p38MAPK抑制劑聯(lián)合輔酶Q10對(duì)氧化應(yīng)激條件下大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

張思潔，吳亞瓊，李星濤

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院心內(nèi)科石家莊050000

心血管系統(tǒng)疾病是一種嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的常見疾病，心肌梗死、心力衰竭等常伴隨心肌組織氧化損傷，而氧化應(yīng)激是目前為止人們發(fā)現(xiàn)的心肌損傷發(fā)生的起始因素［1］。輔酶Q10常用于治療高血壓、心力衰竭、心絞痛等心血管系統(tǒng)疾病，具有清除自由基、維持細(xì)胞穩(wěn)定、抑制心肌細(xì)胞凋亡等作用［2-3］。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)是 MAPK信號(hào)通路中最為重要的分支之一，其對(duì)于細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等均具有重要的調(diào)控作用［4］。很多研究［5-8］表明，p38MAPK在糖尿病心肌病、心肌缺血再灌注、藥物誘導(dǎo)的心肌毒性、心力衰竭等多種心肌損傷中過度激活，并且參與心肌細(xì)胞氧化損傷過程。本研究觀察了輔酶Q10和p38MAPK抑制劑單用以及二者聯(lián)用對(duì)大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料 大鼠H9c2心肌細(xì)胞購自百恩維生物科技有限公司，p38MAPK抑制劑SB203580購自美國ApexBio科技公司，輔酶Q10購自西南藥業(yè)股份有限公司，丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒購自上海篤瑪生物科技有限公司，p38MAPK抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，磷酸化 p38MAPK(pp38MAPK)抗體購自美國CST公司，C-caspase-3抗體購自美國CST公司，超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)含量檢測試劑盒購自美國Abnova公司，過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒購自美國Cell Biolabs公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)分組 H9c2細(xì)胞分為5組，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，模型組給予100μmol/L過氧化氫處理以建立氧化應(yīng)激模型，輔酶Q10組給予100μmol/L過氧化氫、0．3 g/L輔酶 Q10處理，SB203580組給予100 μmol/L過氧化氫、10μmol/L SB203580處理，輔酶Q10+SB203580組給予100μmol/L過氧化氫、0．3 g/L輔酶Q10、10μmol/L SB203580處理。培養(yǎng)條件:體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃，體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1．3 各組細(xì)胞p38MAPK磷酸化水平檢測 采用Western blot法。H9c2細(xì)胞按1．2分組處理24 h后，提取蛋白并用BCA法定量，之后電泳、轉(zhuǎn)膜，加入50 g/L牛血清白蛋白溶液，室溫封閉2 h，再將膜放在抗體反應(yīng)液中孵育結(jié)合，p38MAPK、p-p38MAPK一抗按1∶800稀釋，二抗按1∶4 000稀釋。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒發(fā)光以后，室溫孵育5 min。掃描圖像，以目的條帶和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．4 各組細(xì)胞LDH漏出率檢測 H9c2細(xì)胞按1．2分組處理24 h后，分別收集培養(yǎng)液上清及細(xì)胞，采用二硝基苯肼顯色法，按照LDH含量檢測試劑盒步驟測定LDH含量?？侺DH含量=上清中LDH含量+細(xì)胞中LDH含量，LDH漏出率=(上清中LDH含量/總LDH含量)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．5 各組細(xì)胞存活率檢測 H9c2細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為1×104個(gè)/孔，分別按1．2分組處理24 h后，每孔添加5 g/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4 h后，添加二甲基亞砜，待結(jié)晶溶解以后，以酶標(biāo)儀測定560 nm波長處的吸光度(A)值，用不含細(xì)胞的孔調(diào)零。存活率=(處理組A值/對(duì)照組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．6 各組細(xì)胞凋亡檢測 H9c2細(xì)胞按1．2分組處理24 h后，添加2．5 g/L胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，與300μL緩沖液混合，添加Annexin V-FITC和PI工作液各5μL，用流式細(xì)胞儀檢測前再添加200μL結(jié)合緩沖液。計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．7 各組細(xì)胞中C-caspase-3蛋白表達(dá)水平檢測H9c2細(xì)胞按1．2分組處理24 h后，以Western blot法檢測細(xì)胞中C-caspase-3蛋白表達(dá)，C-caspase-3抗體按1∶600稀釋，余步驟同1．3。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．8 各組細(xì)胞中SOD、CAT活性及MDA含量檢測 H9c2細(xì)胞按1．2分組處理24 h后，收集細(xì)胞，采用硫代巴比妥酸法檢測細(xì)胞中MDA含量，用黃嘌呤氧化法檢測細(xì)胞中SOD活性，用鉬酸銨法檢測細(xì)胞中CAT活性，均按試劑盒說明操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21．0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用單因素方差分析比較各組細(xì)胞上述指標(biāo)的差異，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 各組細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平檢測結(jié)果結(jié)果見圖1、表1。由圖1、表1可知，過氧化氫能夠提高心肌細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平，而輔酶Q10和SB203580均能降低過氧化氫誘導(dǎo)的p38MAPK磷酸化水平升高，二者聯(lián)用，p38MAPK磷酸化水平進(jìn)一步降低。

圖1 各組細(xì)胞中p-p38M APK和p38M APK的表達(dá)

表1 各組細(xì)胞中p-p38MAPK和p38MAPK水平比較(n=3)

2．2 各組細(xì)胞LDH漏出率和存活率檢測結(jié)果結(jié)果見表2。由表2可知，過氧化氫能夠提高心肌細(xì)胞LDH漏出率，降低心肌細(xì)胞存活率;輔酶Q10和SB203580能夠抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞LDH漏出率升高和細(xì)胞存活率降低，二者聯(lián)用作用更強(qiáng)。

表2 各組細(xì)胞LDH漏出率和存活率比較(n=3) %

2．3 各組細(xì)胞凋亡率和C-caspase-3蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果 結(jié)果見圖2和表3。由圖2、表3可知，過氧化氫能夠提高心肌細(xì)胞凋亡率和C-caspase-3蛋白水平;輔酶Q10和SB203580能夠抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和C-caspase-3蛋白表達(dá)，二者聯(lián)用作用更強(qiáng)。

圖2 各組細(xì)胞C-caspase-3蛋白的表達(dá)

表3 各組細(xì)胞凋亡率和C-caspase-3蛋白表達(dá)水平比較(n=3)

2．4 各組細(xì)胞中SOD、CAT活性及MDA含量檢測結(jié)果 結(jié)果見表4。由表4可知，過氧化氫能夠提高心肌細(xì)胞中MDA水平，降低細(xì)胞中SOD、CAT活性;輔酶Q10和SB203580能夠抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞SOD、CAT活性降低和MDA含量升高，并且二者聯(lián)用作用更強(qiáng)。

表4 各組細(xì)胞中SOD、CAT活性及MDA含量比較(n=3)

3 討論

輔酶Q又名泛醌，是一種存在于細(xì)胞膜中的化合物，不同來源的輔酶Q的側(cè)鏈上異戊烯單位數(shù)量不同，人類輔酶Q異戊烯單位數(shù)量為10，因此又稱為輔酶Q10［9］。輔酶Q10具有抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化、增強(qiáng)免疫、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等多種作用，目前發(fā)現(xiàn)輔酶Q10對(duì)于帕金森綜合征、糖尿病、心肌病、腫瘤等具有治療作用［10-13］。有關(guān)心肌缺血再灌注損傷的研究［14］顯示，輔酶Q10能夠抑制心肌細(xì)胞中氧自由基的產(chǎn)生并促進(jìn)其降解，在心室功能和結(jié)構(gòu)維持中具有保護(hù)作用。針對(duì)體外缺氧復(fù)氧致心肌細(xì)胞損傷的研究［15］表明，輔酶Q10能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡，提高心肌細(xì)胞活性。本研究結(jié)果顯示，輔酶Q10可以提高氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞的活性，并減少細(xì)胞LDH漏出率，提示輔酶Q10對(duì)于過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

p38MAPK作為一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在人體組織中廣泛表達(dá)，參與腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)損傷等的發(fā)生［16-18］。近年來的研究［5-8］表明，心肌缺血再灌注損傷、糖尿病心肌病、藥物誘導(dǎo)的心肌病等的發(fā)生均與p38MAPK活化有關(guān)，p38MAPK信號(hào)在受到外界因素刺激以后能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌細(xì)胞活性，造成心肌細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，p38MAPK抑制劑可以提高氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞活性，減少細(xì)胞凋亡，具有抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。另外，過氧化氫處理后的心肌細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路被激活，而輔酶Q10能夠降低p38MAPK蛋白的磷酸化水平，提示輔酶Q10減輕過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制可能與p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

細(xì)胞中過量的氧自由基可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)氧自由基的積累與細(xì)胞中抗氧化酶活性降低有關(guān)，SOD、CAT是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性降低可以直接導(dǎo)致細(xì)胞中氧自由基清除受阻;細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基可以誘導(dǎo)細(xì)胞中正常的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，生成大量的MDA［19］。另外，氧自由基可以誘導(dǎo)細(xì)胞中 Caspase活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，其活化水平升高是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志［20］。本研究顯示，p38MAPK抑制劑和輔酶Q10單獨(dú)使用均可以提高心肌細(xì)胞中SOD、CAT活性，減少M(fèi)DA產(chǎn)生，減少細(xì)胞中活化的Caspase-3蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率，并且p38MAPK抑制劑和輔酶Q10聯(lián)合使用效果更優(yōu)。

總之，p38MAPK抑制劑聯(lián)合輔酶Q10可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，p38MAPK抑制劑可能是提高輔酶Q10治療心肌損傷的潛在途徑。