竹節(jié)參總皂苷改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠睪丸生殖功能障礙

馬瓊艷，張長城，楊思琪，尤 旭，楊 圓，張 艷，葉 勇，袁 丁，趙海霞

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

隨著經(jīng)濟(jì)、社會不斷發(fā)展和人們物質(zhì)生活水平的不斷提升，高脂肪、高熱量、低膳食纖維的飲食結(jié)構(gòu)成為人們主要的飲食結(jié)構(gòu)。大量研究顯示，長期高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖與代謝綜合征、心血管疾病和不育癥等諸多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-2]，肥胖問題已成為一個(gè)全球性的健康問題。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與正常體質(zhì)量男性相比，肥胖男性精液質(zhì)量下降，主要表現(xiàn)在精子濃度、活力下降，精子數(shù)量減少，精子DNA損傷增加[3]。而在高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中，性激素水平下降，睪丸組織內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA水平明顯升高，生精小管結(jié)構(gòu)破壞，血睪屏障受損，小鼠生育能力下降[4]。因此，抑制睪丸炎癥反應(yīng)，減輕生精細(xì)胞凋亡，是改善肥胖所致男性生殖功能障礙的重要措施之一。

竹節(jié)參為我國傳統(tǒng)補(bǔ)虛中藥，系五加科人參屬植物竹節(jié)參的干燥根莖，竹節(jié)參總皂苷(saponins ofPanaxJaponicus，SPJ)為其主要的活性成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，SPJ具有良好的抗炎活性。研究顯示，SPJ可明顯降低脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中炎癥因子TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)水平，并且抑制NF-κB p65蛋白表達(dá)水平[5]；可通過降低炎癥因子TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)水平，減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的凋亡[6]。此外，SPJ還可改善衰老所致大鼠睪丸生殖功能障礙，其機(jī)制與抑制生殖細(xì)胞的DNA損傷和凋亡有關(guān)[7]。而SPJ是否可改善高脂飲食誘導(dǎo)小鼠生殖功能障礙，其機(jī)制是否與抑制小鼠睪丸炎癥相關(guān)，尚未有相關(guān)研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)從調(diào)節(jié)睪丸炎癥的角度，探討SPJ改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖導(dǎo)致生殖功能障礙的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級♂BALB/c小鼠40只，體質(zhì)量(16～18) g，4～6周齡，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：(SCXK)(鄂)2017-0012，購置并飼養(yǎng)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，飼料按每日每只4 g給予，自由飲水。高脂飼料(編號：H10060)，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，飼料配比如下：按照蛋白質(zhì)20%、碳水化合物20%、脂肪60%壓制而成，并進(jìn)行輻照滅菌處理。

1.2 藥物與試劑于湖北恩施竹節(jié)參種植基地購買竹節(jié)參藥材，經(jīng)湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄒坤教授鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參。SPJ的制備據(jù)課題組對竹節(jié)參的前期研究，取干燥竹節(jié)參藥材粉末，利用醇提取法進(jìn)行分離和純化，提取率為18.4%，純度為83.48%。兔單抗β-actin(貨號：4970L)、兔多抗p-NF-κB(貨號：#3031)，均購自美國Cell Signaling Technology公司；鼠單抗TNF-α(貨號：sc-52746)，美國Santa Cruz公司；兔多抗IL-1β(貨號：ab9722)、鼠單抗F4/80(貨號：ab6640)，美國Abcam公司；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗，武漢科瑞生物有限公司；Alexa Fluor594驢抗小鼠IgG(H+L)(貨號：127802)，美國Jackson Immuno Research公司；ECL顯影液，武漢谷歌生物科技公司；TUNEL試劑盒(貨號：10768100)，德國Roche公司。

1.3 儀器Power Pas Basic200 Western blot電泳儀(美國Bio-Rad公司)；A1R+激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)；IX53倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；TP 102自動(dòng)脫水機(jī)、EG 1150C超薄切片機(jī)、EG 1150H石蠟包埋機(jī)(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理40只♂BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，即正常對照組(Control)、高脂模型組(Model)、SPJ低、高劑量組(15、45 mg·kg-1)。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，其他3組給予高脂飼料喂養(yǎng)；SPJ各劑量組小鼠灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，而正常對照組和高脂模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)給藥4個(gè)月。

睪丸和附睪指數(shù)測定：小鼠睪丸和附睪組織于低溫環(huán)境中取材，濾紙吸干殘余液體，電子天平稱重并記錄。先計(jì)算雙側(cè)睪丸和附睪平均質(zhì)量，后計(jì)算睪丸和附睪指數(shù)。計(jì)算公式如下所示：睪丸指數(shù)(mg·g-1)=睪丸質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)；附睪指數(shù)(mg·g-1)=附睪質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

2.2 HE染色檢測小鼠睪丸組織形態(tài)給藥4個(gè)月后眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，取單側(cè)睪丸，扎破兩端白膜置于4%多聚甲醛中，4 ℃固定24 h。睪丸組織經(jīng)TP 1020自動(dòng)脫水機(jī)脫水，脫水完成后進(jìn)行石蠟包埋，EG 1150C超薄切片機(jī)上進(jìn)行超薄石蠟切片。將組織切片置于60 ℃烘箱內(nèi)烤片3～5 h，經(jīng)透明、脫蠟、HE染色、封片等處理后，各組小鼠睪丸組織形態(tài)于光鏡下觀察，并在同等條件下取圖。

2.3 TUNEL檢測小鼠生精細(xì)胞凋亡將睪丸組織石蠟切片于二甲苯內(nèi)透明后，置于不同濃度的乙醇中脫蠟后，按照TUNEL試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。切片經(jīng)中性樹膠封片后，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠睪丸組織生精細(xì)胞，凋亡生精細(xì)胞的細(xì)胞核被染為棕黃色。

2.4 小鼠精子存活率及精子數(shù)量的分析精子存活率：將小鼠雙側(cè)附睪于生理鹽水中剪碎，置于37 ℃溫育3 min，待精子從附睪中游離出來。采用伊紅Y染色法檢測精子存活率，用生理鹽水將伊紅Y配制成濃度為5 g·L-1的溶液。取20 μL新鮮精液與10 μL伊紅Y溶液混勻后，取10 μL溶液滴加于載玻片上并覆以蓋玻片，待溶液均勻分布于載玻片后，直接置于×400光鏡下觀察，死精子被染液染色，活精子透亮不被著色，計(jì)數(shù)視野內(nèi)存活的精子個(gè)數(shù)。每只小鼠取15個(gè)隨機(jī)視野，共計(jì)200個(gè)精子，計(jì)算精子存活率，公式如下：精子存活率=活精子總數(shù)/精子總數(shù)×100%。

精子數(shù)量：將小鼠精子原液經(jīng)生理鹽水10倍稀釋后，取1滴精子懸液滴于血球計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，×40光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行精子計(jì)數(shù)，計(jì)算4個(gè)象限內(nèi)精子數(shù)量，取平均值，即為稀釋后小鼠精液中精子數(shù)量。

2.5 Western blot檢測小鼠睪丸組織內(nèi)p-NF-κB及下游炎癥因子蛋白表達(dá)水平Western blot檢測小鼠睪丸組織中p-NF-κB、TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)水平，稱取20～30 mg的睪丸組織，按RIPA裂解液∶PMSF=100∶1的比例提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測所提蛋白的濃度，取100 μL蛋白提取液，加入25 μL蛋白上樣緩沖液混勻，置于沸水浴中加熱變性10 min后，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，然后一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h，超敏ECL顯影液進(jìn)行顯影，Image Pro Plus軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白條帶與內(nèi)參照的灰度比值，每組實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3次。

Tab 1 Effects of SPJ on body mass, weight and index of testis and epididymis in mice induced by high-fat diet

2.6 免疫熒光法檢測睪丸組織內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量取睪丸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟，高壓修復(fù)10 min，冷卻5 h；5% BSA封閉組織，室溫孵育60 min；F4/80由0.3% Triton X-100稀釋后，4 ℃孵育過夜；復(fù)溫30 min后，避光孵育熒光二抗60 min；細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色10 min后，經(jīng)抗熒光淬滅劑封片后，樣本的定位和表達(dá)于共聚焦顯微鏡下觀察，隨機(jī)取×200鏡下5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野下巨噬細(xì)胞數(shù)量，取均值。

3 結(jié)果

3.1 SPJ對高脂飲食小鼠體質(zhì)量、睪丸和附睪質(zhì)量及其指數(shù)的影響如Tab 1所示，高脂模型組小鼠體質(zhì)量與正常對照組比較明顯升高，而SPJ可明顯降低小鼠體質(zhì)量；高脂模型組小鼠睪丸和附睪質(zhì)量及其指數(shù)較正常對照組明顯降低，而SPJ可明顯升高小鼠睪丸和附睪質(zhì)量及其指數(shù)。

3.2 SPJ對高脂飲食小鼠精子存活率及精子數(shù)量的影響Tab 2結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高脂模型組小鼠精子存活率和精子數(shù)量明顯減少；而SPJ干預(yù)后可提高小鼠精子存活率及精子數(shù)量。

Tab 2 Effects of SPJ on sperm viability and sperm count in mice induced by high-fat diet

3.3 SPJ對高脂飲食小鼠睪丸組織形態(tài)的影響Fig 1的HE結(jié)果顯示，正常對照組小鼠睪丸生精小管之間連接緊密，各級生精細(xì)胞排列整齊、連接緊密；而高脂模型組小鼠睪丸各生精小管間連接疏松，生精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞間連接疏松、排列紊亂，生精細(xì)胞層數(shù)減少，部分生精細(xì)胞脫落；與高脂模型組相比，SPJ可明顯改善睪丸生精小管的結(jié)構(gòu)，使各級生精細(xì)胞間層數(shù)和數(shù)目增加、連接緊密、排列整齊。

3.4 SPJ對高脂飲食小鼠睪丸組織中生精細(xì)胞凋亡的影響如Fig 2所示，與正常對照組相比，高脂模型組中各級生精細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加；而SPJ可明顯改善各級生精細(xì)胞的凋亡。

Fig 1 Effects of SPJ on morphology of testicular in testicular tissues of mice induced by high-fat diet

Fig 2 Effects of SPJ on germ cell apoptosis in testicular tissues of mice induced by high-fat diet (×400)

3.5 SPJ對高脂飲食小鼠睪丸組織中p-NF-κB、TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，與正常對照組小鼠睪丸組織相比，高脂模型組中p-NF-κB、TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高；與高脂模型組相比，SPJ低、高劑量組p-NF-κB、TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。

Fig 3 Effects of SPJ on expression levels of p-NF-κB,TNF-α, IL-1β in testicular tissues of mice induced by high-fat diet

3.6 SPJ對高脂飲食小鼠睪丸組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響F4/80是小鼠巨噬細(xì)胞特異性的標(biāo)記物，本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光法檢測高脂飲食對小鼠睪丸組織內(nèi)睪丸巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響及SPJ的干預(yù)作用。如Fig 4所示，與正常對照組相比，高脂模型組睪丸組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，而SPJ可明顯下調(diào)睪丸巨噬細(xì)胞數(shù)量。

4 討論

隨著物質(zhì)生活水平的不斷提高，高脂飲食成為人們的主要飲食譜，長期高脂飲食可能導(dǎo)致肥胖。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肥胖男性的精液濃度及精子數(shù)量均低于正常男性[3]；而男性少精子癥和無精子癥的患病率增加與男性肥胖密切相關(guān)[8]。在高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型中，小鼠睪丸生精小管內(nèi)生精細(xì)胞連接疏松、凋亡增加[4]；氟化鈉誘導(dǎo)的大鼠睪丸炎癥模型中，生精細(xì)胞凋亡增加[9]。芹菜素可通過減輕丙烯腈誘導(dǎo)的大鼠睪丸炎癥，來減輕生殖細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，SPJ可通過改善高脂飲食小鼠精液質(zhì)量，減輕生精細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而改善高脂飲食小鼠睪丸生殖功能障礙。

大量研究表明，高脂飲食可誘導(dǎo)機(jī)體的慢性炎癥反應(yīng)，而炎癥與男性生殖功能障礙密切相關(guān)[11-12]。NF-κB為炎癥反應(yīng)重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過轉(zhuǎn)錄激活下游TNF-α、IL-1β等炎癥因子，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮通過下調(diào)NF-κB、TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá)，減輕衰老大鼠海馬組織中的炎癥[13]。在氟化鈉誘導(dǎo)的大鼠睪丸炎癥模型中，睪丸組織內(nèi)TNF-α、IL-1β和p-NF-κB的蛋白表達(dá)水平明顯升高[9]。在自身免疫性睪丸炎的小鼠模型中，TNF-α mRNA的表達(dá)水平明顯上升，睪丸質(zhì)量減輕，生精細(xì)胞排列紊亂[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食所致睪丸生殖功能障礙與睪丸炎癥有關(guān)，而SPJ明顯下調(diào)p-NF-κB、TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，SPJ可通過抑制NF-κB通路介導(dǎo)的睪丸炎癥，從而改善高脂飲食小鼠睪丸生殖功能障礙。

睪丸巨噬細(xì)胞位于睪丸間質(zhì)內(nèi)，在睪丸炎癥的發(fā)生中起著主要作用。在肥胖誘導(dǎo)的小鼠睪丸炎癥模型中，睪丸巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增加[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，SPJ可明顯下調(diào)小鼠睪丸巨噬細(xì)胞的數(shù)量，提示SPJ可通過減輕睪丸巨噬細(xì)胞的浸潤，抑制睪丸炎癥，進(jìn)而改善高脂飲食小鼠生殖功能障礙。

綜上所述，SPJ對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠生殖功能障礙有明顯的改善作用，其機(jī)制可能與減輕巨噬細(xì)胞的浸潤，抑制NF-κB通路介導(dǎo)的睪丸炎癥有關(guān)。這為研究肥胖男性生殖功能障礙提供了新的思路，可能為臨床治療男性生殖功障礙提供新的治療藥物。

Fig 4 Effects of SPJ on numbers of testicular macrophages in testicular tissues of mice induced by high-fat diet(×200)

(致謝:本實(shí)驗(yàn)主要在三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院中藥藥理國家中醫(yī)藥管理局科研三級實(shí)驗(yàn)室和三峽大學(xué)感染與炎癥損傷研究所完成。在此感謝課題組全體老師及同學(xué)的指導(dǎo)和幫助。)