痘病毒宿主范圍因子研究進展

成溫玉，賈懷杰，景志忠

痘病毒作為一類廣泛存在的病原，多數(shù)成員能夠感染人和多種動物且能引起死亡。隸屬正痘病毒屬的天花病毒(Variola virus, VARV)曾在人類歷史上造成數(shù)以萬計人的死亡。作為天花疫苗的痘苗病毒(Vaccinia virus, VACV)，成功應(yīng)用于消滅天花的疫苗接種運動，為人類免疫學(xué)的發(fā)展奠定了偉大的基礎(chǔ)。1980年WHO向世界宣布：已在世界范圍內(nèi)徹底消滅了天花，自此全世界各個國家或地區(qū)陸續(xù)停止了天花疫苗接種。然而，由于天花疫苗接種的終止和恐怖主義的威脅，以及一些痘病毒的宿主范圍和疫源地的不斷擴大，使得處于免疫空白狀態(tài)的人和動物隨時面臨痘病毒的威脅。2003年猴痘在美國中西部的的出現(xiàn)，再次為世人敲響了警鐘，尤其是美國、日本等國家，加強天花疫苗的改良和戰(zhàn)略儲備[1]。此外，2014年7月在美國華盛頓某實驗室的儲藏室發(fā)現(xiàn)保存的天花病毒樣本，以及恐怖主義擬利用痘病毒作為生化武器，再次引起人們的警覺[2-3]。據(jù)統(tǒng)計，目前在隸屬痘病毒科脊索動物痘病毒亞科10個屬中超過10種痘病毒都具有感染人的能力，其中的猴痘最有可能引發(fā)大規(guī)模的疫情，且與天花的臨床癥狀尤為相似[4]。因此，本文從痘病毒基因組出發(fā)，對多種痘病毒的宿主范圍基因及其編碼蛋白進行總結(jié)，從而加深對病毒的認識和跨種感染機制的理解。

1 痘病毒宿主范圍因子

痘病毒是已知病毒粒子中體積最大、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的雙鏈DNA病毒，于宿主細胞胞質(zhì)中完成基因組的復(fù)制。痘病毒擁有大量基因組，在不同種屬間130～375 kbp的序列中包含多達328個開放閱讀框(Open Reading Frames, ORFs)。痘病毒基因組序列分析表明，在位于基因組中間約100 kbp的核苷酸序列在所有痘病毒中高度保守，兩端存在多個高變的反向重復(fù)序列(Inverted Terminal Repeats, ITRs)，大小0.1～13 kbp，而在多數(shù)痘病毒成員中，ITRs中又包含許多復(fù)制基因[3]。

痘病毒的成員表現(xiàn)出不同的宿主范圍，即使在同一屬中親緣關(guān)系較近的種間，其宿主范圍具有很大的差異。如正痘病毒屬的VARV僅感染人，而同屬的牛痘病毒(Cowpox virus, CPXV)和猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)卻能感染許多種哺乳動物，具有相對廣泛的宿主譜。此外，多數(shù)痘病毒能夠感染不同動物細胞，而有些卻只能入侵部分特定的細胞系。而這些現(xiàn)象都是基于痘病毒在演化過程中，在宿主范圍上形成的病毒特異性差異基因，被稱作宿主范圍基因(Host range genes，Hrg)[5]。目前已經(jīng)證實，在不同的痘病毒中至少有16個基因具有宿主范圍的功能(見表1)，人為敲除這些基因可造成病毒在易感細胞中的復(fù)制缺陷。

表1 痘病毒宿主范圍基因[5-6]
Tab.1 Poxvirus host range genes[5-6]

2 痘病毒宿主范圍因子家族

2.1PKR抑制因子K3L和E3L 宿主雙鏈RNA依賴性蛋白激酶PKR受多種病毒的感染激活，通過真核翻譯起始因子2(eukaryotic translation initiation factor 2, eIF2)α亞基的磷酸化發(fā)揮抗病毒反應(yīng)。經(jīng)過長期進化，多數(shù)病毒形成了抑制PKR抗病毒的能力[7]。VACV具有2個PKR抑制因子：K3L和E3L，且在許多痘病毒中都含有K3L和E3L蛋白同系物。K3L屬于PKR的一個非磷酸化的假底物，與eIF2α N末端S1域同源，能夠結(jié)合到活化的PKR催化域，使PKR第446位的絲氨酸磷酸化，進而抑制PKR結(jié)合到作用靶點，同時抑制PKR二次自磷酸化[7-8]，從而抑制了機體干擾素(interferons, IFNs)的抗病毒反應(yīng)。K3L缺失的VACV(VACVΔK3L)在鼠L929細胞和BHK細胞中出現(xiàn)增殖障礙，而在Hela細胞和兔RK13細胞中卻能正常增殖。在其他正痘病毒中，鼠痘病毒(Ectromelia virus, ECTV)和MPXV的基因組中不含有K3L的同系物。核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，ECTV第94位有一個T插入造成氨基酸移碼突變使得該基因翻譯提前終止。而在MPXV的序列中也出現(xiàn)類似的情況，序列第130～132處形成終止密碼子引起翻譯提前終止，使得抑制PKR重要的氨基酸基序(KGYID)無法表達[5]。

E3L也是PKR的抑制因子，通過抑制宿主雙鏈誘導(dǎo)性PKR的激活和宿主雙鏈結(jié)合蛋白發(fā)揮抗宿主免疫反應(yīng)。VACV編碼的E3L蛋白包含N端Z-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Z-DNA binding domain, ZBD)和C端雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRNA-bindin domain, dsRBD)。dsRBD通過抑制dsRNA激活因子以及直接結(jié)合PKR激酶阻斷PKR的激活，而ZBD則通過反向作用于PKR的報告基因發(fā)揮功能[9-10]。細胞感染實驗表明，人為敲除E3L基因影響VACV在Hela、Vero和L929細胞的增殖，但在兒童成纖維細胞、BHK和RK13中的復(fù)制無影響。另外，缺失基因E3L基因的VACV其宿主范圍比缺失K3L基因的突變株廣，表明E3L和K3L在決定的宿主范圍方面存在差異。除了MPXV、粘液瘤病毒(Myxoma virus, MYXV)和兔纖維瘤病毒(Rabbit fibroma virus, RFV)之外，已知序列的所有痘病毒均含有E3L同源序列[11]。MPXV的序列分析表明，所有正痘病毒屬E3L起始密碼子ATG在MPXV中突變?yōu)锳TT，使得其大大降低了E3L起始翻譯效率。此外，與VACV E3L序列相比較，MPXV在第50/51 和 第72/73分別出現(xiàn)2個堿基的缺失，從而引起E3L的移碼突變[5]。

2.2C7L/M063R家族和T2/Crm家族 C7L是痘病毒基因組中一個大的超家族，所有已知全基因組的痘病毒都含有C7L家族成員。C7L影響病毒對哺乳動物的細胞嗜性，尤其對部分痘病毒的整個生命周期至關(guān)重要。VACV C7L通過抑制eIF2α的磷酸化拮抗dsRNA激活的蛋白激酶通路，與K1L作用互補[12]。保留K1L和C7L閱讀框的減毒性VACV證實，C7L具有抑制細胞凋亡的功能[12-13]。此外，Meng等人敲除K1L后，證實VACV C7L具有拮抗IFNs介導(dǎo)的抗病毒作用[14]。MYXV含有C7L的同源序列M062R、M063R和M064R，敲除試驗證實，M063R的缺失影響病毒在兔源細胞系的復(fù)制，而M062R缺失影響其在BGMK、RK13、RL-5和人源細胞中的復(fù)制[15-16]。經(jīng)重組病毒研究表明，重組M062R的VACV株(C7L和K1L缺失性)可以拯救其在鼠3T3、Hela和A431細胞中的復(fù)制，而M063R和M064R卻無法實現(xiàn)，表明三者在決定病毒的細胞嗜性方面存在差異[17]。

部分痘病毒表達的T2因子屬于腫瘤壞死因子受體(Receptors for tumor necrosis factor, TNFR)的同系物，具有4個N端半胱氨酸富集域(cysteine rich domains, CRDs)和1個特異性參與T2分泌的C端，CRDs序列與TNFR-2高度同源，能夠中和腫瘤壞死因子和阻斷細胞凋亡[5]。敲除T2的MYXV在對歐洲兔致病力顯著降低，同時在兔RL-5細胞中出現(xiàn)復(fù)制缺陷。與T2同源的其它痘病毒蛋白被稱作細胞因子應(yīng)答修飾物(cytokine response modifiers， Crm)，其中CPXV 編碼CrmB、CrmC、CrmD和CrmE，ECTV僅表達CrmD，MPXV和VACV僅編碼CrmB，而VACV WR、DryVax(Wyeth)和Tian-Tan株均不表達Crm[3]。序列分析發(fā)現(xiàn)，這些不編碼Crm的痘病毒都是由于在其進化過程中DNA序列出現(xiàn)堿基的插入或缺失而破壞了相應(yīng)的ORF所造成的[5]。

2.3T4家族和M11L/F1L家族 細胞凋亡是宿主阻止病原感染的一種重要的防御機制，而病原在長期的進化中也形成了與其相對應(yīng)的抵抗機制。痘病毒編碼25 kDa的T4蛋白具有抑制宿主細胞凋亡的能力，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的凋亡抑制因子。缺失T4基因的MYXV能夠在RK13細胞中正常復(fù)制，而在兔RL15細胞和外周血淋巴細胞中復(fù)制受到影響，同時對歐洲兔的致病力明顯減弱。所有野兔痘病毒屬、山羊痘病毒屬和鹿痘病毒屬的成員均含有T4同源序列，在ITRs區(qū)存在2個相同的拷貝[5]。而在部分正痘病毒屬中，如CPXV-BR 株、CPXV-GRI株、駱駝痘病毒(Camelpox virus, CMLV)、沙鼠痘病毒(Taterapox virus, TATV)和MPXV僅存在單個序列拷貝。ECTV和VACV不含T4同源序列[3]。

MYXV表達另一種抗凋亡蛋白——M11L，定位于線粒體上，發(fā)揮拮抗細胞凋亡作用。與M11L同源的VACV F1L都是通過阻斷凋亡分子Bax和Bak發(fā)揮抗凋亡功能[18]。近期的一項研究表明，F(xiàn)1L還能夠抑制NLR(Nucleotide-binding domain, Leucine-rich repeat and Pyrin domain containing protein)家族成員NLRP1以增強病毒的致病性[19]。M11L和 F1L蛋白在結(jié)構(gòu)上與宿主細胞表達的Bcl蛋白家族相似，都具有類似于BclX1蛋白折疊的結(jié)構(gòu)[20]。M11L缺失的MYXV毒株在兔RK13細胞中正常復(fù)制，而在兔脾細胞中增殖受限，且對兔的致病力明顯降低。序列分析表明，正痘病毒屬、野兔痘病毒屬、山羊痘病毒屬以及豬痘病毒(Swinepox virus, SWPV)都包含M11L/F1L基因[5]。

2.4M13L家族和Serpin家族 MYXV M13L編碼一個包含熱蛋白結(jié)構(gòu)域(Pyrin domain, PYD)、大小為125個氨基酸殘基的蛋白，在人THP-1細胞中抑制caspase-1的激活[3]。Rahman等人的研究發(fā)現(xiàn)，MYXV和RFV表達的M13L都直接作用于含PYD的蛋白ASC-1，從而影響機體IL-1β和IL-18對病原的應(yīng)答[21]。M13L缺陷性病毒在兔RK13細胞中存在復(fù)制障礙，而在RL5細胞、原代血液單核細胞和淋巴細胞中沒有影響[5]。RFV、SWPV、鹿痘病毒(Deerpox virus, DPV)和塔納痘病毒(Tanapox virus, TPV)都含有M13L，而在山羊痘病毒屬的成員以及亞巴猴腫瘤病毒(Yaba monkey tumor virus, YMTV)的基因組中缺失。遺傳發(fā)育分析表明，二者無直接的親緣關(guān)系，這很可能是其在獨立進化過程中發(fā)生基因重組的結(jié)果。

Serpin屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine protease inhibitors，SPI)，在炎癥反應(yīng)、細胞凋亡和補體激活等生物學(xué)反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。多數(shù)痘病毒表達serpin，阻礙宿主對病原的應(yīng)答。正痘病毒屬中存在的SPI-1、SPI-2和SPI-3三種serpin，分別特異性地作用于不同的宿主靶點：SPI-1 作用于組蛋白酶G(cathepsin G)；SPI-2作用于caspases 1、caspases 8、caspases 10 以及顆粒酶B(granzyme B)；SPI-3作用于纖溶酶原激活物和胞漿素以及凝血酶[3,5,22]。Melo-Silva等人證實，ECTV SPI-2蛋白是一種毒力因子，不僅抑制caspases 1和caspases 8的功能，而且阻礙NK細胞對病原的應(yīng)答[22]。SPI-1缺陷性兔痘病毒(Rabbitpox virus, RPXV)在豬PK細胞和人A549細胞中存在復(fù)制缺陷，而在其它細胞中正常復(fù)制。同樣SPI-1缺陷性VACV-WR在A549細胞和人的角質(zhì)細胞不能增殖，但在非洲綠猴BSC-1細胞中正常增殖。序列分析發(fā)現(xiàn)，所有正痘病毒都含有SPI-1、SPI-2和SPI-3同源序列，而羊痘病毒屬、YMTV、RFV、和SWPV僅含1個serpin基因，YLDV和TPV含2個serpin基因[5,23]。

2.5B5R家族和p28/N1R家族 B5R是胞外病毒粒子包膜的重要蛋白成分之一，包括4個串聯(lián)排列的短補體樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Short complement-like repeats, SCRs)和1個C端跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain, TM)，4個SCRs包含近60個氨基酸序列，而這些序列也存在于補體系統(tǒng)蛋白中[5]。B5R敲除的VACV(VACVΔB5R)形成胞外包裹病毒粒子(Extracellular enveloped virions，EEV)受阻，同時影響病毒粒子的毒力[24]。B5R缺陷性VACV LC16m8株在Vero細胞中存在復(fù)制缺陷，而在兔RK13細胞中無影響。敲除B5R基因的RPXV(RPXVΔB5R)在兔RK13、Rat2和非洲綠猴CV-1等細胞中病毒噬斑減少，且在Vero、PK-15和雞胚成纖維細胞中無法形成病毒噬斑。序列分析表明，禽痘病毒屬和副痘病毒屬無B5R相關(guān)基因，而在MYXV、SWPV、山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)和綿羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)的序列中存在的B5R相關(guān)基因，而且其表達物僅包含2個SCRs和1個C端跨膜結(jié)構(gòu)域(見圖1)。

圖1 B5R家族的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the B5R family

ECTV p28和RFV N1R是一類N端含有KilA-N和C端含有RING鋅指結(jié)構(gòu)域的痘病毒特異性泛素連接酶蛋白，在多種痘病毒中高度保守[25]。ECTV編碼的p28蛋白是病毒重要的毒力因子，p28基因敲除的毒株在鼠巨噬細胞中喪失復(fù)制能力。Mottet等人的研究發(fā)現(xiàn)，p28作為一種泛素連接酶，通過KilA-N結(jié)構(gòu)域連接泛素蛋白定位于“病毒工廠”，并受泛素化作用和蛋白酶體降解機制的調(diào)節(jié)[26]。RFV表達p28的同系物N1R，與p28有相同的結(jié)構(gòu)，具有抑制細胞凋亡的功能。序列分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)正痘病毒屬成員都具有p28同源序列，而禽痘病毒含有2個p28同原序列的拷貝(見表2)。

2.6ANK/F-box家族和K1L家族 許多胞內(nèi)蛋白都包含多拷貝的錨蛋白重復(fù)(Ankyrin repeats, ANK)域以調(diào)節(jié)蛋白與蛋白間的相互作用。在痘病毒編碼的蛋白中，含ANK結(jié)構(gòu)域的蛋白形成了一個巨大家族且多數(shù)C端存在F-box樣結(jié)構(gòu)域[27]。目前，CPXV編碼的CP77蛋白和MYXV編碼的T5蛋白都屬于ANK/F-box蛋白，被鑒定為痘病毒的宿主范圍因子。CP77能夠拯救VACV在CHO細胞中的復(fù)制，而在未插入CP77基因的情況下，VACV因無法合成早期蛋白而喪失在CHO細胞中的復(fù)制功能[5]。CP77也能使缺失同源基因的ECTV在倉鼠CHO細胞、兔RK13和SIRC細胞等低復(fù)制效率的細胞系中提高復(fù)制效率[28]。Chang等人在探討CP77的作用機理時發(fā)現(xiàn)，CP77蛋白通過ANK和F-box樣結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合到NF-κB的p65亞基和胞內(nèi)SCF連接酶復(fù)合物抑制TNFα對NF-κB激活[29]。MYXV編碼的ANK/F-box蛋白T5作為毒力因子，對病毒的感染能力至關(guān)重要。T5基因敲除MYXV(MYXVΔT5)在RL5細胞、兔外周單核細胞和人源腫瘤細胞中存在復(fù)制障礙，但在RK13細胞中卻能正常復(fù)制。T5能夠結(jié)合到絲/蘇氨酸激酶Akt并促進其磷酸化和激活，而在MYXVΔT5感染的細胞中Akt磷酸化水平顯著降低，且病毒的滴度明顯減少[30]?；蚪M序列發(fā)現(xiàn)，痘病毒擁有大量的ANK/F-box蛋白編碼基因，其中禽痘病毒屬中的金絲雀痘病毒(Canarypox virus, CNPV)最多含有35個拷貝，其它重要痘病毒也存在多個拷貝(見表2)。

正痘病毒屬的痘病毒存在另一種含ANK結(jié)構(gòu)域但缺少F-box的宿主范圍因子——K1L。缺失K1L基因的VACV-COP株喪失了在兔RK13細胞中的復(fù)制能力，但在人MRC-5、Vero和豬LLC-PK1細胞中復(fù)制能力不受影響[31]。被改造的VACV-Ankara株因缺失K1L基因而毒力大大減弱，而重新插入K1L基因后，能恢復(fù)其在RK13細胞中的增殖能力。VACVΔK1L在RK13細胞中病毒的蛋白合成終止，重構(gòu)的K1L VACV-Ankara株通過抑制IκBα的降解進而阻斷NK-κB信號通路的激活，而VACV-WRΔK1L株卻能激活NK-κB通路，表明除了K1L外，其他的病毒蛋白也參與NK-κB通路的調(diào)節(jié)。除了VARV和CMLV，正痘病毒屬的其它成員都擁有完整的K1L同源序列[32]。早熟終止密碼子的出現(xiàn)和堿基的缺失或插入是引起VARV和CMLV K1L基因失活的關(guān)鍵，因此，遺傳發(fā)育分析顯示，二者形成一個獨立的進化分枝。

表2 痘病毒基因組中存在宿主范圍基因的概況[5]
Tab.2 Summary of presence of host range genes in poxvirus genomes[5]

TNFR familyserpinsC7LfamilyE3LK3LCrmBCrmCCrmDCrmET2P28-likeSPI-1SPI-2SPI-3F1L/M11LC7LM63RT4B5RK1LANK/F-boxVariola virus (VARV)11111111114Vaccinia virus WR (VACV-WR)111211111Cowpox virus GRI-90 (CPXV-BR)11111111111111110Monkeypox virus Zaire (MPXV)111111111116Ectromelia virus (ECTV)11111111114Camelpox virus (CMLV)11111111114Taterapox virus (TATV)11111111113Orf virus (ORFV)15Sheeppox virus (SPPX)111【1】1114Goatpox virus (GTPV)111【1】1114Swinepox virus (SWPV)111【1】114Deerpox virus (DPV)111【2】111115Tanapox virus (TPV)111【1】11114Yaba monkey tumor virus (YMTV)111【1】114Rabbitpox virus (RPXV)111111111114Myxoma virus (MYXV)1111【2】11114Rabbit fibroma virus (RFV)1111【1】1113Canarypox virus (CNPV)2【4】35Fowlpox virus (FPV)2【4】19

注：“【】”表示進化過程中產(chǎn)生的與宿主范圍基因關(guān)聯(lián)性的相關(guān)基因。

3 小結(jié)與展望

相對于其他病毒而言，痘病毒基因組龐大，編碼多種蛋白，使得其在宿主細胞的胞質(zhì)中就能完成基因組復(fù)制。在多數(shù)痘病毒基因中，約有100個基因特別保守，這近百個基因?qū)τ诓《镜膹?fù)制和成熟至關(guān)重要，而其他的基因則較為分歧，位于基因組兩端的ITRs區(qū)，主要參與宿主致病、免疫調(diào)節(jié)以及決定感染宿主的范圍。痘病毒的嗜性是其主要的特性，也是人們的研究熱點。這種嗜性不僅受病毒自身編碼的宿主范圍因子決定，也涉及到病原與宿主間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，痘病毒嗜性至少取決于3個層次：①細胞嗜性。病毒在不同的細胞系上表現(xiàn)出不同的復(fù)制能力；②組織器官的嗜性；③生物個體的嗜性。病毒在受到細胞和組織器官嗜性的影響以及宿主機體免疫應(yīng)答的影響后，顯現(xiàn)出致病性和癥狀的差異性[3,33]。幾乎所有的痘病毒都能結(jié)合并入侵哺乳動物細胞，其入胞后下游的一系列胞內(nèi)事件決定了病毒復(fù)制的限制性[34-35]?？傊?，痘病毒宿主范圍和嗜性不僅受其自身編碼的宿主范圍因子決定，而且取決于病原與宿主的相互作用。

痘病毒是一種古老的病毒，經(jīng)歷了漫長的演化過程。起初VARV被認為只感染動物，后來經(jīng)過不斷進化到只感染人，同時缺乏存儲宿主，這也是消滅天花的關(guān)鍵。整體上看，痘病毒的宿主范圍表現(xiàn)出由窄到寬的趨勢，先前有些認為不具人畜共患性的成員，當前表現(xiàn)出感染人的趨勢，而有些只感染幾種宿主，當前卻能感染多種宿主。因此，加強痘病毒的研究，發(fā)掘其龐大基因組中潛在的功能基因，通過不同種屬病毒對比，預(yù)測其進化趨勢，對于痘病毒的預(yù)防和消滅至關(guān)重要；應(yīng)用高通量測序技術(shù)，探究病毒與宿主相互作用機制，重視痘病毒宿主譜的監(jiān)測，加深我們對痘病毒致病機制、進化方式的認識和理解，從而更好地預(yù)防痘病疫情，避免類似SARS這種因人類忽視而暴發(fā)嚴重的疾病。同時充分利用痘病毒自身生物學(xué)特性，通過人為改造等方式為人所用，研制類似于天花疫苗的重組痘病毒或載體疫苗，為痘病毒及其他病原體的所引發(fā)的疫病有效防控具有積極的意義。

利益沖突：無