西部小品種鮮乳及其發(fā)酵酸乳中礦物元素和維生素含量差異分析

王海燕，溫 榮，劉登麗，馬筱怡，王歡紫，范澍田，孫奇武，葛武鵬,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 陜西省標(biāo)準(zhǔn)化研究院，陜西 西安 710000；3.陜西秦龍乳業(yè)集團有限公司，陜西 西安 710000）

礦物元素和維生素是維持人體生理功能的重要物質(zhì)。乳及乳制品中含有多種礦物元素和維生素，乳品及其發(fā)酵制品的攝入對達到礦物質(zhì)及維生素的每日推薦膳食攝入量的貢獻十分重要。鈣（Ca）是人體中的常量必需元素，具有構(gòu)成人體組織、調(diào)節(jié)機體系統(tǒng)、組織、器官正常生理功能及細胞活動的功能，還有激活機體內(nèi)多種酶系統(tǒng)的功能，如琥珀酸脫氫酶、脂肪酶及三磷酸腺苷酶等[1-2]；當(dāng)Ca攝入不足時可造成Ca代謝紊亂，進而引發(fā)骨質(zhì)疏松、內(nèi)分泌失調(diào)、心腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病[3]。鐵（Fe）和鋅（Zn）是人體必需的微量元素，F(xiàn)e是一些酶類的重要組成成分，如過氧化氫酶，參與氧的運輸及多種代謝[4]，Zn作為多種酶的輔助因子參與糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸代謝[5]。Fe缺乏會引起貧血、神經(jīng)節(jié)能紊亂，Zn缺乏會引起生長遲緩、食欲不振、免疫功能受損等問題[5-6]。VA又名視黃醇，具有維持視覺功能正常、上皮細胞結(jié)構(gòu)完整與健康、增強機體造血功能及促進機體正常生長發(fā)育的功能[7]。VE又名生育酚，可增強機體免疫力，具有抗氧化、抗衰老、抗不育等作用[8]。VA缺乏易引起夜盲癥、干眼病，VE缺乏會引起細胞損傷、影響生殖功能及機體免疫[7-8]。

馬乳、駝乳和牦牛乳作為我國西部特色小品種乳，近年來因其高營養(yǎng)價值成為研究開發(fā)的熱點，但由于經(jīng)濟條件、傳統(tǒng)觀念、地域條件和生產(chǎn)水平等因素的制約，此類天然綠色乳品的開發(fā)利用仍處于初級階段[9]。本研究對中國西部牧區(qū)的馬乳、駝乳、牦牛乳及其發(fā)酵乳的Ca、Fe、Zn 3 種礦物元素及VA、VE含量進行差異性分析，探討地域、品種、發(fā)酵因素對西部特色小品種乳礦物元素和維生素含量的影響，為西部特色小品種乳的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

于青海牧區(qū)采集13 份鮮牦牛乳和10 份酸牦牛乳，甘肅牧區(qū)采集7 份鮮牦牛乳和6 份酸牦牛乳；內(nèi)蒙古和新疆牧區(qū)各采集10 份鮮馬乳、10 份酸馬乳、10 份鮮駝乳和10 份酸駝乳；西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧教學(xué)實驗基地采集10 份鮮羊乳；共計采集樣品86 份。密封并迅速冷卻，在冰盒內(nèi)4 ℃冷藏運至實驗室，于-80 ℃冰箱凍藏備用。

1.1.2 試劑

Ca、Fe、Zn、銠（Rh）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；液氬、硝酸（優(yōu)級純）、無水乙醇（色譜純）、VA標(biāo)準(zhǔn)品（C20H30O，純度≥95%）、VE標(biāo)準(zhǔn)品（α-生育酚，C29H50O2，純度≥95%） 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜純） 美國Tedia公司；石油醚（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸 美國Aladdin公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICAPQ01807電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）儀 美國賽默飛世爾公司；AUY220電子精密天平 日本島津公司；Mutiwave PRO高通量微波消解儀 奧地利安東帕公司；趕酸板 博通實驗儀器有限公司；DHP-140電熱恒溫干燥箱 中儀國科（北京）科技有限公司；1260 Infinitely二維高效液相色譜儀、Extend C18色譜柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm） 美國安捷倫公司；SHZ-82恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；YRE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 河南鞏義玉華儀器有限公司；UGC-24CF氮吹儀 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；UPK超純水機 西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Ca、Fe、Zn含量測定

1.3.1.1 微波消解

移取液體樣品2 mL于微波消解罐中，加入8 mL硝酸，加蓋放置1 h，旋緊罐蓋，按照微波消解儀的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進行消解；冷卻后取出，緩慢打開罐蓋排氣，用少量水沖洗內(nèi)蓋，將消解罐放在150 ℃的趕酸板中，趕去棕色氣體，取出消解內(nèi)罐，將消化液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，并定容至刻度，混勻備用；同時做試劑空白實驗。微波消解儀消解條件如表1所示。

表 1 微波消解儀消解條件Table 1 Microwave digestion conditions

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

Ca、Fe、Zn系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度如表2所示。內(nèi)標(biāo)使用液：所用內(nèi)標(biāo)元素為Rh，內(nèi)標(biāo)使用液質(zhì)量濃度為10 μg/L。

表 2 Ca、Fe、Zn系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度Table 2 Concentrations of Ca, Fe and Zn in standard solutions

1.3.1.3 ICP-MS測定

利用ICP-MS儀（標(biāo)準(zhǔn)模式下）對Ca、Fe、Zn系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，得到信號響應(yīng)值。以元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)元素與所選內(nèi)標(biāo)元素響應(yīng)值比-離子每秒計數(shù)值（每秒撞擊到的樣品中離子數(shù)，反映強度值）比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將消解后的樣品溶液在ICP-MS儀中進行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品溶液中Ca、Fe、Zn元素的含量。

1.3.2 VA、VE含量測定

1.3.2.1 皂化

稱取40 g（精確至0.000 1 g）液體試樣于150 mL平底燒瓶，加入50 mL VC-乙醇溶液（15 g VC用無水乙醇定容至1 L），再加入25 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，混勻后于53 ℃恒溫水浴中振蕩（110 r/min）皂化50 min，冷卻至室溫。

1.3.2.2 提取、洗滌

將皂化液用30 mL水轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加入50 mL石油醚，振蕩萃取10 min；將下層溶液轉(zhuǎn)移并重復(fù)萃取，合并醚層；用約100 mL水重復(fù)洗滌醚層，直至將醚層洗滌至中性，去除下層水相。

1.3.2.3 濃縮

將洗滌后的醚層經(jīng)無水硫酸鈉（約3 g）濾入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，用約15 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2 次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上55 ℃水浴減壓蒸餾，待瓶中醚液剩下約2 mL時，取下蒸發(fā)瓶，氮吹至近干。用2.5 mL乙醇將蒸發(fā)瓶中殘留物溶解并過0.22 μm有機系濾膜后供高效液相色譜測定。

1.3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇作為溶劑，配制質(zhì)量濃度分別為1、2、4、8、16 μg/mL的VA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)量濃度分別為1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 μg/mL的VE系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2.5 色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流速1 mL/min；紫外檢測波長：VA為325 nm、VE為294 nm；進樣量10 μL；流動相A為水，流動相B為甲醇。梯度洗脫程序如表3所示。

表 3 梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution procedure

1.3.2.6 高效液相色譜測定

采用外標(biāo)法定量。將VA、VE系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別注入高效液相色譜儀中，以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣中VA、VE的含量按下式計算。

式中：X為試樣中VA、VE的含量/（μg/100 g）；ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的試樣中VA、VE的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為定容體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0和Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同牧區(qū)鮮乳中礦物元素含量的差異性分析

表 4 不同牧區(qū)鮮乳中礦物元素的含量Table 4 Contents of mineral elements in fresh milk samples from different regions

由表4可知：采自新疆和內(nèi)蒙古2 個牧區(qū)的鮮馬乳中Ca、Fe、Zn的含量均不存在顯著差異（P＞0.05）；新疆和內(nèi)蒙古牧區(qū)鮮駝乳中Ca、Fe含量均存在顯著差異

（P＜0.05），新疆牧區(qū)鮮駝乳中Ca、Fe含量均顯著高于內(nèi)蒙古牧區(qū)鮮駝乳，而Zn含量差異不顯著（P＞0.05）；青海和甘肅牧區(qū)鮮牦牛乳中Ca含量差異不顯著（P＞0.05），而不同牧區(qū)鮮牦牛乳中Fe和Zn含量差異顯著（P＜0.05），這與羅玉珠等[10]的研究結(jié)果一致，其中甘肅牧區(qū)鮮牦牛乳中Fe含量顯著高于青海牧區(qū)（P＜0.05），青海牧區(qū)鮮牦牛乳中Zn含量顯著高于甘肅牧區(qū)（P＜0.05）。

2.2 不同品種鮮乳及其發(fā)酵乳中礦物元素含量的差異性分析

表 5 不同品種鮮乳及其發(fā)酵乳中礦物元素的含量Table 5 Contents of mineral elements in milk samples from different animals species

由表5可知：4 種鮮乳中，牦牛乳與羊乳Ca含量差異不顯著（P＞0.05），但與馬乳和駝乳差異顯著（P＜0.05），且牦牛乳和羊乳Ca含量顯著高于駝乳和馬乳；駝乳Ca含量顯著高于馬乳，這與蔣曉梅等[11]的結(jié)論一致；馬乳Ca含量最低，僅為（0.60±0.10） mg/g。4 個不同品種鮮乳中Fe含量存在顯著差異（P＜0.05），且牦牛乳Fe含量顯著高于羊乳、駝乳和馬乳，牦牛乳Fe含量達到（1.92±0.22） mg/kg，約為馬乳Fe含量的2 倍，馬乳Fe含量最低，僅為（0.90±0.09） mg/kg，這與林波等[12]的結(jié)論一致。牦牛乳、駝乳和羊乳的Zn含量均有顯著差異（P＜0.05），羊乳與馬乳Zn含量差異不顯著（P＞0.05）；牦牛乳Zn含量顯著高于駝乳、羊乳與馬乳，與李亞茹等[13]的研究結(jié)果一致，牦牛乳Zn含量達到（5.20±0.63） mg/kg，約為馬乳、羊乳Zn含量的2 倍，駝乳Zn含量僅次于牦牛乳，酸馬乳Zn含量最低。馬乳、駝乳、牦牛乳發(fā)酵后，其礦物元素含量變化均不顯著（P＞0.05）。

由以上分析可知，4 種鮮乳中，牦牛乳中礦物元素含量最為豐富，駝乳和羊乳次之，馬乳中礦物元素含量最低。乳中礦物元素含量的差異由多種因素造就，如環(huán)境、遺傳因素、營養(yǎng)水平等[13]，而發(fā)酵不影響乳中礦物元素的含量。

2.3 不同牧區(qū)鮮乳中VA、VE含量的差異性分析

由表6可知，內(nèi)蒙古牧區(qū)鮮馬乳中VA、VE的含量略高于新疆牧區(qū)（P＞0.05），而內(nèi)蒙古牧區(qū)鮮駝乳中VA、VE的含量顯著低于新疆牧區(qū)（P＜0.05），甘肅牧區(qū)鮮牦牛乳中VA、VE的含量略低于青海牧區(qū)（P＞0.05），這可能是由于牦牛乳中VA、VE的含量隨海拔的升高而增加[14]。乳中的VA、VE來自于飼料和牧草，氣候、放牧及飼養(yǎng)管理等因素會影響其含量[13]，牧場草地營養(yǎng)水平直接影響動物的營養(yǎng)狀況，進而間接影響乳中維生素的含量[15]。本研究中馬乳、駝乳和牦牛乳樣品采集地的氣候類型、海拔、草場類型、牧草種類及生長狀況均有所不同，降雨量和日照時間存在差異，使乳中VA、VE的含量存在差異[16]。

表 6 不同牧區(qū)鮮乳中VA、VE的含量Table 6 Contents of VA and VE in fresh milk samples from different regions μg/100 g

2.4 不同品種鮮乳及其發(fā)酵乳中VA、VE含量的差異性分析

表 7 不同品種鮮乳及其發(fā)酵乳中VA、VE的含量Table 7 Contents of VA and VE in milk samples from different animal speciesμg/100 g

由表7可知：不同品種鮮乳間VA的含量存在顯著性差異（P＜0.05），羊乳中VA的含量最高，其次為駝乳；除馬乳和駝乳中VE的含量無顯著性差異外（P＞0.05），其余乳種間VE的含量差異顯著（P＜0.05）；牦牛乳中VE的含量最高，為60.41 μg/100 g，羊乳次之；馬乳中VA、VE的含量均最低，這是由于脂溶性維生素需以脂肪為載體[17-18]，馬乳為低脂乳類，因此馬乳VA、VE的含量低于駝乳、羊乳和牦牛乳。牧草、飼料先后被胃蛋白酶、腸蛋白酶作用，其中的維生素在小腸中被酯化吸收[19]，不同品種動物的胃腸環(huán)境不同，對草料中維生素的吸收利用率也不同，這也可能是造成乳中維生素含量差異顯著的原因之一[16]。

鮮乳及其發(fā)酵乳間VA的含量無顯著性差異（P＞0.05），且鮮乳中VA的含量略高于發(fā)酵乳，但發(fā)酵過程對其含量影響較小。駝乳和牦牛乳發(fā)酵后VE含量均有不同程度降低（P＜0.05），可能是因為VE對酸性環(huán)境敏感，遇酸類易被破壞[16]。目前的研究表明，由于酸乳發(fā)酵過程中微生物的利用以及維生素的化學(xué)分解，發(fā)酵乳中脂溶性維生素的含量會有一定程度的減少[20]。本研究中，酸駝乳和酸牦牛乳中VA、VE以及酸馬乳中VA的含量均低于發(fā)酵前，但酸馬乳中VE的含量高于發(fā)酵前，這可能是由牧民制作傳統(tǒng)酸馬乳的發(fā)酵環(huán)境不同導(dǎo)致的[16]，發(fā)酵菌種、時間和溫度等發(fā)酵條件對維生素含量的影響較大[19]。

3 結(jié) 論

地域、乳種及發(fā)酵因素對小品種鮮乳（馬乳、駝乳、牦牛乳）及其傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳Ca、Fe、Zn元素和VA、VE的含量有著不同的影響：1）地域差異：新疆牧區(qū)的鮮駝乳中Ca和Fe含量均顯著高于內(nèi)蒙古牧區(qū)（P＜0.05）；甘肅牧區(qū)鮮牦牛乳中Fe含量顯著高于青海牧區(qū)（P＜0.05），青海牧區(qū)鮮牦牛乳中Zn含量顯著高于甘肅牧區(qū)（P＜0.05）。內(nèi)蒙古牧區(qū)鮮馬乳中VA、VE的含量均略高于新疆牧區(qū)（P＞0.05），新疆牧區(qū)鮮駝乳中VA、VE的含量顯著高于內(nèi)蒙古牧區(qū)（P＜0.05），青海牧區(qū)鮮牦牛乳中VA、VE的含量均高于甘肅牧區(qū)。2）品種差異：牦牛乳和羊乳中Ca含量顯著高于駝乳和馬乳（P＜0.05），馬乳中Ca含量最低；4 個品種乳的Fe含量均存在顯著差異（P＜0.05），牦牛乳中Fe含量顯著高于羊乳、駝乳和馬乳（P＜0.05），馬乳中Fe含量最低；牦牛乳中Zn含量顯著高于駝乳和馬乳（P＜0.05），牦牛乳Zn含量最高，馬乳中Zn含量最低；不同品種乳的VA含量差異顯著（P＜0.05），馬乳中含量最低；牦牛乳中VE的含量與其他乳差異顯著（P＜0.05），牦牛乳中含量最高，馬乳中含量最低。3）發(fā)酵差異：發(fā)酵不影響乳中礦物元素的含量。除酸馬乳中VE的含量顯著高于鮮馬乳（P＜0.05）外，其余乳種發(fā)酵后VA、VE含量均有不同程度的降低。