超聲波輔助提取繡球菌麥角甾醇的工藝優(yōu)化

耿雪冉，張巧毅，常明昌，孟俊龍，徐麗婧，程艷芬，王術(shù)榮

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801；2.黃土高原食用菌提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西太谷030801；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長沙410128）

麥角甾醇，也稱為麥角固醇，是維生素D2的前體，是高等真菌類特征性的甾醇[1]。近年來，對(duì)食用菌麥角甾醇的提取和生理功能的報(bào)道越來越多。WEI 等[2]用甲醇提取猴頭菇中的麥角甾醇，發(fā)現(xiàn)其能夠通過抑制NO 的產(chǎn)生、抑制細(xì)胞因子TNF-α 的釋放而發(fā)揮抗炎癥的功效。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，食用菌麥角甾醇（牛樟芝[3]、靈芝[4]、樺褐孔菌[5]、冬蟲夏草[6]、虎奶菇[7]、黑虎掌[8]等）的抗炎癥作用機(jī)制基本上都是抑制NO 的產(chǎn)生和減少細(xì)胞因子的釋放[9]。HU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，榆黃蘑子實(shí)體中提取的麥角甾醇能顯著降低高血脂大鼠血清膽固醇水平，并且有抗氧化作用。食用菌麥角甾醇還有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、利尿等生理功能[11-12]。

繡球菌（Sparassis crispa）是擔(dān)子菌門傘菌綱非褶孔菌目繡球菌科繡球菌屬的一種食藥用大型真菌，因其獨(dú)特的口感和高含量的功能性β- 葡聚糖（β-1，3 葡聚糖）而被人們廣泛關(guān)注[13]。繡球菌富含多種具有藥理活性的物質(zhì)，如酚類物質(zhì)、多酚、類黃酮、萜類物質(zhì)、甾醇類物質(zhì)、活性多糖等。這些生理活性物質(zhì)經(jīng)現(xiàn)代藥理研究表明，賦予繡球菌抗腫瘤、抗血管生成、防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、抗菌、抗病毒、降血壓、降血糖和抗過敏等藥用作用[14-20]。常見的麥角甾醇檢測(cè)方法有UV 法、各種類型的高效液相色譜儀法、多波長法等，高效液相色譜法對(duì)儀器、實(shí)驗(yàn)員技能的要求高。目前，食用菌中麥角甾醇的提取方法大多比較繁瑣，采用超聲波提取的方法相對(duì)簡便，耗時(shí)短，而且提取率有保障。

本研究建立了一種采用UV 法快速檢測(cè)繡球菌麥角甾醇含量的簡便方法，并進(jìn)行了優(yōu)化，為繡球菌進(jìn)一步開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

供試?yán)C球菌由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。

麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品購自北京索來寶科技有限公司，甲醇色譜純。其他未特殊說明試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 繡球菌麥角甾醇的提取方法 將新鮮采集的繡球菌去其根部約1.5 cm，冷凍干燥之后用粉碎機(jī)粉碎過篩，密封袋密封，4 ℃遮光保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述子實(shí)體粉末1 g，用提取劑浸提，超聲波振蕩提取，抽濾，將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用三氯甲烷溶解后，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，上清即為繡球菌麥角甾醇提取液。

1.2.2 麥角甾醇檢測(cè)方法的建立

1.2.2.1 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱量0.1 g麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，用三氯甲烷溶解，定容至100 mL，得麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品母液，其質(zhì)量濃度為100 μg/mL。用配制的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品母液制備一系列質(zhì)量濃度梯度為5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液于-20 ℃避光保存。

將麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品分別在271，280.08，282，292 nm 處檢測(cè)吸光值。在最適吸光值處檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以麥角甾醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 精密度試驗(yàn) 取待測(cè)樣品溶液，于292 nm波長下重復(fù)測(cè)定5 次，記錄結(jié)果，判斷該方法和該紫外分光光度計(jì)的精密度。

1.2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取待測(cè)樣品溶液，分別在0，2，5，9，15，24 h 于292 nm 檢測(cè)，驗(yàn)證該提取液在一天之內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5 份1 g 的繡球菌粉末，按照1.2.1 的方法制備繡球菌麥角甾醇提取液，用該方法檢測(cè)麥角甾醇的提取率，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

1.2.3 繡球菌麥角甾醇提取單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 提取劑的確定 準(zhǔn)確稱取1 g 繡球菌粉末，分別用25 mL 的甲醇、丙酮、乙酸乙酯和三氯甲烷4 種提取劑采用超聲波振動(dòng)抽提60 min，抽濾，將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用三氯甲烷溶解后12 000 r/min，4 ℃離心10 min，檢測(cè)不同提取劑麥角甾醇的含量，以確定最佳的提取劑。

1.2.3.2 超聲波振動(dòng)時(shí)間的確定 準(zhǔn)確稱取繡球菌粉末1 g，用25 mL 三氯甲烷提取，分別用超聲波振動(dòng)20，40，60，80，100，120 min，抽濾后12 000 r/min，4 ℃離心10 min，測(cè)定不同超聲波振動(dòng)時(shí)間麥角甾醇的含量，以確定最佳超聲波振動(dòng)時(shí)間。

1.2.3.3 料液比的確定 準(zhǔn)確稱取繡球菌粉末1 g，分別用5，10，15，20，25 mL 三氯甲烷提取，超聲波振動(dòng)60 min，抽濾后12 000 r/min，4 ℃離心10 min，測(cè)定不同料液比麥角甾醇的含量，以確定最佳料液比。

1.2.4 繡球菌麥角甾醇提取工藝的優(yōu)化 在提取劑、超聲波振動(dòng)時(shí)間和料液比3 個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取3 個(gè)適宜的水平，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，以確定最佳的提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥角甾醇檢測(cè)方法的建立

2.1.1 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 麥角甾醇在紫外線波長范圍內(nèi)271，280.8，282，292 nm 處都能檢測(cè)到明顯的吸收峰。本試驗(yàn)所用的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，在292 nm 處的吸光值為0.437，與282 nm 處的吸光值0.475 相差不大（表1）。雖然在282 nm 處顯示最高吸收峰，但是由于本試驗(yàn)所用的繡球菌粉末在282 nm 處有雜質(zhì)的干擾，而在292 nm 處雜質(zhì)的干擾較小，因此，本試驗(yàn)采用292 nm 為麥角甾醇的最佳檢測(cè)波長。

表1 幾種檢測(cè)波長的比較

將一系列濃度梯度為5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μg/mL 的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液分別在292 nm處檢測(cè)吸光值，以麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。在線性范圍5.00～50.00 μg/mL 內(nèi)，得到線性回歸方程y＝0.027x＋0.013 5（R2＝0.994 5）。說明在一定的數(shù)值范疇內(nèi)，麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與吸光值呈線性關(guān)系。

2.1.2 UV 檢測(cè)方法的精密度 在精密度試驗(yàn)中，待測(cè)樣品于292 nm 波長下重復(fù)測(cè)定5 次的吸光值分別為0.361，0.360，0.362，0.359 和0.361，對(duì)應(yīng)的麥角甾醇含量分別為2.610，2.601，2.619，2.592，2.610 μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n＝5）為0.01%（表2），說明該紫外分光光度計(jì)的精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 UV 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性 將待測(cè)繡球菌麥角甾醇提取液分別在0，2，5，9，15，24 h 于292 nm 處檢測(cè)其吸光值（表3），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06%，證明繡球菌麥角甾醇提取液在一天之內(nèi)用該方法測(cè)定的結(jié)果穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.1.4 UV 檢測(cè)方法的重復(fù)性 按照1.2.2.4 的方法進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，測(cè)得麥角甾醇的平均含量為2.553 mg/g（表4），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.11%，證明采用該方法測(cè)定繡球菌麥角甾醇含量的重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 提取劑的確定 4 種提取劑甲醇、丙酮、乙酸乙酯和三氯甲烷提取繡球菌麥角甾醇的含量列于表5。由表5 可知，三氯甲烷提取效果最好，其次是丙酮和甲醇，乙酸乙酯的提取效果最差。最終確定繡球菌麥角甾醇的最佳提取劑為三氯甲烷。甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、丙酮等有機(jī)溶劑都可以用來提取麥角甾醇。食用菌種類不同，麥角甾醇的最佳提取劑也不同。劉京晶等[21]在測(cè)定靈芝子實(shí)體中麥角甾醇含量時(shí)采用乙醇作為提取溶劑。無水乙醇也是采用超聲波輔助法提取金針菇中麥角甾醇的最佳提取溶劑[22]。然而，栗銘鴻等[23]在雞樅菌不同溶劑提取物成分分析及抗氧化作用研究中發(fā)現(xiàn)，甲醇對(duì)雞樅菌麥角甾醇的提取率最高。在本研究中，三氯甲烷是采用超聲波輔助法提取繡球菌麥角甾醇的最佳提取劑。

表5 不同溶劑提取麥角甾醇吸光值的比較

2.2.2 超聲波處理時(shí)間的確定 在不同的超聲波振動(dòng)時(shí)間（20，40，60，80，100，120 min）提取得到的繡球菌麥角甾醇的含量各不相同（表6）。隨著超聲波振動(dòng)處理時(shí)間的加長，麥角甾醇的提取率處于緩慢上升的狀態(tài)，于60，80，100 min 處，每毫升所含的麥角甾醇量較高，各水平之間差異不明顯。因此，確定超聲波處理時(shí)間為60，80，100 min。

2.2.3 料液比的確定 以三氯甲烷作為提取劑，超聲波振動(dòng)時(shí)間為60 min 的條件下，使用不同的料液比提取繡球菌的麥角甾醇（表7）。當(dāng)三氯甲烷體積由5 mL 增加到15 mL 時(shí)，甾醇提取量之間有較大差異。當(dāng)三氯甲烷體積為15 mL 時(shí)，提取得到的麥角甾醇量最多。因此，當(dāng)繡球菌粉末為1 g 時(shí)，確定三氯甲烷的最佳提取體積為15 mL。

表6 不同振動(dòng)時(shí)間提取麥角甾醇吸光值的比較

表7 不同浸提比提取麥角甾醇吸光度的比較

2.3 最佳提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取溶劑、料液比、超聲波提取時(shí)間作為影響繡球菌麥角甾醇提取量的因素，以3 因素3 水平進(jìn)行正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)列于表8，正交試驗(yàn)結(jié)果列于表9。

表8 正交試驗(yàn)的因素及水平

表9 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

由表9 可知，對(duì)繡球菌麥角甾醇提取量影響的因素按先后順序依次為：提取劑（A）＞超聲波提取時(shí)間（C）＞料液比（B）。正交優(yōu)化得出的最優(yōu)提取條件是：A3B3C2，即提取溶劑為三氯甲烷，料液比為1∶20（g/mL），超聲波提取時(shí)間為80 min。

3 結(jié)論與討論

食用菌營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“21 世紀(jì)的健康食品”[24]。食用菌產(chǎn)業(yè)是我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的一個(gè)重要組成部分，發(fā)展迅猛，也是一個(gè)極具發(fā)展前景的新興產(chǎn)業(yè)[25]。人們對(duì)食品的需求層次越來越高，食用菌作為副食走進(jìn)了大眾的餐桌[26]。繡球菌不僅是一種美味的食用菌，并且無論是在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)還是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的探索中，都有對(duì)繡球菌活性物質(zhì)藥理學(xué)功效的研究。然而多數(shù)學(xué)者的關(guān)注點(diǎn)都是繡球菌多糖，對(duì)繡球菌小分子物質(zhì)尤其是麥角甾醇的研究很少。麥角甾醇具有獨(dú)特的生理作用，并且在藥物開發(fā)中也被廣泛應(yīng)用。

本試驗(yàn)建立了UV 法快速檢測(cè)繡球菌麥角甾醇含量，其精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性都表現(xiàn)良好。并且采用正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化超聲波輔助提取繡球菌麥角甾醇，確定的最佳提取工藝條件為：以三氯甲烷為提取劑，料液比1∶20（g/mL），超聲波振動(dòng)提取時(shí)間80 min，此條件下得到的麥角甾醇含量最高。