凝膠電泳顯示只有一條清晰的條帶(圖3)，說(shuō)明在此條件下僅誘導(dǎo)出1種噬菌體，且該噬菌體所提取的核酸沒(méi)有宿主菌O157基因組的污染。RNAseA及綠豆核酸酶對(duì)該噬菌體基因組均不產(chǎn)生影響，電泳結(jié)果顯示噬菌體基因組仍然完整并未降解，但核酸酶DNaseI組噬菌體基因組完全被降解，電泳結(jié)果并未出現(xiàn)條帶，由此可以斷定，DM001基因組為雙鏈DNA。經(jīng)BandScan軟件分析，DM001大小約為30 Kb。

3 討論

國(guó)內(nèi)外大量的研究及生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，在各類(lèi)微生物基因組中都廣泛存在著溶源噬菌體或其基因組片段。但由于敏感菌株篩選較難得到，這些溶源噬菌體的存在經(jīng)常在研究中被人們忽視[12]。溶源狀態(tài)是一種十分穩(wěn)定的存在狀態(tài)，在宿主菌中可持續(xù)存在多代。但在某些條件如紫外線(xiàn)、致癌劑、突變劑、X線(xiàn)等作用下，可打破其原有的溶源周期，使噬菌體進(jìn)入溶菌性周期，這種現(xiàn)象稱(chēng)為前噬菌體的誘導(dǎo)與切離(excision)，發(fā)生率約為10-2-10-5[13]。但仍存在另一種奇特現(xiàn)象，有少數(shù)溶源性細(xì)菌中的前噬菌體，它們?cè)诶眉?xì)菌的系統(tǒng)合成自身的基因組后，并不立刻組裝成成熟噬菌體對(duì)宿主菌進(jìn)行攻擊，這個(gè)現(xiàn)象即稱(chēng)為"治愈"。溶源性細(xì)菌是一種較頑強(qiáng)存在，相比于同種細(xì)菌，它對(duì)同種或有親緣關(guān)系較近的噬菌體的抵抗力更強(qiáng)，從而使宿主菌獲得某種噬菌體免疫性[14]。

圖1 噬菌斑形態(tài) 圖2 噬菌體DM001電鏡圖像圖3 噬菌體基因組的核酸酶消化結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)首先利用絲裂酶素C 進(jìn)行溶源性噬菌體的誘導(dǎo)，從13株大腸桿菌O157菌株中誘導(dǎo)獲得一株溶源性噬菌體，命名為DM001，誘導(dǎo)比例為7.69%，顯示出較高的誘導(dǎo)率。然后透射電鏡觀察證實(shí)噬菌體誘導(dǎo)成功，證實(shí)獲得1株溶源性噬菌體。結(jié)果表明，用絲裂霉素誘導(dǎo)溶源性噬菌體進(jìn)入裂解周期是可行的，并且成功率較高。經(jīng)分析得出，在絲裂霉素C的終濃度為1 μg/ml，經(jīng)15 h誘導(dǎo)，進(jìn)入裂解周期的噬菌體最多，噬菌斑數(shù)量肉眼可見(jiàn)量最大，故為誘導(dǎo)的最佳條件。最后利用綠豆核酸酶、RNAseA和 DNaseI分別對(duì)噬菌體基因組進(jìn)行消化，瓊脂糖凝膠電泳確定其核酸類(lèi)型為雙鏈DNA，經(jīng)BandScan軟件分析，得出初步結(jié)果，噬菌體DM001基因組大小約為30 Kb，確定噬菌體為一株雙鏈DNA的細(xì)菌病毒，提取DNA后已進(jìn)行測(cè)序，以便下一步在基因水平上進(jìn)行深入討論。