特異性敲除CD147基因抑制小鼠非酒精性脂肪性肝炎的機制研究*

沈曉雯 戴世榮 黃琳玲

江蘇省南通市第二人民醫(yī)院檢驗科 (江蘇 南通, 226001)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 主要是由肝細胞內(nèi)脂肪堆積引起，會發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，甚至肝癌[1]。NASH進展的主要因素是肝細胞凋亡與炎癥反應，其嚴重程度與肝細胞的凋亡程度呈正相關，肝細胞在受損時會激活炎癥通路，釋放細胞因子調(diào)控疾病的進展[2，3]。CD147基因在多種腫瘤細胞及炎癥組織中廣泛表達，與親環(huán)蛋白等發(fā)生關鍵作用，有助于釋放促炎細胞因子[4，5]。早前研究發(fā)現(xiàn)CD147基因參與了肝纖維化的形成，促進了腫瘤的發(fā)生[6]。目前，尚不明確CD147基因在NASH中的表達情況與作用，故筆者研究CD147基因在肝臟疾病早期炎癥階段中的作用，探討其可能的病理生理作用機制，為臨床早期抑制NAFLD、NASH等肝臟疾病提供新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 造模與分組 購買BALB/c基因敲除小鼠12只(雌雄不限，上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，鼠齡8周，體質(zhì)量(13±4) g。打耳標標記并剪取少量尾巴，提取全基因組DNA，經(jīng)鑒定符合肝細胞特異性敲除CD147基因小鼠，其中6只采用蛋氨酸-胱氨酸缺乏飼料(MCD)喂養(yǎng)簡稱A1組，另6只采用正常飼料喂養(yǎng)簡稱A2組。另12只為沒有敲除CD147基因小鼠，其中6只也采用MCD喂養(yǎng)簡稱B1組，另6只采用正常飼養(yǎng)喂養(yǎng)，簡稱B2組。兩周后處死小鼠，測定其血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-18(IL-18)、NLR家族Prin域3(NLRP3)，并檢測B細胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax蛋白)等表達。觀察小鼠肝細胞凋亡情況。

1.2 材料與試劑 胎牛血清(FBS,美國Hyclone公司)；RPMI-1640細胞培養(yǎng)液(美國GIBCOBRL公司)；四甲基偶氮唑(MTT，進口分裝,華美生物工程公司)；二甲基亞砜(DMSO，分析純)購自江蘇鴻聲；Western Blot試劑、免疫熒光試劑購自上海碧云天；0.25%胰酶購自吉泰科技；免疫組化試劑(SP9000試劑盒、DAB顯色劑)購自北京中杉金橋；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I Mix PCR試劑(日本Takara公司)；ECL發(fā)光液(美國Thermo Scientific公司)；美國Millipore公司的PVDF膜(0.45 μm)；美國Millipore公司的EZH2多克隆抗體；美國Santa Cruz公司的辣根過氧化物酶標記二抗；美國GIBCO公司的RPMI 1640培養(yǎng)液；美國Applied biosystems公司的PT-PCR反應用96孔板；上海生工公司合成的RT-PCR引物；上海吉瑪生物技術有限公司的mRNA模擬物片段及對照片段；美國Invitrogen公司的Lipofect AMINE 2000細胞轉(zhuǎn)染試劑；美國Life 技術公司的TRlzol試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑；廣州市銳博生物科技有限公司的Cell-LightTMEdU Apollo 567 In vitro Kit檢測試劑盒。

1.3 儀器與設備 3111型CO2培養(yǎng)箱、CL17R型冷凍高速離心機均購自Thermo Forma公司；低溫冰箱購自SANYO公司；SW-CJ-1F層流超凈生物學工作臺(蘇州安泰)；ELX808酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BioTek公司)；丹麥NUN CLON公司的細胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶；日本Olympus公司的XPS-18型倒置熒光顯微鏡；美國Bio-Rad公司的蛋白印記檢測系統(tǒng)與凝膠成像儀；Step One PLUS熒光定量PCR儀，羅氏480熒光定量PCR儀，Leica Bond-Max免疫組化儀，Bio-Rad S1000梯度PCR儀。

1.4 試驗方法

1.4.1 qRT-PCR檢測全基因組DNA 采用TaKaRa公司生產(chǎn)的Trizol試劑分別提取處理細胞的總RNA，定量后依照TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書嚴格操作制備cDNA。利用上海生物工程公司合成引物，將GAPDH為內(nèi)參照物，采用SYBR Green法定量檢測以下mRNA表達水平。CD147-LoxP引物序列，上游5′-ATAGAAATGGGGATGCTCTG-3′，下游5′-GGCTCTGTCTTCACTTGG-3′；Alb-Cre引物序列，上游5′-ACAGCTCCCAGATGGCAAACATAC-3′，下游5′-ATCACTCGTTGCATCATGACCG-3′。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于Real-time PCR儀上進行擴增并檢測熒光。反應體系為：2×Taq PCR Master Mix 5μl，上游引物(15μmol/L)0.5μl，下游引物(15μmol/L)0.5μl，cDNA1μl，用DEPC處理水補齊20μl。PCR反應條件：94℃預變性3min，活化Tag酶；92℃ 30s，58℃ 60s，72℃ 30s，共循環(huán)34次。以上每組均設復孔3個，重復3次，按照2-ΔΔCT法統(tǒng)計定量分析以上mRNA 的表達水平。

1.4.2 法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 分別提取4組小鼠肝臟組織的總蛋白，使用BCA試劑盒檢測各指標濃度，利用8 %十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳50 μg總蛋白，濕轉(zhuǎn)法并轉(zhuǎn)膜，用5 %脫脂牛奶封閉1 h加入1∶200稀釋的一抗，4 ℃搖床中孵育12 h。完成后再使用TBST清洗3次，10 min/次，接著加入1∶300稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗，再重復以上清洗，最后采用Pierce公司生產(chǎn)的超敏ECL試劑暗室曝光檢測蛋白條帶，以內(nèi)參的灰度值為100 %進行比較和半定量分析。

1.4.3 qRT-PCR檢測相關的細胞因子RNA 同小鼠肝組織的總RNA提取方法一致，在擴增目的片段的同時以18 S作為內(nèi)參對照，重復測定3次。其中18 S引物序列，上游5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′，下游5′-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3′；IL-1β引物序列，上游5′-GAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3′，下游5′-GATCCATACTATCCAGGCTGCA-3′；IL-18引物序列，上游5′-GACTCTTGCGTCAACTTCAAGG-3′，下游5′-CAGGCTGTCTTTTGTCAACGA-3′；NLRP3引物序列，上游5′-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3′，下游5′-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3′。

1.4.4 肝組織脂肪蘇木精-伊紅(HE)染色 4組小鼠肝臟石蠟切片65 ℃烤箱中30 min，依次放入二甲苯、無水乙醇中個5 min，放入2個95 %乙醇中各2 min，80 %、75 %乙醇、蒸餾水中各2 min。接著進行蘇木精染色10 min，1 %鹽酸乙醇分化，蒸餾水沖洗后在PBS中反藍5 min，伊紅染色5 min，蒸餾水沖洗置于95 %乙醇中10 s，依次放入無水乙醇、二甲苯中各2 min，最后中性樹膠封片。

1.4.5 肝組織脂肪油紅O染色 小鼠肝組織冰凍切片用甲醛-鈣液固定10 min，蒸餾水洗3 min，60 %異丙醇浸洗3 min，油紅O染色10 min，60 %異丙醇分化至無色，蒸餾水沖洗后，蘇木精復染5 min，自來水藍化3 min，最后甘油明膠封片。

1.4.6 血清ALT、AST檢測 在96孔板中進行反應，每組設置6個重復孔。在37℃孵箱內(nèi)5 μl小鼠血清與20 μl基質(zhì)液混勻，氣浴30 min，各孔中加入0.4 mol/L氫氧化鈉200μl，振蕩10 min，混勻后靜置15 min。采用酶標儀在510 nm處吸光度A值，并繪制生長曲線計算相應酶活單位。

1.4.7 小鼠肝細胞凋亡檢測 石蠟組織放入二甲苯I、II中各5 min脫蠟，接著依次浸泡在100 %乙醇5 min，90 %、80 %、70 %的乙醇中3 min。接著依次滴加100 μl 蛋白酶K溶液、3% 過氧化氫-甲醇溶液，室溫孵育20 min、5 min，結(jié)束后TBS漂洗增加組織的通透性以及滅活內(nèi)源性過氧化氫酶活性；接著滴加100 μl 1×TdT平衡溶液，繼續(xù)孵育30 min，去液后滴加100 μl的TdT標記混合液，37 ℃孵育90 min，結(jié)束后TBS漂洗，滴加100 μl終止緩沖液，孵育5 min，TBS漂洗。最后，滴加100 μl封閉緩沖液，室溫孵育10 min，去液后滴加100 μl稀釋過的偶聯(lián)物，繼續(xù)孵育30 min，TBS漂洗，滴加100 μl DAB顯色液，繼續(xù)孵育15 min，去離子水漂洗，然后滴加100 μl甲基綠復染，繼續(xù)孵育3 min，依次浸入2～4次無水乙醇與二甲苯，蓋玻片封片，進行顯微鏡鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 MCD喂養(yǎng)的兩組小鼠脂肪組織兩種染色情況 HE染色與油紅O染料染色結(jié)果均顯示，A1組小鼠在2周時的脂肪變性程度明顯弱于B1組小鼠，其主要特征為脂肪空泡面積縮小。見插頁彩圖1。

圖1 MCD 喂養(yǎng)的兩組小鼠肝臟脂肪組織染色圖

2.2 4組小鼠ALT、AST水平測定結(jié)果 見表1。

表1 4組小鼠ALT和AST水平比較

A2組比較，*P< 0.05；與B2組比較，△P< 0.05；與B1組比較，#P< 0.05

2.3 MCD喂養(yǎng)的兩組小鼠肝脂肪組織染色情況 見插頁彩圖2。當MCD誘導后，A1組小鼠肝組織內(nèi)肝細胞的凋亡數(shù)量明顯少于B1組(P<0.05)。

圖2 MCD 喂養(yǎng)的兩組小鼠肝細胞凋亡圖（（Tunel 染色，×200））

2.4 4組小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達水平檢測結(jié)果 見表2。

表2 4組小鼠Bax、Bcl-2的表達水平比較

與A2組比較，*P< 0.05；與B2組比較，△P< 0.05；與B1組比較，#P< 0.05

2.5 4組小鼠肝組織中IL-1β、IL-18、NLRP3檢測結(jié)果 見表3。

表3 4組小鼠肝組織IL-1β、IL-18、NLRP3表達比較

與A2組比較，*P< 0.05；與B2組比較，△P< 0.05；與B1組比較，#P< 0.05。

3 討論

NASH病程進展的主要因素有肝細胞死亡、炎癥反應和細胞因子釋放等[7]。CD147基因能誘導基質(zhì)細胞，降解細胞外基質(zhì)，參與腫瘤的代謝過程，促進腫瘤進展；同時，CD147基因也參與調(diào)控眾多免疫性疾病，對炎性與促炎細胞因子的釋放發(fā)揮關鍵的作用[5,8]。已有研究報道采用Cre-LoxP系統(tǒng)構建肝細胞特異性敲除不同基因小鼠，且肝細胞中不同基因敲除不影響小鼠的正常生長[9,10]。鑒于早前研究顯示NASH小鼠CD147基因在肝細胞中表達較明顯，本研究建立肝細胞特異性敲除CD147基因的NASH小鼠模型，研究其抑制小鼠NASH的發(fā)展，探究其可能的作用機制。

NASH進展的初始表現(xiàn)為肝細胞內(nèi)脂肪大量積累，超過了肝組織代謝能力而發(fā)生一系列應激反應、肝功能紊亂，加速NASH病程進展[11]。吳明兵等采用渥曼青霉素處理高脂飲食飼養(yǎng)的非酒精脂肪肝模型小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠的體質(zhì)量、肝功能、胰島素抵抗、葡萄糖抵抗及肝臟脂肪指數(shù)變化均明顯小于高脂飲食單獨喂食的小鼠，同時結(jié)果顯示渥曼青霉素處理小鼠CMKLR1和NLRP3的表達下調(diào)，KCs介導的炎性反應減弱，這可能是通過Chemerin/CMKLR1途徑抑制Kupffer細胞NLRP3的活性緩解小鼠肝臟脂肪變性以及炎性反應[12]。吳強等研究發(fā)現(xiàn)CD147基因與周圍型非小細胞肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移有關，其陽性表達與腫瘤的大小、深分葉征、棘突征、縱隔淋巴結(jié)腫大有關，表明CD147基因參與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[13]。何拓等綜述了CD147基因在肝細胞癌、乳腺癌及宮頸病變中的作用，發(fā)現(xiàn)CD147基因常常會被激活并重新表達，而且通過多種機制可以促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的惡性生物學行為中扮演了重要角色[14]。吳海燕等發(fā)現(xiàn)在小鼠肝癌細胞Hepa1-6細胞可通過其CD147基因及其配體CypA作用，促進其自身細胞增殖，并同時影響CypA對T細胞的趨化能力，進而逃避T細胞的免疫監(jiān)視作用[15]。以上研究表明CD147基因可以調(diào)節(jié)脂肪酸代謝促進肝癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移，通過多種途徑參與脂肪代謝與脂肪細胞的分化，提示CD147基因在NASH中可能參與促進肝細胞內(nèi)部脂肪變性。本研究結(jié)果提示小鼠特異性敲除CD147可以減弱NASH引起的脂肪組織變性。CD147基因被認為具有抗凋亡作用，可以促進腫瘤細胞的存活[16]。本研究結(jié)果還提示特異性敲除CD147基因可以減弱NASH引起的小鼠肝細胞損傷，抑制NASH疾病進展，減弱NASH引起的肝細胞凋亡。

NASH發(fā)展過程中會發(fā)生明顯的炎癥應答，刺激炎癥通路，釋放炎癥因子，激活肝星狀細胞與Kupffer細胞的功能，促進肝臟纖維化[10,17]。IL-1β與IL-18是IL-1家族的細胞因子，參與了炎性小體NLRP3的炎癥信號轉(zhuǎn)導過程，而IL-1β不僅能促進肝星狀細胞的增殖和活化，還加速肝癌惡化，而Kupffer細胞、肝細胞在NASH中能釋放大量的IL-1β[18，19]。在NASH的病理變化過程中，肝細胞會經(jīng)歷脂質(zhì)積累、死亡以及氧化應激反應導致肝纖維化，最終癌變。本研究采用qRT-PCR的方法檢測了相關的細胞因子IL-1β、IL-18在小鼠肝臟組織中的表達情況，結(jié)果提示小鼠肝細胞特異性敲除CD147基因可以減弱NASH引起的肝細胞炎癥反應。

綜上所述，在NASH中敲除CD147基因能夠減輕肝組織脂肪變性、減少肝細胞凋亡(下調(diào)促凋亡分子Bax水平，上調(diào)抗凋亡分子Bcl-2水平)和細胞因子IL-1β、IL-18、炎性小體NLRP3的表達，最終抑制NASH進展。