氮濃度、溫度和照度對(duì)波吉卵囊藻繁殖模式的影響

楊敏志，李長(zhǎng)玲，黃翔鵠，王清珍，陳愛(ài)珊

氮濃度、溫度和照度對(duì)波吉卵囊藻繁殖模式的影響

楊敏志1,2,3，李長(zhǎng)玲1,2,3，黃翔鵠1,2,3，王清珍2,3，陳愛(ài)珊2,3

（1. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518000；2. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；3. 廣東省藻類養(yǎng)殖及應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524025）

【】探索波吉卵囊藻（）的繁殖模式，調(diào)控其生殖過(guò)程以實(shí)現(xiàn)藻生物質(zhì)穩(wěn)定增長(zhǎng)。在熒光顯微鏡下觀察波吉卵囊藻似親孢子形成過(guò)程，探究溫度、照度、氮濃度對(duì)其繁殖模式的影響。波吉卵囊藻以2、4和8似親孢子型模式繁殖，在藻細(xì)胞第二輪分裂過(guò)程中因分裂不同步，有時(shí)也形成3個(gè)似親孢子。氮限制和弱光顯著影響波吉卵囊藻繁殖模式（< 0.05）。通常情況下，波吉卵囊藻以4似親孢子型繁殖模式繁殖，但在缺氮和弱光下2和3似親孢子型模式的頻率上升。在15 ~ 35 ℃溫度范圍內(nèi)，波吉卵囊藻繁殖模式變化不大。波吉卵囊藻有4種繁殖模式。在不良環(huán)境中，2和3似親孢子型模式頻率上升。

波吉卵囊藻；似親孢子；繁殖模式

藻類繁殖規(guī)律是藻類學(xué)研究的重要內(nèi)容，也是藻類培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。約在60 a前，Tamiya等首次實(shí)現(xiàn)小球藻（sp.）的同步化培養(yǎng)[1]，并用于細(xì)胞周期的生化和生理分析。同時(shí)，Howard和Pelc第一次將細(xì)胞周期劃分為G1、S、G2和M四個(gè)階段[2]。此后，相繼建立了柵藻（sp.）和衣藻（sp.）等綠藻的典型細(xì)胞周期模型[3-6]。與多數(shù)其他真核生物不同，綠藻通常在一個(gè)細(xì)胞周期中進(jìn)行多輪細(xì)胞物質(zhì)復(fù)制，多重分裂后，母細(xì)胞通常形成2個(gè)子細(xì)胞（是從1到10的整數(shù)），子細(xì)胞數(shù)量受環(huán)境條件影響[7,8]。波吉卵囊藻（）是一種綠藻，無(wú)性生殖，通常由2、4和8個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞群，群體外有一層明顯膠質(zhì)包被[9]，因而種群穩(wěn)定、適應(yīng)能力強(qiáng)。定向培育可輔助波吉卵囊藻搶占養(yǎng)殖水體生態(tài)位，有效降低水體氨氮、亞硝態(tài)氮等有害物質(zhì)濃度，廣泛用于養(yǎng)殖水域生態(tài)調(diào)控[10-12]。但在波吉卵囊藻生物學(xué)研究方面進(jìn)展緩慢，Snow[13]發(fā)現(xiàn)，波吉卵囊藻細(xì)胞通過(guò)二分裂和多重分裂形成2、4或8個(gè)似親孢子，子代細(xì)胞包裹在母細(xì)胞殘留的細(xì)胞壁中。本研究利用波吉卵囊藻這一特性，以群體中細(xì)胞數(shù)量代表細(xì)胞繁殖模式，探究氮濃度、溫度、光照對(duì)其細(xì)胞繁殖模式的影響，描述其繁殖規(guī)律，并補(bǔ)充波吉卵囊藻孢子形成過(guò)程，為波吉卵囊藻的池塘定向培育提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 藻種

實(shí)驗(yàn)用波吉卵囊藻由廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院藻類資源開(kāi)發(fā)與養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)修復(fù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)條件

波吉卵囊藻接種于無(wú)菌改良培養(yǎng)基[14,15]。波吉卵囊藻置于恒溫光照培養(yǎng)箱中以設(shè)定基本培養(yǎng)條件培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25 ± 1）℃，光暗比12D∶12L，照度2 500 lx，pH值7.9 ~ 8.0，為確保海水中不含任何營(yíng)養(yǎng)鹽，實(shí)驗(yàn)用海水均為基于 Harrison經(jīng)典配方配制的人工海水，鹽度控制在28 ± 1。

1.3 波吉卵囊藻的細(xì)胞繁殖模式

在波吉卵囊藻培養(yǎng)至暗周期后，定時(shí)取1 mL藻液，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛處理4 h，離心收集藻細(xì)胞，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，用終質(zhì)量濃度20 μg/mL的SYBR Green I（497 nm，520 nm）或DAPI（340 nm，488 nm）避光染色20 min，裝片，于Nikon倒置熒光顯微鏡Ti-E上觀察波吉卵囊藻藻體形態(tài)和細(xì)胞分裂時(shí)葉綠體（440 nm，680 nm）、細(xì)胞核變化，并拍照。

1.4 不同培養(yǎng)條件下各細(xì)胞繁殖模式的頻率分布

基于基礎(chǔ)培養(yǎng)條件進(jìn)行不同條件對(duì)細(xì)胞繁殖模式影響的單因素實(shí)驗(yàn)。氮濃度梯度設(shè)計(jì)為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L；照度梯度設(shè)計(jì)為0、1 000、2 000、3 000、4 000 lx；溫度梯度設(shè)計(jì)為15、20、25、30、35 ℃。初始接種濃度為每毫升5 × 104個(gè)藻細(xì)胞，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)期間每天定時(shí)搖瓶3 ~ 4次。波吉卵囊藻培養(yǎng)至光周期6 h后細(xì)胞分裂基本完成，子細(xì)胞包裹在母細(xì)胞膠化膨大的細(xì)胞壁中，形成孢子囊狀結(jié)構(gòu)。每24 h采集5 mL藻懸液，持續(xù)168 h。采集的樣本制片后，于顯微鏡下計(jì)數(shù)，以孢子囊中細(xì)胞數(shù)目作為判斷細(xì)胞繁殖模式的依據(jù)。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)100個(gè)孢子囊，最后取3個(gè)重復(fù)的平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel統(tǒng)計(jì)、作圖，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0分析各模式的頻率與環(huán)境因子的相關(guān)性，利用Adobe illustrator CC 2018繪制細(xì)胞繁殖模式示意圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 波吉卵囊藻的細(xì)胞繁殖模式

一般情況下，波吉卵囊藻多以二分裂的方式繁殖，通常是同步且連續(xù)的兩輪分裂，形成4個(gè)似親孢子（圖1，圖2：c1-c3）；少數(shù)只分裂1次，形成2個(gè)似親孢子（圖1，圖2：a1-a3）；或在第2輪分裂過(guò)程中，部分原生質(zhì)團(tuán)脫離分裂進(jìn)程，最終形成3個(gè)似親孢子（圖1，圖2：b1-b3）。極少數(shù)的波吉卵囊藻在分裂前期先經(jīng)過(guò)多輪的細(xì)胞核分裂后形成多核巨細(xì)胞，近球形，體積遠(yuǎn)大于其他細(xì)胞繁殖模式下的母細(xì)胞，隨后原生質(zhì)分裂，在細(xì)胞核周圍產(chǎn)生分裂溝（cleavage furrow），細(xì)胞分裂結(jié)束后形成8個(gè)似親孢子（圖1，圖2：d1-d3）。

圖1 波吉卵囊藻細(xì)胞繁殖模式

Fig. 1 Diagrammatic representation of different types of reproduction patterns found in O. borgei

a-d: 波吉卵囊藻的4種細(xì)胞繁殖模式； a1-a3: 2似親孢子型；b1-b3: 3似親孢子型； c1-c3: 4似親孢子型；d1-d3: 8似親孢子型；a2-d2: 與a1-d1對(duì)應(yīng)的熒光圖片，黃綠色為 SYBR Green I，藍(lán)色為DAPI，紅色為葉綠素自發(fā)熒光。 a-d: four types of reproduction pattern found in O. borgei; a1-a3: two-autospore type; b1-b3: three-autospore type; c1-c3: four autospore type; d1-d3: eight-autospore type; a2-d2, the fluorescence images corresponding to a1-d1, SYBR Green I in yellow-green, DAPI in blue and chlorophyll spontaneous fluorescence in red 圖2 波吉卵囊藻的細(xì)胞繁殖模式觀察 Fig. 2 The types of the reproduction pattern found in O. borgei

2.2 氮濃度對(duì)波吉卵囊藻細(xì)胞繁殖模式的影響

不同氮濃度條件下，波吉卵囊藻細(xì)胞繁殖模式的頻率分布如圖3所示。在不同氮濃度下波吉卵囊藻均以4似親孢子型的細(xì)胞繁殖模式為主，占40 %以上。在氮素消耗殆盡后，波吉卵囊藻無(wú)法維持4似親孢子型的繁殖模式，2和3似親孢子型的頻率上升，4似親孢子型頻率下降。1 mmol/L和2 mmol/L組出現(xiàn)極少數(shù)8似親孢子型，頻率在1% ~ 2%之間。

圖3 不同氮濃度條件下各細(xì)胞繁殖模式所占比例隨培養(yǎng)時(shí)間的變化 Fig. 3 Frequency of cell reproductive patterns under different nitrogen concentration culture conditions changed with culture time

2.3 照度對(duì)波吉卵囊藻細(xì)胞繁殖模式的影響

圖4表明，波吉卵囊藻的細(xì)胞繁殖模式以4似親孢子型為主。在黑暗環(huán)境下，4似親孢子型的頻率隨時(shí)間增加而下降，2似親孢子的頻率隨時(shí)間增加而上升，在1 000 ~ 4 000 lx的照度下，4似親孢子型的頻率隨強(qiáng)度增加而升高。

圖4 不同照度條件下細(xì)胞繁殖模式所占比例隨培養(yǎng)時(shí)間的變化 Fig. 4 Frequency of cell reproductive patterns under different light intensity culture conditions changed with the culture time

2.4 溫度對(duì)波吉卵囊藻細(xì)胞繁殖模式的影響

溫度對(duì)波吉卵囊藻繁殖模式的影響如圖5所示，5個(gè)溫度處理下，波吉卵囊藻均以4似親孢子型的繁殖模式為主，且頻率隨時(shí)間的增加而增加，但在15 ℃時(shí)，4似親孢子型的頻率增長(zhǎng)速率顯著低于其他組（P < 0.05）。

圖5 不同溫度條件下各細(xì)胞繁殖模式所占比例隨培養(yǎng)時(shí)間的變化 Fig. 5 Frequency of cell reproductive patterns under different temperature culture conditions changed with the culture time

3 討論

3.1 波吉卵囊藻的細(xì)胞繁殖模式

綠球藻目藻類的主要繁殖方式是孢子繁殖，即通過(guò)產(chǎn)生似親孢子的方式進(jìn)行無(wú)性生殖，親代細(xì)胞在二分裂或多重分裂后，產(chǎn)生2n（n為整數(shù)）個(gè)子細(xì)胞。Borowitzka等[16]根據(jù)二分裂和多重分裂將微藻劃分為兩種周期類型，又以細(xì)胞核分裂發(fā)生的順序，分為連續(xù)型（consecutive pattern）和聚合型（clustered pattern）（以柵藻和衣藻為代表）。波吉卵囊藻在2似親孢子型和4似親孢子型的形成過(guò)程中，細(xì)胞核分裂發(fā)生在細(xì)胞分裂后期，屬于聚合型的細(xì)胞周期，與衣藻類似。而8似親孢子型則先通過(guò)細(xì)胞核連續(xù)3輪分裂后，形成多核母細(xì)胞，隨后在細(xì)胞核附近產(chǎn)生分裂溝，形成8個(gè)子細(xì)胞，這與柵藻相似，屬于連續(xù)型的細(xì)胞周期。除2、4和8似親孢子型的繁殖模式外，波吉卵囊藻的3似親孢子型繁殖模式是第1次被描述，這一現(xiàn)象普通小球藻(Chlorella vugaris)[17,18]同樣存在，可能是由于母細(xì)胞在第2輪分裂形成4似親孢子的過(guò)程中，其中一個(gè)原生質(zhì)團(tuán)脫離了分裂進(jìn)程，最終形成3個(gè)似親孢子。

選取本院收治的患者88例作為研究對(duì)象，將其分為兩組，各44例。其中，護(hù)理組男20例、女24例，年齡26～90歲，平均（52.28±4.19）歲，疾病類型：顱腦外傷16例、腦積水10例、腦膿腫14例、其他4例；對(duì)照組男21例、女23例，年齡21～88歲，平均（52.40±3.97）歲，疾病類型：顱腦外傷15例、腦積水11例、腦膿腫13例、其他5例。兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 氮濃度對(duì)波吉卵囊藻細(xì)胞繁殖模式的影響

氮是限制微藻細(xì)胞生長(zhǎng)最重要的營(yíng)養(yǎng)因子，是影響細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的重要因素。Olson等[19]研究表明，在缺氮條件下，卡特前溝藻（Amphidinium carteri）的細(xì)胞周期滯留在G1期。Vaulot[20]在研究威氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogi）和卡氏膜球藻（Hymenomonas carterae）時(shí)也得出相同結(jié)論。波吉卵囊藻在缺氮環(huán)境中，4似親孢子型的頻率下降，2似親孢子型和3似親孢子型的頻率上升，可能是由于氮供給不足，導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)合成量不足，細(xì)胞無(wú)法達(dá)到獲得更多的承諾點(diǎn)(commitment point)，一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)只完成一次二分裂，或者“不完全”的多重分裂，繁殖模式與卡特前溝藻等真核藻類的氮限制響應(yīng)是一致的。

3.3 照度對(duì)波吉卵囊藻細(xì)胞繁殖模式的影響

綠藻是一類光能自養(yǎng)型生物，光是其重要能量來(lái)源，對(duì)細(xì)胞周期起重要調(diào)節(jié)作用。早在20世紀(jì)60年代，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道照度對(duì)小球藻、鏈帶藻（Desmodesmus sp）、柵藻和衣藻同步化培養(yǎng)的影響[21-26]。如Zachleder[27]在卵配衣藻（Chlamydomonas eugametos）的同步培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，隨著照度的增加，細(xì)胞周期的持續(xù)時(shí)間明顯縮短，細(xì)胞分裂次數(shù)也從2次增加至4次。Vítová[28]也報(bào)道了萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）子細(xì)胞數(shù)量從最低照度的2個(gè)子細(xì)胞增加到最高照度的16個(gè)。波吉卵囊藻在黑暗環(huán)境中4似親孢子型的頻率下降，2似親孢子型的頻率上升，表明波吉卵囊藻在光限制的情況下，細(xì)胞物質(zhì)合成受阻；波吉卵囊藻在1 000 lx的照度下，4似親孢子型的頻率開(kāi)始平緩上升，也表明波吉卵囊藻細(xì)胞物質(zhì)的合成在弱光條件下即可完成。

首先，全面收集區(qū)域概況資料、土壤污染源資料、土壤環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品資料及其對(duì)應(yīng)的圖件資料等，并通過(guò)分析，研究有關(guān)信息劃分區(qū)域內(nèi)的地理單元，為污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)支撐；其次，通過(guò)評(píng)估土壤及農(nóng)產(chǎn)品調(diào)查點(diǎn)位的土壤重金屬污染情況、農(nóng)產(chǎn)品重金屬污染情況，反映該點(diǎn)位土壤和農(nóng)產(chǎn)品重金屬污染狀況，劃分點(diǎn)位土壤重金屬風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，為區(qū)域風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)依據(jù)；最后，通過(guò)評(píng)價(jià)單元內(nèi)土壤重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)、農(nóng)產(chǎn)品重金屬危害風(fēng)險(xiǎn)、重金屬生物可利用性等因素的情況，反映區(qū)域內(nèi)耕地土壤和農(nóng)產(chǎn)品重金屬污染情況，劃分區(qū)域內(nèi)土壤重金屬風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，為重金屬污染耕地分級(jí)管理提供依據(jù)。

3.4 溫度對(duì)波吉卵囊藻細(xì)胞繁殖模式的影響

溫度的變化影響細(xì)胞的整個(gè)新陳代謝。Morimura[29]利用橢球小球藻（Chlorella ellipsoidea）完成了描述溫度影響細(xì)胞周期同步化的第一份報(bào)告。他觀察到兩個(gè)有趣的現(xiàn)象：不同溫度下的生長(zhǎng)速度不同，細(xì)胞分裂持續(xù)的時(shí)間也不同；然而，在所有的溫度條件下，細(xì)胞均分裂成4個(gè)子細(xì)胞。這一現(xiàn)象在其他藻類中得到了反復(fù)驗(yàn)證：溫度影響藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，細(xì)胞周期隨著溫度的升高而縮短[27,30]。波吉卵囊藻在10 ~ 32 ℃均可正常生長(zhǎng)繁殖，最佳的培養(yǎng)溫度在25 ~ 30 ℃[31]。從本研究可見(jiàn)，20 ~ 35 ℃對(duì)波吉卵囊藻細(xì)胞繁殖模式的影響不大，說(shuō)明波吉卵囊藻有很好的溫度適應(yīng)性。15 ℃時(shí)4似親孢子的頻率及上升幅度低于其他組，暗示著15 ℃時(shí)細(xì)胞周期持續(xù)時(shí)間比其他組長(zhǎng)，這與Morimura等[29]的結(jié)果相符。

4 結(jié)論

波吉卵囊藻存在2似親孢子型、3似親孢子型、4似親孢子型和8似親孢子型4種細(xì)胞繁殖模式。在氮限制和缺乏光照時(shí)，主要以產(chǎn)生2或3個(gè)似親孢子的方式擴(kuò)大種群。

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Influences of Nitrogen Concentration, Light Intensity and Temperature on the Cell Reproductive Pattern of Oocystis borgei

YANG Min-zhi1,2,3, LI Chang-ling1,2,3, HUANG xiang-hu1,2,3, WANG Qing-zhen2,3, CHEN Ai-shan2,3

（1. Shenzhen Research Institute, Guangdong Ocean University, Shenzhen 518000, China; 2. College of Fisheries, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 3. Guangdong Research Center for Algae Culture and Applied Engineering, Zhanjiang 524025, China）

Abstract:【Objective】To explore the cell reproductive pattern of Oocystis borgei, regulate its reproductive process, and realize a stable growth of O. borgei. 【Method】Under the fluorescence microscope, the reproductive process of O. borgei was observed, and the effects of temperature, light intensity and nitrogen concentration on its reproductive pattern were investigated. 【Results】Four types of reproductive pattern were found in O. borgei, namely the two, four, eight autospore types and three sporozoites. Three autospore types occasionally formed through asynchronous splitting in the second round of cell division. Nitrogen limitation and weak light significantly affectedthe cells reproductive pattern of O. borgei (P < 0.05). In general, O. borgei proliferates through popularity, forming four daughter cells with the frequencies of two and three autospore types that increased under conditions of nitrogen deficiency and at low light intensity. Temperature affected the reproductive pattern of O. borgei insignificantly.【Conclusion】There were 4 types of reproductive pattern in O. borgei, and the frequencies of two and three autospore types increased in the environment different from the favorite. The type frequencies of the cell reproductive pattern of O. borgei may aid in estimating its growth performance.

Key words：Oocystis borgei; autospore; reproduction pattern

中圖分類號(hào)：S968.41+9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-9159（2019）05-0044-06

doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.007

收稿日期：2019-02-25

基金項(xiàng)目：活性微藻制品產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)的研究與示范（KY20180112）；廣東海洋大學(xué)博士啟動(dòng)項(xiàng)目

第一作者：楊敏志（1992―），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail: 2693140787@ qq.com

通信作者：李長(zhǎng)玲, 女, 教授, 研究方向?yàn)樗蛏鷳B(tài)學(xué)。E-mail:ybc1901@126.com

楊敏志，李長(zhǎng)玲，黃翔鵠，等. 氮濃度、溫度和照度對(duì)波吉卵囊藻繁殖模式的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（5）：44-49.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）