龍腦樟Actin基因的克隆與序列分析

張君誠(chéng)，許曉穎鄒函卓，楊 琳

(1.天然藥物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心，福建 三明365004 2.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州350001)

龍腦樟(Cirmamonun camphora)是樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)亞熱帶闊葉林植物，富含右旋龍腦，龍腦又稱為天然冰片，是藥材和高級(jí)香料[1]，在化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，目前主要分布于江西吉安、湖南新晃等部分地區(qū)[2]。 近年來，以龍腦樟萜類有效成分合成相關(guān)的關(guān)鍵基因逐漸被挖掘，對(duì)挖掘的這些基因進(jìn)行熒光定量分析，有助于闡明這些基因的功能，以及與萜類成分積累的關(guān)系。

Actin 又稱為肌動(dòng)蛋白，是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白。它在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)定位、細(xì)胞分裂、胞吞和胞吐作用、細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、共生現(xiàn)象、細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)以及膜的循環(huán)利用中發(fā)揮著重要的作用[3-9]。 研究表明，Actin 基因基因編碼一類高度保守的蛋白，在植物的各器官、細(xì)胞和組織中的表達(dá)量相對(duì)比較恒定[10-12]，因此也經(jīng)常作為熒光定量分析的內(nèi)參基因參。Yan 和Shi 首次從高等植物中克隆得到 Actin 基因后[13]，研究人員從火龍果[14]、木薯[15]、芍藥[16]、茶樹[17]、蕙蘭[18]、玉蘭[19]、水稻等植物中克隆出該基因。然而龍腦樟Actin 基因的研究尚未見報(bào)道。本研究設(shè)計(jì)特異性引物，利用同源克隆的方法克隆出龍腦樟Actin 基因片段， 為Actin 基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行龍腦樟相關(guān)功能基因的表達(dá)差異研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

來自江西吉安移栽至三明種植一至二年生的龍腦樟葉片。

1.2 儀器和試劑

梯度 PCR 擴(kuò)增儀（Eppendorf 5331 型）、試驗(yàn)所用 OmniPlant RNA Kit 試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Es Taq MasterMix （含 Es Taq DNA Polymetase、2×Es Taq PCR Buffer、3 mM MgCl、400 μM dNTP mix、染料）、快速瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，上述試劑盒均來源于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，其余試劑采用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 龍腦樟葉片總RNA提取及cDNA的合成

龍腦樟葉片總RNA 的提取方法采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司OmniPlant RNA Kit 試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取的總RNA 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用cDNA 合成試劑盒（HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒）對(duì)龍腦樟葉片總RNA 進(jìn)行cDNA 的合成。 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，合成的cDNA 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 龍腦樟Actin基因克隆

根據(jù)NCBI 上已發(fā)表的香樟Actin(ACTc)基因（GenBank：KM086738.1）核苷酸序列的特異區(qū)域，利用 Primer5.0 軟件設(shè)計(jì) PCR 特異引物， 序列分別為 5'-TGTTCTGGACTCGGGTGA-3' / 5'-ATGGATTCCTGCTGCTTC-3'。 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性 94 ℃，5 min；變性 94 ℃，30 s，退火 52 ℃，30 s，延伸 72 ℃，1 min，共 30 個(gè)循環(huán)；終延伸 72 ℃，10 min。 1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物。

1.5 序列分析

在NCBI 中通過BLAST/P 對(duì)已得到的龍腦樟核苷酸序列片段以及推導(dǎo)的氨基酸序列的理化性質(zhì)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)。并與GenBank 中下載香樟、山雞椒、白玉蘭、鱷梨等植物的Actin 基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍腦樟Actin基因擴(kuò)增

RNA 電泳結(jié)果（見圖1A）表明，28S 和 18S 條帶清晰，且 28S 的 RNA 條帶亮度約為18S 的 RNA條帶亮度的2 倍，說明提取的RNA 完整性良好，可用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄成cDNA 結(jié)果顯示，合成的cDNA 在1000 至100 bp 之間呈彌散狀分布，說明反轉(zhuǎn)錄的效果較好，可以用于后續(xù)龍腦樟Actin 基因的克隆試驗(yàn)（見圖1B）。根據(jù)同源擴(kuò)增設(shè)計(jì)的特異引物，以總RNA 逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分離出特異片段，片段大小在250 與500 bp 之間（圖片1C）。

圖1 龍腦樟Actin 基因片段的擴(kuò)增

2.2 龍腦樟Actin基因序列

對(duì)特異片段的序列分析結(jié)果， 獲得龍腦樟333 bp 的Actin 基因序列。 利用DNAMAN 對(duì)龍腦樟Actin 基因片段的核苷酸序列進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)， 該序列編碼110 個(gè)氨基酸 （如圖2A）。 龍腦樟Actin 基因推導(dǎo)蛋白的分子量12.37 kDa，等電點(diǎn)Ph 5.03，總平均疏水性指數(shù)（Grand average hydropathicity， GRAVY）-0.312 （小于 0）。 二級(jí)結(jié)構(gòu)中 α 螺旋、β 片層和無規(guī)則卷曲的比例分別為 40.04%、10.09%和45.87%。 龍腦樟Actin 基因推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖2B 所示。

圖2 龍腦樟Actin 基因推導(dǎo)的氨基酸序列及預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3 龍腦樟Actin蛋白多序列比對(duì)

利用DNAMAN 將本研究的龍腦樟Actin 基因片段及推定蛋白與特定序列進(jìn)行多序列比對(duì)。 龍腦樟Actin 基因推定的氨基酸序列與擬南芥、香樟、山雞椒、白玉蘭、玉米、水稻、鱷梨、胡楊的相似性均在 85%以上， 其中與山雞椒 （GenBank 登錄號(hào) KF706373.1) 和香樟 Actin 基因 （GenBank 登錄號(hào)KM086738.1）相似度都高達(dá) 93%（圖3）。

圖3 龍腦樟Actin 蛋白的多序列比對(duì)

2.4 龍腦樟Actin蛋白發(fā)生關(guān)系樹分析

11 種植物Actin 蛋白的進(jìn)化樹分析表明， 龍腦樟與香樟、山雞椒的Actin 蛋白具有較高的同源性（圖4）。

圖4 11 種植物推導(dǎo)Actin 蛋白的進(jìn)化樹

3 討論

Actin 基因是一種起源比較早的基因，研究表明，Actin 基因的核苷酸序列在高等植物中是相當(dāng)保守的， 并且在哺乳動(dòng)物和植物之間大約有90%的相似性[20]。Actin 基因家族是植物表達(dá)研究中使用次數(shù)最多的管家基因。 本研究通過同源克隆的方法，得到龍腦樟333 bp 長(zhǎng)度的Actin 基因片段。該片段編碼110 個(gè)氨基酸， 蛋白分子量為12.37 ku， 理論等電點(diǎn)為5.03，平均疏水性（GRAVY）為-0.312，α 螺旋、β 片層和無規(guī)則卷曲的比例分別為40.04 %、10.09%和45.87%。同源比對(duì)和進(jìn)化樹分析結(jié)果都表明，龍腦樟與香樟、山雞椒的親緣關(guān)系最近，聚為一支；與木蘭科的白玉蘭、樟科的鱷梨、楊柳科的胡楊的親緣關(guān)系次之。該基因的進(jìn)化關(guān)系符合真實(shí)物種間的進(jìn)化順序。 龍腦樟Actin 基因序列的克隆，不僅為研究龍腦樟及其近源物種的系統(tǒng)發(fā)生提供參考，也為后續(xù)的量化基因表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。