耐甲氧西林金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素基因檢測

賴奮強(qiáng)，郭慶昕，楊 濱，鄭韻芳

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)是全世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題，在美國每年因MRSA感染所致的死亡人數(shù)高于艾滋病[1]。這是由于社區(qū)獲得性MRSA(Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus，CA-MRSA)的發(fā)展所致，也是急診科中皮膚和軟組織感染的主要原因[2]。然而，分子特征決定CA-MRSA菌株在醫(yī)院外傳播和感染健康人群的能力仍然很差[3]。細(xì)胞溶解肽，α-型苯酚可溶蛋白(Phenol-soluble modulinsα，PSMα)和α-毒素(α-toxin，hla)對CA-MRSA疾病的進(jìn)展起決定性作用[4-5]，這兩種毒力因子并非專門出現(xiàn)在CA-MRSA中，基因表達(dá)的差異可部分解釋CA-MRSA菌株增強(qiáng)毒力的原因[4]。值得注意的是許多CA-MRSA菌株攜帶有編碼殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)的lukSF-PVL基因，而其他菌株中l(wèi)ukSF-PVL較少[3]，因此，PVL已被認(rèn)為是導(dǎo)致CA-MRSA毒力增加的主要因素之一[6]。

1 材料與方法

1.1菌株來源 83株分離菌來自于某綜合三甲醫(yī)院臨床各科室送檢的痰、血液、傷口分泌物、耳道分泌物、尿液、膿液、無菌體液等標(biāo)本，經(jīng)臨床微生物室分離鑒定的非重復(fù)MRSA菌株；按美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)的CA-MRSA 定義為：患者在門診或入院48 h之內(nèi)分離到MRSA菌株；1年內(nèi)無住院或與醫(yī)療機(jī)構(gòu)接觸史； 沒有留置各種導(dǎo)管及其他穿透皮膚的醫(yī)用裝置[3]，將臨床分離的MRSA菌株分成醫(yī)院獲得性MRSA(HA-MRSA)組與CA-MRSA組。金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株ATCC29213為福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院微生物室保存；SCCmec分型標(biāo)準(zhǔn)菌株為同濟(jì)大學(xué)附屬上海肺科醫(yī)院余方友教授饋贈(zèng)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1主要儀器 Vitek-2全自動(dòng)細(xì)菌檢測系統(tǒng)購于法國生物梅里埃有限公司，恒溫培養(yǎng)箱購于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，PCR儀購于Eppendorf有限公司，電泳儀購于北京六一儀器廠，凝膠成像儀購于上海山富科學(xué)儀器有限公司，臺(tái)式高速離心機(jī)購于北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

1.2.2主要試劑 血瓊脂平板、革蘭陽性菌鑒定卡GP、革蘭陽性菌藥敏卡GP67均購于法國生物梅里埃有限公司，溶菌酶緩沖液、溶菌酶、細(xì)菌基因組提取試劑盒均購于上海生工生物工程公司，PCR反應(yīng) 10×Buffer、dNTP、6×Loading Buffer、100 bp DNA Ladder Marker、rTaq DNA聚合酶購于大連寶生TaKaRa有限公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成

1.3 研究方法

1.3.1基因組提取 取培養(yǎng)過夜的金黃色葡萄球菌單個(gè)菌落1個(gè)，接種于滅菌腦心浸液肉湯中，36 ℃培養(yǎng)過夜。取 1 mL 過夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，加入 1.5 mL 離心管中，室溫 8 000 r/min 離心 1 min，棄上清，收集菌體，加入 180 μL的溶菌酶溶液重懸菌液，37 ℃水浴 60 min，其余步驟按細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。得到的DNA用50～100 μL TE緩沖液溶解并立即-20 ℃保存。

1.3.2SCCmec分型 擴(kuò)增引物和實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[7]，結(jié)果判讀以Marker為基準(zhǔn)，結(jié)合SCCmec標(biāo)準(zhǔn)菌株在相應(yīng)位置出現(xiàn)熒光條帶為陽性。

1.3.3spa分型 擴(kuò)增引物和實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[8]，將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司單向測序，觀察測序結(jié)果峰圖，確認(rèn)序列的質(zhì)量。spa基因24 bp重復(fù)序列區(qū)域的兩端是相對保守的，其5′端的標(biāo)志序列RCA MCA AAA(與重復(fù)序列的5′端起始相距0 bp),3′端的標(biāo)志序列為TAY ATG TCG T(與重復(fù)序列的3′端末尾相距19 bp或18 bp)。按照上述規(guī)則截取重復(fù)序列區(qū)域，并按照24 bp分割成不同的重復(fù)單元(repeats)，登陸官方網(wǎng)站http://spa.ridom.de/spatypes，查詢各菌株的spa分型。

1.3.4PVL基因檢測 擴(kuò)增引物和實(shí)驗(yàn)方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]，選取部分?jǐn)U增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序確認(rèn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)采用百分比(%)表示，χ2檢驗(yàn)；分類計(jì)數(shù)資料總例數(shù)n≤40或T<1時(shí)，采用Fisher確切概率法(Fisher exact probability test)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1送檢科室分布 83株MRSA中18(21.7%)株來自于耳鼻喉科，16(19.3%)株來自于皮膚科，9(10.8%)株來自于血管外科，6(7.2%)株來自于骨科，5(6.0%)株來自于呼吸內(nèi)科，5(6.0%)株來自于兒科，4(4.8%)株來自于重癥醫(yī)學(xué)科。39株HA-MRSA中5(12.8%)株來自于骨科，4(10.3%)株來自于耳鼻喉科，4(10.3%)株來自于呼吸內(nèi)科，4(10.3%)株來自于重癥醫(yī)學(xué)科；44株CA-MRSA中15(34.1%)株來自于皮膚科，14(31.8%)株來自于耳鼻喉科，6(13.6%)株來自于血管外科，4(9.1%)株來自于兒科，詳見表1。

表1 83株MRSA送檢科室分布
Tab.1 Departments distribution of the 83 MRSA delivered

送檢科室MRSA/%n=83HA-MRSA/%n=39CA-MRSA/%n=44耳鼻喉科18(21.7)4(10.3)14(31.8)皮膚科16(19.3)1(2.6)15(34.1)血管外科9(10.8)3(7.7)6(13.6)骨科6(7.2)5(12.8)1(2.3)呼吸內(nèi)科5(6.0)4(10.3)1(2.3)兒科5(6.0)1(2.6)4(9.1)重癥醫(yī)學(xué)科4(4.8)4(10.3)0(0.0)其他科室20(24.1)17(43.6)3(6.8)

注：其他科室包括肝膽胰外科、神經(jīng)外科各3株，干部病房、神經(jīng)內(nèi)科、胃腸外科、胸外科、眼科各2株，甲狀腺科、康復(fù)科、泌尿科、內(nèi)分泌科各1株。

2.2基因分型結(jié)果 83株MRSA中HA-MRSA39株，CA-MRSA44株；SCCmec分型檢出4個(gè)分型，SCCmecⅠ1株(1.2%)SCCmecⅡ3株(3.6%)SCCmecⅢ54株(65.1%)SCCmecⅣa24株(28.9%)；39株HA-MRSA中SCCmecⅠ1株(2.6%)SCCmecⅡ3株(2.7%)SCCmecⅢ32株(82.1%)SCCmecⅣa2株(5.1%)未知分型1株(2.6%)；44株CA-MRSA中SCCmecⅢ22株(50.0%)SCCmecⅣa22株(50.0%)。spa分型中83株MRSA共檢出15個(gè)型，主要分型為t437共33(39.8%)株，t062共18(21.7%)株,t015共9(10.8%)株；HA-MRSA 的主要spa分型t437為11(28.2%)株，t062為 9(23.1%)株，t015為4(10.3%)株，t030為4(10.3%)株；CA-MRSA 中t437為22(50.0%)株，t062為9(20.5%)株，t015為 5(11.4%)株。

2.3PVL基因檢測結(jié)果 PVL總陽性率24.3%(20/83)，HA-MRSA陽性率10.3%(4/39)，4株P(guān)VL陽性的菌株全部為SCCmecⅢ，CA-MRSA陽性36.4%(16/44)，12株P(guān)VL陽性為SCCmecⅣa，4株P(guān)VL陽性為SCCmecⅢ，在PVL陽性率上HA-MRSA與CA-MRSA比較(圖2)，P=0.006，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。部分菌株P(guān)VL凝膠電泳圖見圖1。

1: 100 bp DNAmarker; 2-4: PVL positive samples; 5-6: PVL negative samples圖1 部分菌株P(guān)VL凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PVL

33株spat437中有18株攜帶PVL基因，陽性率54.5%，50株其他spa分型中僅2株攜帶PVL基因，陽性率4.0%，兩組比較(圖3)P=0.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 HA-MRSA與CA-MRSA PVL攜帶率比較Fig.2 Comparison of PVL between HA-MRSA and CA-MRSA

2.4PVL基因陽性的MRSA特征 9株為CA-MRSA-Ⅳa-t437， 4株為HA-MRSA-Ⅲ-t437，3株為HA-MRSA-Ⅳa-t437， 2株為CA-MRSA-Ⅲ-t437，CA-MRSA-Ⅲ-t015 和CA-MRSA-Ⅲ-t062各 1株；20株P(guān)VL基因陽性的MRSA中10株分離自皮膚軟組織感染病例，6株分離于耳鼻喉科感染病例，3株分離于呼吸道感染病例，1株分離于敗血癥病例，詳見表2。

表2 PVL基因陽性的MRSA特征
Tab.2 Characteristics of PVL gene positive MRSA

科室臨床診斷標(biāo)本類型MRSA類型SCCmec分型spa分型小兒外科頜下腺膿腫膿液CAⅣat437整形外科皮膚慢性潰瘍分泌物HAⅣat437眼科淚囊炎分泌物CAⅣat437耳鼻喉科中耳炎分泌物CAⅣat437血管外科肺栓塞痰HAⅢt437重癥醫(yī)學(xué)科小腦出血痰HAⅢt437耳鼻喉科慢性鼻竇炎分泌物CAⅣat437血管外科左下肢腫脹分泌物HAⅣat437皮膚科蕈樣肉芽腫分泌物HAⅣat437甲狀腺科甲狀腺腫物分泌物HAⅢt437皮膚科多形紅斑分泌物CAⅣat437重癥醫(yī)學(xué)科頭頸外傷痰HAⅢt437兒科敗血癥血液CAⅣat437耳鼻喉科外耳炎分泌物CAⅣat437小兒外科乳腺膿腫膿液CAⅢt437神經(jīng)外科神經(jīng)纖維瘤分泌物CAⅣat437耳鼻喉科外耳炎分泌物CAⅢt437耳鼻喉科化膿性中耳炎分泌物CAⅣat437皮膚科特應(yīng)性皮炎分泌物CAⅢt015小兒外科頸部膿腫膿液CAⅢt062

圖3 spat437與其他spa分型PVL攜帶率比較Fig.3 Comparison of PVL between t437 and other spa type

3 討 論

金黃色葡萄球菌的毒力包括為各種酶、毒素、侵襲力、表面蛋白等，根據(jù)基因編碼位置的不同可以分為兩大類，一類是編碼在可移動(dòng)元件(MGE)上的毒力包括各種類型的超抗原如中毒性休克綜合征毒素、腸毒素，殺白細(xì)胞素(PVL)和剝脫性毒素，另一類是金黃色葡萄球菌的固有毒力，如α-毒素，β-毒素，酚可溶性調(diào)節(jié)肽(PSM)，幾乎所有菌株均攜帶，但是不同毒素基因的表達(dá)水平不同可表現(xiàn)出不同致病性。

CA-MRSA較 HA-MRSA具有更強(qiáng)的毒力已成為近年來MRSA毒力水平研究的熱點(diǎn)， CA-MRSA菌株顯示出相當(dāng)大的逃避中性粒細(xì)胞吞噬的能力，并且已逐漸成為常識。微生物學(xué)專家就CA-MRSA毒力增加的原因提出兩種假說來解釋，一個(gè)是CA-MRSA從MGE中獲得PVL[10]；另一個(gè)是CA-MRSA促進(jìn)核心基因組編碼的毒力基因的表達(dá)，如PSMα、hla等[11]；但這兩個(gè)假說相互之間并無沖突，可以一起來增加CA-MRSA的毒力。

本研究中83株MRSA的PVL陽性率為24.1%，CA-MRSA(36.4%)>HA-MRSA(10.3%)，結(jié)果顯示CA-MRSA菌株更容易攜帶PVL基因。PVL是葡萄球菌殺白細(xì)胞的雙組分家族的成員，由原噬菌體編碼的兩個(gè)相鄰lukS和lukF基因編碼，其產(chǎn)生兩種毒素部分(LukS和LukF)，兩者都是細(xì)胞溶解活性所必需的成分。在CA-MRSA流行的初期，PVL基因lukS和lukF幾乎被發(fā)現(xiàn)于所有CA-MRSA克隆中，而PVL通常不存在于HA-MRSA中[10]。在動(dòng)物感染模型中與同基因的PVL陰性變異體相比，含有PVL的CA-MRSA顯示明顯增加的發(fā)病率和死亡率，表明PVL在嚴(yán)重CA-MRSA相關(guān)性疾病的發(fā)展中的重要作用，PVL對發(fā)病機(jī)制的貢獻(xiàn)可認(rèn)為其能溶解中性粒細(xì)胞的作用相關(guān)聯(lián)[12]，同時(shí)PVL陽性菌株高表達(dá)spa，增加了PVL對中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的裂解能力，增加炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致組織炎癥和壞死[13]。而核心基因組編碼的毒力PSMα在CA-MRSA菌株的皮膚感染模型中的毒力起相當(dāng)大的作用，雖然PSM基因存在于所有金黃色葡萄球菌中，但CA-MRSA菌株較HA-MRSA菌株產(chǎn)生更多的PSM[11]。此外，α-毒素則可以顯著影響皮膚和肺部感染模型中的CA-MRSA毒力，雖然對人中性粒細(xì)胞不溶細(xì)胞，但α-毒素裂解一系列其他細(xì)胞，例如紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并且有助于破壞上皮屏障[14]。agr調(diào)控系統(tǒng)作為金黃色葡萄球菌毒力基因全局調(diào)控的重要開關(guān)，調(diào)控包括PSMα、α-毒素、δ-毒素和其他的毒力決定簇的高表達(dá)，在CA-MRSA高毒力中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)PVL基因的高表達(dá)干擾了agr調(diào)控系統(tǒng)，也可能增強(qiáng)CA-MRSA毒性[15]。

從分子流行學(xué)特征出發(fā)，本研究中20株P(guān)VL陽性的MRSA中，18株為spat437型，占90.0%，其中CA-MRSA-Ⅳa-t437共9株，占45.0%，同時(shí)spat437型也是本研究的主要基因型，CA-MRSA(50.0%)和HA-MRSA(28.2%)，該型是我國健康人群中攜帶率最高的MRSA基因型[16]，在spaRIDOM 官方網(wǎng)(http://www.spaserver.ridom.de)上排名第17位，頻率為0.73%，共有2 890株(2018年2月)。研究發(fā)現(xiàn)spat437型的克隆絕大部分屬于ST59型[17-18]，該克隆是我國南方、鄰近亞洲國家及部分歐洲國家最常見的CA-MRSA菌株[19-20]。值得注意的是本研究中有7株HA-MRSA的PVL基因陽性，SCCmec分型中4株為Ⅲ，3株為Ⅳa，提示攜帶有更高毒力的CA-MRSA克隆已經(jīng)播散到醫(yī)院環(huán)境中引起醫(yī)院獲得性相關(guān)感染如肺炎和手術(shù)切口感染。近年來國內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)有10%～80%的院內(nèi)感染菌株具有CA-MRSA的分子特征[21]，雖然CA-MRSA進(jìn)入院內(nèi)并取代經(jīng)典的HA-MRSA菌株的爭議目前尚無定論，但是有學(xué)者認(rèn)為CA-MRSA通常攜帶較小的SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型的元件，更便捷的轉(zhuǎn)移性，更強(qiáng)的適應(yīng)性，更容易在不同遺傳背景中的菌株中轉(zhuǎn)移[22]，因此推斷在醫(yī)院獲得性相關(guān)感染中CA-MRSA克隆與HA-MRSA克隆將會(huì)共存。

利益沖突：無