支氣管肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測(cè)對(duì)肺癌的診斷價(jià)值

陳瑞英，劉 雅，孫 婷，劉峰輝，馬小花

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸及睡眠科鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院呼吸科鄭州450052

提高肺癌診斷率并及早治療是降低肺癌高死亡率的關(guān)鍵［1-2］。在美國，低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描(low-dose computed tomography，LDCT)篩查已被證明可降低高危肺癌患者的死亡率，但LDCT篩查存在假陽性及過度診斷的問題［3］。對(duì)疑似肺癌患者，通過纖維支氣管鏡獲取活組織檢查是確診肺癌常用的侵襲性方法，但其診斷陽性率受病灶部位、大小、肺部合并癥等因素影響，大約50%患者首次支氣管鏡檢呈陰性結(jié)果［4］。支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細(xì)胞學(xué)檢查一定程度上不受病灶位置限制，但受人為因素影響大，靈敏度低(43% ～48%)。因此，需要探索一種高度敏感、特異的BALF分析方法作為病理學(xué)檢查的補(bǔ)充，以提高肺癌的診斷率。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的重要方面，其與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，參與了細(xì)胞癌變過程中的早期事件［5］。隨著以甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MS-PCR)為代表的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)多種基因的甲基化狀態(tài)與肺癌關(guān)系密切［6-8］。矮小同源盒基因2(short stature homobox 2，SHOX2)是目前肺癌診斷中研究較多的甲基化指標(biāo)，無論單獨(dú)還是與組織/細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合應(yīng)用，可以有效提高肺癌檢出率［9-11］;研究［10，12］還顯示，不同肺癌病理類型中存在組織特異性甲基化水平改變。Ras相關(guān)區(qū)域家族蛋白1A(ras-association domain family 1A，RASSF1A)被認(rèn)為是新型抑癌基因，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，90%以上的小細(xì)胞肺癌及50% ～80%的非小細(xì)胞肺癌RASSFlA呈雜合性或純合性缺失，RASSF1A在肺癌中存在著較高的表達(dá)。本研究測(cè)定了可疑肺癌患者BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化狀態(tài)，評(píng)估其在肺癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 研究對(duì)象均來自于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，研究方案經(jīng)該院倫理委員會(huì)同意并與患者簽署知情同意書。收集2015年1月至2017年6月在該院就診、經(jīng)胸部影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肺部高密度陰影病灶或有其他肺部癥狀(咳嗽、咯血、胸悶、胸腔積液等)的疑似肺癌患者276例，進(jìn)一步經(jīng)組織病理學(xué)和(或)BALF細(xì)胞學(xué)確診，原發(fā)性肺癌患者131例(病理類型:肺腺癌47例，鱗癌44例，小細(xì)胞肺癌31例，大細(xì)胞肺癌5例，其他類型4例;分期:Stage 0期5例，Ⅰ期18例，Ⅱ期32例，Ⅲ期39例，Ⅳ期28例，分期未明9例)，肺部良性疾病145例。肺癌組年齡(59．15±13．25)歲，肺部良性疾病組年齡(60．56±13．45)歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0．878，P=0．381)。肺癌組男性患者 91 例，女性40例;肺部良性疾病組男性患者115例，女性30例，性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1．041，P=0．308)。

1．2 BALF留取與病理分析 276例患者均接受纖維支氣管鏡檢查，操作符合2013年英國胸科協(xié)會(huì)成人纖支鏡檢操作規(guī)范［15］。在病變肺段注入37℃滅菌生理鹽水50 mL，立即用負(fù)壓吸引回收灌洗液，共灌洗2次，記錄回收的BALF總量(每位患者回收量不低于40 mL);然后進(jìn)行支氣管活檢，采集組織學(xué)標(biāo)本。

標(biāo)本處理:取20 mL BALF，2 000 r/min離心10 min，去上清，用20～25mL蒸餾水重懸沉淀，再次以2 000 r/min離心10 min，去上清，取沉淀制作乙醇固定玻片并行Papanicolaou染色，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。固定支氣管活檢或手術(shù)標(biāo)本，并用蘇木精-曙紅染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。由該院資深病理學(xué)家閱片并出具診斷報(bào)告。

1．3 BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測(cè)

1．3．1 DNA 提取和處理 取 10 mL BALF，以10 000 r/min離心5 min，取沉淀用于 DNA提取。使用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，提取后的DNA直接進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，具體步驟參見ZYMO RESEARCH生物公司EZ DNA Methylation-DirectTM試劑盒說明書［16］。

1．3．2 甲基化的PCR檢測(cè) 甲基化人SHOX2和RASSF1A基因檢測(cè)試劑盒、引物和探針均由上海透景生命科技股份有限公司提供。PCR反應(yīng)液包含3 μL擴(kuò)增引物，1．5 μL標(biāo)記探針，4．8μL 2×Taq緩沖液(包括 dNTP和 Taq聚合酶)和 10．7μL ddH2O;質(zhì)控品為測(cè)序確認(rèn)的SHOX2和RASSFlA甲基化陽性DNA;陰性對(duì)照為純化水。向PCR反應(yīng)管中每孔加入上述混勻的PCR反應(yīng)液20μL，再加入樣本DNA 5μL，預(yù)留兩管加入質(zhì)控品、陰性對(duì)照各5μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s，60℃退火30 s(共5個(gè)循環(huán));95℃變性15 s，57℃退火30 s(共40個(gè)循環(huán))。在最后循環(huán)階段60℃時(shí)收集FAM、VIC及CY5的信號(hào)。

1．3．3 甲基化的Sanger測(cè)序法檢測(cè) 使用Primer Premier 5．0設(shè)計(jì)引物，SHOX2正向引物序列:5’-GGTGTTGTGTCGTATAGGGAGT-3’，反向引物序列:5’-TCCGCCTCCTACCTTCTAAC-3’;RASSF1A 正向引物序列:5’-GAGGGAAGGAAGGGTAAGG-3’，反向引物序列:5’-GAGGGAAGGAAGGGTAAGG-3’。PCR 反應(yīng)體系:共40μL，包含5μL cDNA，10μmol/L正、反向引物各0．8 μL，20 μL 2×Taq緩沖液(包括dNTP和Taq聚合酶)和13．4μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s(共45個(gè)循環(huán))，58℃退火35 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸8 min。產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1．4 隨訪 對(duì)病理學(xué)診斷陰性而SHOX2、RASSF1A基因甲基化PCR法檢測(cè)陽性的28例患者進(jìn)行門診或電話隨訪，隨訪時(shí)間為6個(gè)月，終點(diǎn)事件為疾病惡化。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22．0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)PCR和Sanger測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較肺癌組和肺部良性疾病組BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化陽性率的差異，應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)單一指標(biāo)和多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的價(jià)值，并計(jì)算AUC及95%CI;檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 PCR和Sanger測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果的一致性分析 見表1。結(jié)果顯示，兩種方法在檢測(cè)SHOX2和RASSF1A基因甲基化上有較好的一致性，Kappa=0．978，95%CI=0．954 ～1．000。

表1 PCR和Sanger測(cè)序法一致性比較

2．2 肺癌組、良性疾病組 BALF中 SHOX2和RASSF1A基因甲基化PCR檢測(cè)結(jié)果 見表2。按病理類型分層，SHOX2、RASSF1A兩基因甲基化PCR檢測(cè)同時(shí)陽性者在小細(xì)胞肺癌患者中最高，為93．5%，而肺腺癌和肺鱗癌較低，僅為 40．4%和36．4%;但兩基因甲基化PCR聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，任一陽性者肺腺癌、鱗癌檢出率分別達(dá)到66．0%和90．9%(表3)。不同TNM分期肺癌患者BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)陽性率均高于單一指標(biāo)檢測(cè)陽性率;晚期肺癌患者BALF中基因甲基化的陽性率最高，為89．3%(表3)。

表2 肺癌組、良性疾病組BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化PCR檢測(cè)結(jié)果 例(%)

表3 不同病理類型及疾病分期肺癌患者BALF中基因甲基化PCR檢測(cè)結(jié)果 例(%)

2．3 BALF細(xì)胞學(xué)聯(lián)合基因甲基化PCR檢測(cè)的價(jià)值比較 見表4。

表4 單一指標(biāo)與多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果

2．4 良性疾病組中SHOX2和RASSF1A基因甲基化陽性患者的隨訪研究 在145例肺良性疾病患者中，有28例SHOX2和(或)RASSF1A基因甲基化檢測(cè)陽性，臨床診斷為肺炎、支氣管擴(kuò)張、呼吸道淀粉樣變、肺結(jié)核、結(jié)節(jié)病等。對(duì)上述28例患者進(jìn)行隨訪研究，6個(gè)月隨訪期間有2例病情惡化，后經(jīng)病理確診為肺癌。

3 討論

DNA甲基化已廣泛用于癌癥的輔助診斷，尤其適合微創(chuàng)獲取標(biāo)本(如BALF、胸腔積液等)的檢測(cè)［17-18］。多項(xiàng)研究［9，13，19］顯示，SHOX2 和 RASSF1A基因異常甲基化對(duì)肺癌具有診斷價(jià)值，可作為肺癌的生物標(biāo)志物。本研究中作者使用PCR和Sanger測(cè)序法對(duì)276名疑似肺癌患者BALF標(biāo)本中SHOX2和RASSF1A基因甲基化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性良好，說明PCR法在DNA甲基化分析中是可靠的，而且檢測(cè)成本更低，對(duì)樣本DNA含量的要求低于Sanger測(cè)序法，這些優(yōu)勢(shì)是其廣泛推廣應(yīng)用的前提。本研究中，SHOX2和RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺癌的診斷靈敏度為 0．840，特異度為 0．807，表明 SHOX2 和RASSF1A甲基化聯(lián)合檢測(cè)具有區(qū)分惡性和良性肺部疾病的診斷效能。

目前，病理學(xué)仍然是肺癌診斷金標(biāo)準(zhǔn);但臨床中受病灶組織異質(zhì)性、病灶部位等因素影響，病理學(xué)檢查有時(shí)呈現(xiàn)陰性結(jié)果，導(dǎo)致診斷困難，因此迫切需要多種檢測(cè)方法相結(jié)合以提高肺癌的診斷率。Darwiche等［20］使用組織學(xué)與SHOX2基因甲基化測(cè)定相結(jié)合對(duì)肺癌淋巴結(jié)樣本進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到99%的檢測(cè)靈敏度和99%的特異性。在本研究中，肺癌組BALF細(xì)胞學(xué)診斷靈敏度僅為0．435;與單一指標(biāo)檢測(cè)相比，當(dāng)SHOX2、RASSF1A兩指標(biāo)聯(lián)合或者基因甲基化與細(xì)胞學(xué)兩兩聯(lián)合時(shí)，診斷靈敏度顯著升高。當(dāng)SHOX2、RASSF1A基因甲基化和細(xì)胞學(xué)三指標(biāo)聯(lián)合使用時(shí)進(jìn)一步將診斷靈敏度提高至0．931，這表明BALF中SHOX2和RASSF1A甲基化檢測(cè)可以作為肺癌細(xì)胞學(xué)診斷的有效補(bǔ)充工具。

有研究［10］顯示，SHOX2、RASSF1A 基因甲基化陽性檢出率與肺癌病理類型之間存在相關(guān)性。本研究中，SHOX2、RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)陽性率在小細(xì)胞肺癌和肺鱗癌中分別是100%和90．9%，肺腺癌組最低(大細(xì)胞肺癌例數(shù)過少，僅5例，其陽性檢測(cè)率不能提供可靠信息)，表明SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測(cè)對(duì)小細(xì)胞肺癌和肺鱗癌的敏感性高于肺腺癌，這與以前的研究結(jié)論相似［12，15］;分析原因可能與小細(xì)胞肺癌和肺鱗癌中存在高水平SHOX2基因甲基化有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，SHOX2、RASSF1A基因甲基化水平與肺癌病情分期之間亦有相關(guān)性，晚期肺癌患者SHOX2、RASSF1A基因甲基化水平高于早期肺癌(89．3%vs 72．2%);這與晚期肺癌更具侵襲性、腫瘤生長更快、腫瘤性壞死更多，進(jìn)而導(dǎo)致DNA釋放增多，更容易檢測(cè)到甲基化等因素有關(guān)［14］。

本研究中，肺良性疾病組有28例患者BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測(cè)陽性，在隨訪過程中2例隨后被確診為肺癌;提示對(duì)可疑患者進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)是必要的，尤其對(duì)病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果陰性而甲基化分析陽性患者，至少可以提前預(yù)警，密切隨訪，必要時(shí)可多次穿刺活檢以免漏、誤診。

總之，BALF中 SHOX2、RASSF1A基因甲基化分析具有區(qū)分惡性和良性肺部疾病的診斷效能;SHOX2、RASSF1A基因甲基化分析與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合使用可顯著提高肺癌診斷靈敏度，是肺癌病理學(xué)診斷的有效補(bǔ)充工具。