光譜法研究銅離子熒光探針與人血清白蛋白的相互作用

朱琳，馬明碩，柳彩云

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林化工學(xué)院 分析測試中心，吉林 吉林 132022；3.濟南大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，山東 濟南 250022)

人血清白蛋白(HSA)主要特點是能與許多內(nèi)源性和外源性化合物相互結(jié)合，在人體內(nèi)主要承擔(dān)載體的任務(wù)[1-3]。通過相互作用的研究，可以為物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究以及物質(zhì)與白蛋白結(jié)合的本質(zhì)研究提供重要的數(shù)據(jù)以及理論指導(dǎo)。本實驗設(shè)計識別碼為Cu2+的羅丹明類化合物探針(DQX-1，圖1)，通過對探針與人血清白蛋白的相互作用的研究，得到了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、結(jié)合距離，以及本探針對人血清白蛋白構(gòu)象的影響，并從分子水平上解釋了兩者之間的相互作用。這些內(nèi)容是研究臨床動力學(xué)以及臨床藥理所重點關(guān)注的內(nèi)容，不僅為進一步探討探針的識別原理提供了科學(xué)依據(jù)，同時對于新型探針的設(shè)計以及應(yīng)用也有特別的價值。

圖1 DQX-1結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of DQX-1

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

HSA(Sigma)，濃度為10-5mol/L的備用液是用二次蒸餾水配制成；濃度為10-3mol/L的探針DQX-1備用液是用三氯甲烷配成的；Tris(用蒸餾水和三羥甲基氨基甲烷配制成10-2mol/L 500 mL溶液，pH=7.4)緩沖液；三氯甲烷、三羥甲基氨基甲烷均為分析純；水為二次蒸餾水。

Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計；UV2550型紫外可見分光光度計；Jasco-810圓二色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜測定探針與HAS之間相互作用 用刻度移液管分別移取準確量的HSA溶液和探針溶液到5.0 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容至刻度，使HSA與DQX-1的濃度比為0～10。測試條件：280 nm的激發(fā)波長，5 nm的狹縫，在300～450 nm 范圍內(nèi)測定HSA的熒光光譜。

1.2.2 紫外吸收光譜測定探針與HSA相互作用 用刻度移液管分別移取準確量的HSA溶液和探針溶液到5.0 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容至刻度，使HSA與DQX-1的濃度比為0～10。并且以二次蒸餾水作為空白能比，測定體系在200～450 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外吸收光譜

圖2是HSA在不同濃度DXQ-1存在下的紫外-可見吸收光譜圖。

圖2 不同探針DQX-1濃度條件下的HSA紫外-可見吸收光譜Fig.2 The absorbance spectra of HSA with the different concentration of DQX-1

由圖2可知，HSA在大約280 nm處有吸收峰。在280 nm處的吸收峰是由HSA中芳香族氨基酸產(chǎn)生的，隨著加入HSA溶液中的探針DQX-1濃度的增加，HSA在280 nm處的特征吸收強度逐漸增大，特征吸收光譜發(fā)生藍移。結(jié)果表明，HSA與探針DQX-1結(jié)合后，改變了HSA的芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境極性[4]。

2.2 熒光光譜

不同探針濃度條件下HSA的熒光光譜見圖3。

圖3 不同探針DQX-1濃度條件下HSA的熒光光譜Fig.3 The fluorescence spectra of HSA with the different concentration of DQX-1

由圖3可知，隨加入探針DQX-1濃度的逐漸增加，HSA的熒光強度會逐步的降低，并且最大發(fā)射波長從334 nm藍移到330 nm，表明DQX-1的加入不僅使HSA的熒光猝滅，同時也導(dǎo)致熒光生色團色氨酸以及酪氨酸所處的環(huán)境疏水性增加[5]。從計算得到的DQX-1與HAS之間的猝滅常數(shù)(Kq)均為1012數(shù)量級左右，遠大于2×1010L/(mol·s)的最大動態(tài)熒光猝滅常數(shù)，同時結(jié)合二者之間的紫外吸收光譜圖(圖2)，進一步表明二者之間的熒光猝滅作用為靜態(tài)猝滅[6]。

2.3 探針與HSA的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點數(shù)

對于靜態(tài)猝滅，如果生物分子中有相似且獨立的結(jié)合位點，則可應(yīng)用式(1)獲得結(jié)合常數(shù)以及結(jié)合位點數(shù)[7]。

(1)

其中，n為結(jié)合位點數(shù)，可由熒光數(shù)據(jù)根據(jù)式(1)作圖得到。計算得到的K和n的值見表1。

表1 不同溫度下DQX-1與HSA的相互作用參數(shù)Table 1 The interaction parameters of DQX-1 with HSA at different temperatures

由表1可知，結(jié)合位點數(shù)n大約為1，表明每個HSA分子能夠結(jié)合一個探針DQX-1分子。隨著溫度的增加，K和n值逐漸下降。

2.4 熱力學(xué)分析和結(jié)合力類型的確定

生物大分子與有機物小分子之間的作用類型可歸納為四種類型，氫鍵、范德華力、靜電引力及疏水作用力。根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔH和熵變ΔS結(jié)果，就可得到有機物小分子與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型。判斷根據(jù)為：①若ΔS<0、H<0是氫鍵和范德華力；②若ΔS>0、H>0是疏水作用力； ③若ΔS>0、H<0是靜電引力。如果焓變(ΔH)在所研究溫度范圍內(nèi)變化很小，該反應(yīng)的焓變是一個常數(shù)。熵變值(ΔS)和焓變值(ΔH)可以通過Van’tHoff等式進行計算：

(2)

ΔG=ΔH-TΔS

(3)

由表1可知，ΔH<0，ΔS<0，所以主要是氫鍵和范德華力占主導(dǎo)作用[8]，由表中的數(shù)據(jù)可得ΔG<0，說明結(jié)合反應(yīng)可自發(fā)進行。

2.5 探針DQX-1與HSA之間的結(jié)合距離

探針DQX-1在蛋白質(zhì)上的結(jié)合距離可以根據(jù)F?rster的非輻射共振能量轉(zhuǎn)移理論計算出，并且也能計算出能量轉(zhuǎn)移效率E，結(jié)合距離不僅僅與藥物受體和蛋白質(zhì)供體的距離有關(guān)，還與能量轉(zhuǎn)移的臨界距離(R0)有關(guān)。能量轉(zhuǎn)移效率(E)計算公式如下：

(4)

其中，R0為50%轉(zhuǎn)移效率的臨界距離，r為蛋白質(zhì)和有機小分子間的距離。R0可通過以下關(guān)系式計算得：

(5)

其中，K2為偶極子空間定位因子，取值為2/3；n為介質(zhì)的折射指數(shù)，取1.36；ΦD為供體的熒光量子產(chǎn)量，取值為0.15；J為蛋白質(zhì)發(fā)射光譜和有機小分子吸收光譜之間的光譜重疊部分的積分值。如圖6所示，可通過下式積分得到：

(6)

其中，F(xiàn)(λ)為在波長λ處蛋白質(zhì)分子的熒光強度；ε(λ)為波長為λ時有機小分子的摩爾吸收系數(shù)。

根據(jù)圖4，由計算求得如下參數(shù)：J=6.267 5×10-14cm3·L/mol，R0=3.42 nm和r=5.42 nm。很明顯HSA與探針DQX-1-1的距離(r)遠<8 nm，并且符合0.5R0

圖4 HSA的熒光發(fā)射光譜與探針DQX-1的吸收光譜Fig.4 The fluorescence spectra of HSA and absorption spectra of DQX-1

2.6 探針對HSA構(gòu)象的影響

2.6.1 同步熒光光譜研究 圖5分別為測得的HSA中酪氨酸基團、色氨酸基團的同步熒光光譜。

圖5 不同DQX-1濃度條件下 HSA的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectrum of HSA with different concentration of DQX-1

由圖5可知，加入DQX-1后，二者的熒光均下降，但是色氨酸基團的熒光強度下降得比較明顯并且發(fā)生了輕微的藍移。實驗證明，DQX-1與HSA 作用后，降低了HSA的疏水性、增加了HAS的極性，改變了二級結(jié)構(gòu)[9]。

2.6.2 三維熒光光譜 三維熒光光譜技術(shù)近年來已經(jīng)成為一種常用的熒光分析技術(shù)，可以為研究HSA的構(gòu)象變化提供詳細的信息[10]。圖6為HSA加入DQX-1前后的三維熒光光譜。

由圖6可知，HSA的熒光強度下降，最大發(fā)射波長發(fā)生藍移。因此可得，DXQ-1的加入會引起HSA結(jié)構(gòu)的輕微構(gòu)象變化。

圖6 探針DQX-1對HSA三維熒光光譜的影響Fig.6 The effect of DQX-1 on the three-dimensional fluorescence spectrum of HSA

3 結(jié)論

本文研究了銅離子探針DQX-1與HSA之間相互作用的熒光光譜、紫外吸收光譜。并且DQX-1對HSA產(chǎn)生了明顯的熒光猝滅效應(yīng)，由猝滅機理推斷為靜態(tài)猝滅。通過熒光光譜，可以計算得到不同溫度下二者的結(jié)合常數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)、作用力類型。由三維熒光光譜以及紫外吸收光譜可以看出，DQX-1的加入可以使HSA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。