吡咯伯克霍爾德菌WY6-5產二甲基二硫對儲藏期花生黃曲霉及毒素的抑制作用

宮安東，董飛燕，吳楠楠，孔憲巍，趙倩，閆建麗，Cheelo Dimuna

吡咯伯克霍爾德菌WY6-5產二甲基二硫對儲藏期花生黃曲霉及毒素的抑制作用

宮安東，董飛燕，吳楠楠，孔憲巍，趙倩，閆建麗，Cheelo Dimuna

（信陽師范學院生命科學學院/河南省茶樹生物學重點實驗室，河南信陽 464000）

【】驗證吡咯伯克霍爾德菌（）WY6-5的抑菌作用，評價其對儲藏期花生黃曲霉（）及毒素的防治效果，分析抑菌作用機制，鑒定活性物質，并檢測其最低抑菌濃度，為儲藏期真菌病害及毒素的防控提供新材料。采用非接觸培養(yǎng)皿對扣培養(yǎng)法，檢測菌株WY6-5對黃曲霉的抑制效果，添加活性炭，驗證揮發(fā)性物質的抑菌作用；密閉儲藏環(huán)境，檢測WY6-5產二甲基二硫對花生黃曲霉及毒素的抑制效果；收集處理后的花生籽粒，鋨酸固定，并進行掃描電鏡觀察，檢測黃曲霉細胞顯微結構變化，通過透射電鏡觀察，檢測黃曲霉細胞內部結構的顯微差異；購買活性物質標準品，梯度稀釋，與黃曲霉菌絲和孢子對扣培養(yǎng)，分析最低抑菌濃度。吡咯伯克霍爾德菌WY6-5分離自茶園根際土壤，可產生揮發(fā)性物質二甲基二硫，并高效抑制黃曲霉的生長，抑菌率達95%以上；同時，在高水活度（aw）條件下，WY6-5還可抑制儲藏期花生黃曲霉和毒素污染；兩種水活度下，對照組中發(fā)病率高達100%，黃曲霉毒素總含量分別為399.32 μg?kg-1（aw0.859）和3 143.19 μg?kg-1（aw0.923）；WY6-5添加組，花生黃曲霉發(fā)病率降為2%（aw0.859）與21%（aw0.923），毒素含量降為4.86 μg?kg-1（aw0.859）和121.37 μg?kg-1（aw0.923），與對照組相比，對毒素的抑制率達98.78%和96.14%。掃描電鏡觀察顯示，WY6-5產生的揮發(fā)性氣體能抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，透射電鏡顯示，黃曲霉細胞結構未呈現(xiàn)明顯損傷。揮發(fā)性物質二甲基二硫抑菌作用明顯，對黃曲霉菌絲生長的最低抑菌濃度為100 μL?L-1(物質體積/培養(yǎng)體積)，對孢子萌發(fā)的最低抑菌濃度為50 μL?L-1(物質體積/培養(yǎng)體積)。吡咯伯克霍爾德菌WY6-5可產生高效抑菌揮發(fā)物二甲基二硫，在低濃度下即可完全抑制黃曲霉菌絲生長和孢子萌發(fā)，并能抑制儲藏期花生黃曲霉的侵染和黃曲霉毒素的產生，為儲藏期真菌病害及毒素的防控提供了新型生物材料。

吡咯伯克霍爾德菌；黃曲霉；黃曲霉毒素；二甲基二硫；抑菌；儲藏期

0 引言

【研究意義】黃曲霉（）是一種常見的腐生性病原真菌，對植物危害嚴重，田間和儲藏期可侵染花生、玉米、大豆、小麥等糧、油料作物及其加工品，導致糧食霉變和黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）污染[1-2]。糧食污染中AFT主要有4種，分別為AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，其中以AFB1毒性最大，可誘發(fā)肝癌、腎癌和直腸癌等病變，被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為I類致癌物[3-4]。AFT污染在世界范圍內普遍存在，據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有50億人飽受其害[5]。在美國，AFT污染造成的糧食損失每年高達5億美元，僅玉米損失1.6億美元[6]。在經濟欠發(fā)達的發(fā)展中國家，AFT的污染更為嚴重，2014年國內各產區(qū)玉米抽樣中均檢出AFT，其中華中區(qū)域玉米樣品AFB1污染最重，AFB1檢出率達100%，超標率達85.7%（食用玉米及其制品＞20 μg?kg-1）[7]。非洲扎伊爾地區(qū)花生抽檢樣品中95%存在AFB1污染，食用精米中AFT檢出率為50%，污染量高達1 642 μg?kg-1，玉米中AFT檢出率為63%，污染量最高達850 μg?kg-1[8]。此外，在乙型和丙型病毒性肝炎病毒流行國家，AFT的疊加危害效果尤為嚴重，中國每年約有37萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的50%以上，AFT污染與病毒流行的雙重干擾是造成疾病和死亡的主要誘因[9]。黃曲霉及其產生的AFT對人類危害嚴重，如何有效控制糧、油作物及其加工品中AFT的污染是當前面臨的首要任務，對糧食穩(wěn)產和食品安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】為控制AFT的嚴重污染，部分國家出臺了食品中AFT污染的最高限量標準，如針對花生及其加工品中，歐盟規(guī)定AFT最高限量值為4 μg?kg-1[10]，美國為20 μg?kg-1[11]，肯尼亞為10 μg?kg-1[12]，馬來西亞為15 μg?kg-1[13]，中國尚無針對AFT的最高限量要求，但規(guī)定AFB1的最高限量值為20 μg?kg-1[14-15]。最高限量值法規(guī)的出臺，在一定程度上減少了AFT的暴發(fā)和危害，但無法從源頭上避免AFT的污染，如何從根本上消除黃曲霉的侵染和AFT的產生，是糧食生產、加工和儲藏過程中亟需解決的關鍵問題。目前，針對儲藏期黃曲霉及AFT的防控，主要依賴于儲藏條件控制、病籽粒去除和化學藥劑處理等方法[16]。但由于存儲周期長，儲藏條件控制造成極大的能源損耗；發(fā)病籽粒去除難以做到精細控制，遺漏的病粒又可導致二次危害；而化學藥劑的制劑噴灑，造成潛在的有害物質殘留和環(huán)境污染，現(xiàn)有方法已無法滿足人們對食品安全和綠色防控的需求，因此，開發(fā)新型、安全、有效的抑菌資源，是儲藏期病害防控的首要任務。生物活性物是生物體內固有組分，與化學藥劑相比，來源可靠，安全性高，是良好的抑菌生物材料，目前部分植物源生物活性物質已被應用于黃曲霉和AFT的防治中，如從博路都樹（）、馬鞭草科植物[17]和孜然芹屬[18]提取的植物精油，對黃曲霉生長和產毒具有顯著抑制作用，部分植物提取物已成功應用并商業(yè)化生產[19]。但受植物所需種植面積大、生長周期長、材料收集難等問題影響，一定程度上制約了其快速發(fā)展。與植物相比，微生物個體小、繁殖快、代謝物質豐富，在天然抑菌藥物篩選及應用方面優(yōu)勢顯著。已報道多種微生物及其代謝產物對黃曲霉及AFT具有抑制作用，如非產毒性黃曲霉[20]、芽孢桿菌[21]、假單胞菌等，為黃曲霉及AFT的安全防控提供了重要的微生物材料。此外，筆者課題組前期從海洋中分離到一株海藻希瓦氏菌（）YM8，可產生揮發(fā)性物質，高效抑制儲藏期花生黃曲霉的致病和產毒[14]?！颈狙芯壳腥朦c】筆者課題組從茶樹根際土壤中分離到一株吡咯伯克霍爾德菌（）WY6-5，可溶解土壤中難溶性無機磷和有機磷，提升土壤肥力，促進植物生長。同時，該菌株還可產生揮發(fā)性物質二甲基二硫，具有較好的抑菌作用，然而，針對吡咯伯克霍爾德菌及其所產二甲基二硫對儲藏期黃曲霉及AFT的抑制作用尚未有研究揭示?！緮M解決的關鍵問題】檢測吡咯伯克霍爾德菌WY6-5對黃曲霉生長的抑制作用，驗證對儲藏期花生黃曲霉及AFT的防控效果，鑒定功能抑菌物質，確定最低抑菌濃度，分析作用機理，為儲藏期真菌病害及毒素的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2016—2018年在信陽師范學院生命科學學院/河南省茶樹生物學重點實驗室完成。

1.1 供試材料

吡咯伯克霍爾德菌WY6-5分離自百年齡茶樹根際土壤，劃線培養(yǎng)于NA培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉湯3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，121℃滅菌20 min）表面，37℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h，備用。

黃曲霉菌株AF12分離自霉變的花生籽粒，為筆者實驗室保存[14]。AF12培養(yǎng)于PDA（馬鈴薯200 g，切片后沸水煮20 min，雙層紗布收集濾液，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，溶解于1 L蒸餾水中，121℃且1.01 mpa條件下，滅菌18 min后備用）培養(yǎng)基表面，28℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，無菌水洗下表面新鮮孢子，雙層無菌紗布過濾，收集濾液，待用。

所用花生籽粒為四粒紅品種，用于儲藏期接種試驗。

二甲基二硫標準品（Sigma-Aldrich，St Louis，MO），CAS：03658-80-8，純度≥98%，用于抑菌作用分析。

1.2 菌株WY6-5產揮發(fā)性物質對黃曲霉生長的抑制作用測定

WY6-5劃線培養(yǎng)于NA平板表面，培養(yǎng)24 h后，轉皿活化2—3次。無菌水沖洗活化后的WY6-5菌體，混合均勻，調整OD600至1.80，用于抑菌試驗。新鮮的黃曲霉孢子液接種于50 mL PDB培養(yǎng)液中，28℃黑暗條件下，200 r/min搖培2 d，獲取圓形白色的菌絲團，用于抑菌作用分析。

采用雙皿對扣培養(yǎng)法，檢測菌株WY6-5的抑菌效果。挑取大小一致的黃曲霉菌絲團，分別接種于PDA平板中央；WY6-5菌液涂布于NA平板表面；將接種菌絲團的培養(yǎng)皿對扣培養(yǎng)于含WY6-5的培養(yǎng)皿之上，以黃曲霉菌絲團對扣培養(yǎng)NA培養(yǎng)基的處理為對照，每個處理重復兩次，透明膠帶密封，28℃黑暗條件下靜置培養(yǎng)5 d，測量菌落直徑，計算抑菌率[22]。

抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.3 活性炭對菌株WY6-5抑菌作用的影響

WY6-5在密閉的環(huán)境條件下，可以高效抑制黃曲霉的生長，但作用機制尚未確定。為了進一步檢測WY6-5產揮發(fā)性氣體是否具有抑菌作用，進行了活性炭添加試驗。采用雙皿對扣培養(yǎng)法，上皿中為PDA培養(yǎng)基，接種新鮮的黃曲霉菌絲團；下層為二分分隔培養(yǎng)皿，分隔區(qū)域一側添加活性炭（6 g），另一側加入NA培養(yǎng)基，冷卻后涂布WY6-5菌液。下層培養(yǎng)皿設4個不同處理，分別為空白NA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基+活性炭、NA涂布WY6-5、NA涂布WY6-5+活性炭，4個處理分別與黃曲霉菌絲團密閉共培養(yǎng)，每個試驗重復兩次，透明膠帶封口，28℃黑暗條件下，靜置培養(yǎng)5 d，觀察黃曲霉菌絲生長狀況，統(tǒng)計菌落直徑。

1.4 WY6-5對儲藏期花生黃曲霉致病和產毒的抑制作用測定

稱取顆粒飽滿、大小均勻一致的花生籽粒200 g，平均分成兩份，分別倒入兩個250 mL錐形瓶中，于121℃，1.01 MPa滅菌20 min，室溫靜置冷卻；每個錐形瓶中接入新鮮收集的黃曲霉孢子液1 mL（1×105cfu/mL），搖勻10 min；向錐形瓶中加入無菌水，調整水活度（aw）為0.859和0.923，備用。

花生接種試驗分兩種水活度處理，每種水活度處理中，設WY6-5處理組和對照組；WY6-5處理組中，取兩個玻璃培養(yǎng)皿（直徑9 cm），一個皿中加入接種黃曲霉孢子的花生籽粒，另一個皿加入NA培養(yǎng)基，表面涂布WY6-5菌液，將WY6-5培養(yǎng)皿對扣培養(yǎng)于含花生籽粒的培養(yǎng)皿之上；對照組中，以空白NA培養(yǎng)基對扣培養(yǎng)于花生籽粒培養(yǎng)皿之上。所有處理用透明膠帶封口，28℃培養(yǎng)箱，黑暗條件下培養(yǎng) 7 d，檢測花生籽粒的發(fā)病率和不同處理中黃曲霉毒素含量，確定WY6-5對黃曲霉產毒的抑制作用。

AFT的提取與定量分析：稱取研磨樣品1 g，置于5 mL的聚丙烯塑料管中，加入5 mL已腈/水（84/16，v/v），混勻后渦旋處理1 min，超聲60 min。6 000 r/min離心10 min，取上清1 mL轉移至新的離心管中，加入相同體積正己烷，混勻后靜置分層。吸取下層500 μL提取液，進行毒素檢測分析[23]。AFT分析采用高效液相色譜質譜聯(lián)用儀（Thermo Scientific，加利福尼亞大學，美國）。液相色譜分析采用C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，3.0 μm填充粒徑），溫度設置為35℃。流動相為A：甲醇，B：水（超純水含5 mmol·L-1醋酸銨和0.05%甲酸，v/v）。流速為0.3 mL·min-1，梯度進樣洗脫，洗脫程序：0—1 min，20% A；1—4 min，20%—100% A；4—5 min，100% A；5—5.5 min，100%—20% A。質譜分析采用電噴霧質譜（ESI+）選擇離子監(jiān)測模式進行，最優(yōu)霧化器溫度為350℃，毛細管溫度為350℃，噴霧電壓為3.5 kv（ESI+）。

1.5 WY6-5抑制花生黃曲霉的掃描電鏡觀察

黃曲霉孢子接種于花生籽粒表面，培養(yǎng)5 d后，觀察對照組（不添加WY6-5）與WY6-5處理組花生籽粒發(fā)病情況，并進行掃描電鏡觀察。對照組與WY6-5處理組花生籽粒用0.1%（v/v）的鋨酸熏蒸 1 h，室溫靜置2 h，解剖刀切取花生小塊種皮（長約3—4 mm），固定于樣品座上，表面噴金處理后，進行掃描電鏡（型號JSM-6390，日立公司，日本）觀察，確定黃曲霉菌絲和孢子的顯微結構差異[22]。

1.6 WY6-5抑制花生黃曲霉的透射電鏡觀察

采用雙層培養(yǎng)皿對扣培養(yǎng)法，上層培養(yǎng)皿中加入PDA培養(yǎng)基，冷卻后表面覆蓋一層玻璃紙，100 μL黃曲霉孢子液（1×107cfu/mL）涂布于玻璃紙表面；下層培養(yǎng)皿中加入NA培養(yǎng)基，WY6-5涂布表面，將PDA平板對扣于NA平板上，以不涂布WY6-5菌液的NA培養(yǎng)基為對照，透明膠帶封口，28℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h，收集玻璃紙表面黃曲霉菌體，重懸于2.5%的戊二醛（v/v），固定3—4 h；0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min；1%的鋨酸室溫固定2 h；0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min；依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%乙醇脫水，每次15 min；丙酮與812包埋劑（1﹕1）混合液滲透過夜，812包埋劑滲透過夜；60℃聚合48 h；60—80 nm超薄切片；2%醋酸鈾飽和水溶液染色15 min，枸櫞酸鉛染色15 min；室溫過夜干燥，透射電鏡（Tecnai G2 F 20）觀察真菌細胞結構。

1.7 二甲基二硫對黃曲霉生長的抑制作用

WY6-5產生的揮發(fā)性物質抑菌作用顯著，經GC-MS/MS鑒定，確定抑菌物質為二甲基二硫，以購買的二甲基二硫標準品檢測其抑菌作用。采用培養(yǎng)皿對扣培養(yǎng)法，上層培養(yǎng)皿中加入PDA培養(yǎng)基，中心接種黃曲霉菌絲團，下層為空白培養(yǎng)皿，中心處放一圓形濾紙片（直徑5 mm），濾紙片上滴加二甲基二硫標準品，調整終濃度為200、100、50、10和 0 μL·L-1（物質體積/空間體積），以添加相同濃度的無菌水為對照。將接種菌絲團的培養(yǎng)皿對扣于含二甲基二硫培養(yǎng)皿之上，透明膠帶封口，28℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，測量黃曲霉菌落直徑，計算抑菌率。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，每個處理至少重復兩次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤，不同處理間進行單因素方差分析，＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 吡咯伯克霍爾德菌WY6-5對黃曲霉生長的抑制作用

對扣培養(yǎng)試驗中，菌株WY6-5可高效抑制黃曲霉的生長，培養(yǎng)5 d后，對照組中黃曲霉菌絲生長迅速，菌落直徑達5 cm以上，且菌絲表面產生大量的綠色黃曲霉孢子。添加WY6-5后，黃曲霉菌絲的生長受到明顯抑制，接種菌絲周邊無新的菌絲體產生，且不能產生新鮮的綠色孢子。結果表明，密封培養(yǎng)過程中，吡咯伯克霍爾德菌WY6-5與黃曲霉菌絲團無直接接觸情況下，可抑制黃曲霉菌絲的生長，抑菌率高達100%（圖1）。

圖1 菌株WY6-5揮發(fā)性氣體對黃曲霉的抑制作用

為證明WY6-5的抑菌作用方式，進行了活性炭添加試驗。培養(yǎng)5 d后觀察生長狀況，單獨接種黃曲霉菌絲團處理中，菌絲生長迅速，菌落直徑達5.15 cm；向反應體系中添加活性炭后，菌絲生長未見明顯變化，菌落直徑達5.12 cm，與對照組相比無顯著差異，表明活性炭對黃曲霉菌絲的生長無抑制作用；當添加WY6-5后，菌絲生長受明顯抑制，菌落直徑僅為0.85 cm，抑制率達到83.50%；當WY6-5處理組中添加活性炭后，抑菌作用明顯減弱，菌落直徑為4.50 cm，抑菌率降至12.62%，表明添加活性炭可降低WY6-5的抑菌作用（圖2）。綜上所述，活性炭作為揮發(fā)性物質吸附劑，可以吸附菌株WY6-5產生的揮發(fā)物，進而降低密閉體系中揮發(fā)性物質有效濃度，降低了對黃曲霉的抑制作用，因此，可以證明菌株WY6-5抑菌的主要作用機制為產生揮發(fā)性抑菌物。

2.2 菌株WY6-5對儲藏期花生黃曲霉及毒素的抑制作用

以花生籽粒為試驗對象，分析WY6-5產生的揮發(fā)性物質對儲藏期黃曲霉侵染的防控作用。不同水活度下，花生籽粒接種黃曲霉孢子后，共培養(yǎng)5 d。對照組花生籽粒發(fā)病嚴重，水活度0.859處理中，籽粒表面長出菌斑，表面著生綠色孢子，發(fā)病率達85%；隨水活度升高，花生籽粒發(fā)病越明顯，水活度0.923處理組中，種皮表面布滿菌絲，著生大量綠色孢子，發(fā)病率高達100%（圖3）。當添加WY6-5處理后，由于揮發(fā)性物質的高效抑菌作用，兩種水活度下，花生黃曲霉的發(fā)病受到明顯抑制，水活度0.859處理組中，僅單個籽粒呈現(xiàn)發(fā)病狀況，發(fā)病率為2%，水活度0.923處理組中，少部分籽粒呈現(xiàn)發(fā)病癥狀，表面產生孢子，發(fā)病率為21%。綜上所述，菌株WY6-5產生的揮發(fā)性抑菌物質顯著抑制儲藏期花生黃曲霉的侵染，具有較好的生防活性。

CK：黃曲霉菌絲對照A. flavus mycelia only；CK+C：菌絲+活性炭mycelia challenged with active charcoal；CK+WY6-5：菌絲+WY6-5 mycelia challenged with WY6-5；CK+WY6-5+C：菌絲+WY6-5+活性炭mycelia challenged with active charcoal and WY6-5

圖3 菌株WY6-5產揮發(fā)性氣體對儲藏期花生黃曲霉的抑制作用

分析花生籽粒中的AFT含量，結果如表1所示。對照組內兩種水活度處理，均檢出AFT，隨水活度升高，毒素污染程度也明顯提高。在水活度0.859，毒素總含量為399.32 μg?kg-1，其中AFB1毒素含量為372.29 μg?kg-1，AFB2為27.03 μg?kg-1；水活度0.923條件下，毒素總含量為3 143.19 μg?kg-1，AFB1為2 547.72 μg?kg-1，AFB2為595.47 μg?kg-1。當添加WY6-5處理后，花生籽粒發(fā)病明顯減弱，且毒素含量顯著降低，水活度0.859條件下，AFB1檢出量為4.86 μg?kg-1，未檢出AFB2，與對照組相比，抑制率為98.78%；水活度0.923條件下，AFB1檢出量為109.86 μg?kg-1，AFB2為11.50 μg?kg-1，毒素總含量為121.37 μg?kg-1，與對照組相比，抑制率為96.14%。綜上所述，WY6-5產生揮發(fā)性抑菌物質，不僅抑制了黃曲霉侵染危害，同時抑制了AFT的產生。

2.3 菌株WY6-5對花生黃曲霉抑制效果的掃描電鏡觀察

為進一步觀察花生種皮表面黃曲霉的生長狀況，挑選水活度0.859培養(yǎng)條件下的花生籽粒，進行掃描電鏡觀察。培養(yǎng)5 d后，對照組花生籽粒發(fā)病嚴重，種皮布滿黃曲霉菌絲及分生孢子頭，并產生大量分生孢子，孢子脫落后，覆蓋于花生種皮表面，造成二次侵染。形成的分生孢子為圓形，大小一致，結構均勻，表面為隆起的小球結構。WY6-5處理組中，花生種皮表面僅見少數(shù)孢子，為初始接種用黃曲霉孢子，孢子未見萌發(fā)（圖4）。由此可見，在非接觸條件下WY6-5產生揮發(fā)性物質可高效抑制密閉條件下的黃曲霉孢子萌發(fā)和菌絲生長。

箭頭指向為黃曲霉孢子 Arrows point to the position of A. flavus conidia on the peanut surface

表1 花生籽粒中黃曲霉毒素含量測定

2.4 菌株WY6-5抑制花生黃曲霉的透射電鏡觀察

WY6-5揮發(fā)性物質處理黃曲霉后，進行透射電鏡制樣觀察。結果顯示，對照組中黃曲霉菌絲生長正常，切片觀察后細胞結構有圓形、線形和腎形等不同結構，細胞質均勻致密，液泡大小均勻，細胞膜連續(xù)完整，緊貼細胞壁。WY6-5處理黃曲霉后，切片觀察細胞多為圓形，少部分細胞呈現(xiàn)中空壞死癥狀，多數(shù)細胞呈均勻致密，細胞膜完整，液泡在細胞中所占體積明顯大于對照組（圖5）。結果表明，WY6-5產生的揮發(fā)性物質可抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)和生長，故處理后細胞呈現(xiàn)圓形的孢子居多，對照組中細胞不斷生長，體積不斷變大，液泡水分消耗較多，在一定程度上，液泡體積比小于WY6-5處理組。

箭頭指向為細胞壁 Arrows point to the cell wall of A. flavus

2.5 揮發(fā)性物質二甲基二硫的最低抑菌濃度分析

與對照相比，二甲基二硫具有明顯的抑菌作用，低濃度條件下也具有高效抑制效果，10 μL?L-1（物質體積/空間體積），對黃曲霉菌絲和孢子的抑制率分別為70.2%與77.5%；隨濃度的升高，抑菌效果越顯著，50 μL?L-1時，即可完全抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，當濃度達到100 μL?L-1，對菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有完全抑制效果（圖6）。

3 討論

黃曲霉在自然界中分布廣泛，可侵染儲藏期多種糧油料作物產品及其加工品，并產生強致癌性次生代謝產物AFT，嚴重威脅人類健康。同時，由于其寄主種類多，產孢能力強，孢子擴散迅速，為儲藏期安全防控帶來巨大挑戰(zhàn)。開發(fā)安全、高效的儲藏期黃曲霉及毒素防控技術是植物病害防控和食品安全領域研究的熱點。

圖6 二甲基二硫對黃曲霉菌絲生長和孢子萌發(fā)的最低抑菌濃度

對儲藏期黃曲霉及毒素的防治研究表明，揮發(fā)性物質易于分散，對黃曲霉及毒素的抑制效果明顯優(yōu)于非揮發(fā)性物質。自然界中，微生物種類繁多，代謝類型多樣[24]，是揮發(fā)性抑菌物質篩選的優(yōu)勢資源。目前，已報道多種微生物可產生揮發(fā)性抑菌物質，能夠抑制植物病原菌的生長和繁殖，如鏈霉菌RM-1-138對立枯絲核菌（）[25]，解淀粉芽孢桿菌（）CPA-8對核果褐腐病菌（）和灰霉菌（）[26]，對尖鐮孢（）[27]，短小芽孢桿菌（）AR03對煙草黑脛病菌（）和鏈格孢菌（）[28]，以及綠針假單胞菌（subsp.）SPS-41對引起馬鈴薯黑腐病的長喙殼菌（）等[29]，均具有較好的生物抑菌活性。但針對黃曲霉而言，其產氣抑菌微生物的研究相對較少。為篩選對黃曲霉具有產氣抑制作用的微生物，鑒定抑菌活性物質，本研究從百年齡茶樹根際土壤中篩選到一株吡咯伯克霍爾德菌WY6-5，結果表明其具有較好的產氣抑菌活性。

吡咯伯克霍爾德菌屬于伯克霍爾德菌屬，在土壤中分布廣泛，具有多種生物功能，如固氮、解鉀、促生長以及防治植物病害等[30-31]。Ren等[32]研究表明，吡咯伯克霍爾德菌JK-SH007可產生3種胞外水解酶，作用于真菌細胞，對楊樹潰瘍病具有較好的防治效果；WALLACE等[33]研究指出，吡咯伯克霍爾德菌FP62具有植物葉部定殖能力，可在葉片表面形成一層不飽和的生物被膜，有效防止灰霉菌的侵染。本研究篩選的吡咯伯克霍爾德菌WY6-5可以溶解土壤中的難溶性無機磷和有機磷，轉化為可溶性磷肥，并顯著促進植物生長。同時可產生揮發(fā)性抑菌物質二甲基二硫，抑制黃曲霉的生長和產孢，并明顯抑制儲藏期花生黃曲霉的致病和產毒，且具有廣譜抑菌作用，為儲藏期真菌病害及毒素的生物防控提供了重要材料?；ㄉ鷥Σ剡^程中，極易受黃曲霉侵染危害，且隨籽粒水活度增高，發(fā)病程度越重，毒素污染量越高[34]。為檢測篩選菌株WY6-5的生防效果，本研究采用兩種高水活度（＞0.85）處理，分析其對花生黃曲霉及毒素的防控效果。模擬儲藏培養(yǎng)試驗中，未添加WY6-5處理組黃曲霉在花生表皮快速生長蔓延，覆蓋于花生籽粒表面，且水活度越高，發(fā)病越嚴重。AFT總量分別達到399.32 μg?kg-1（水活度0.859）和3 143.19 μg?kg-1（水活度0.923），顯著高于中國的最高限量標準（20 μg?kg-1）；WY6-5添加組花生中AFT總量為4.86和121.37 μg?kg-1，明顯低于對照組，抑制率分別為98.78%和96.14%。由此可知，WY6-5處理后，水活度0.859條件下，花生中毒素含量低于我國最高限量標準，但水活度0.923條件下，毒素含量仍然超標。因為本研究中選用的花生為極端水活度條件，在日常的生產、運輸、加工和儲藏過程中，花生籽粒的水活度遠遠低于此標準（＜0.7）[34]，在此情況下，WY6-5可發(fā)揮更好的抑菌效果，有效防治黃曲霉致病和產毒，將毒素含量控制在有效范圍之內，為儲藏期黃曲霉的防控提供有效材料。

WY6-5產生的二甲基二硫具有強逸發(fā)性冷薄荷氣味，呈無色或蒼黃色，也存在于新鮮的洋蔥和蕓苔屬植物中[33]，同時鏈霉菌、沙門氏菌以及假單胞菌等多種微生物均可產生該物質[24,35]，是國標中允許使用的食品香料添加劑，常用于調味、肉汁、湯類等。本研究證明，該物質具有較好的抑菌活性，其對黃曲霉菌絲生長和孢子萌發(fā)的最低抑菌濃度分別為100、50 μL?L-1，明顯優(yōu)于現(xiàn)階段報道的其他物質，如己烯醛[36]、苯乙醇[37]、二甲基三硫和十二烷醇[14]等。此外，有研究指出，二甲基二硫抑制線蟲、大麗輪枝菌（）、尖鐮孢等引起的多種土傳病害[38]，還具有誘導寄主植物抗性，促進植物生長等多種作用[39]，為潛在的高活性多功能生物菌劑。本研究采用掃描電鏡和透射電鏡觀察二甲基二硫對黃曲霉細胞結構的影響，結果表明二甲基二硫處理后黃曲霉細胞生長受到明顯抑制，但細胞內部結構未發(fā)生明顯變化。推斷二甲基二硫為小分子物質，不損傷細胞結構，但可能在細胞內部富集，作用于關鍵生物大分子物質，導致真菌細胞合成受阻，但其分子靶點仍無法探明。后續(xù)將采用多組學分析以及突變體構建等手段，分析其抑菌分子機制和作用靶點，為該物質的廣泛應用提供理論參考。

4 結論

吡咯伯克霍爾德菌WY6-5可產生揮發(fā)性抑菌物質二甲基二硫，低濃度下（100 μL?L-1）即可完全抑制黃曲霉菌絲生長和孢子萌發(fā)，顯著抑制儲藏期花生黃曲霉的致病和毒素污染，并具有促進植物生長和廣譜抑菌作用，具有較好的生物活性。因此，吡咯伯克霍爾德菌WY6-5及代謝物質二甲基二硫生物功能多樣，可作為田間和儲藏期真菌病害及毒素防控的重要材料。

[1] Amaike S, Keller N P.., 2011, 49: 107-133.

[2] WALIYAR F, UMEH V C, TRAORE A, OSIRU M, NTARE B R, DIARRA B, KODIO O, VIJAY KRISHNA KUMAR K, SUDINI H. Prevalence and distribution of aflatoxin contamination in groundnut (L.) in Mali, West Africa., 2015, 70: 1-7.

[3] ASTERS M C, WILLIAMS W P, PERKINS A D, MYLROIE J E, WINDHAM G L, SHAN X. Relating significance and relations of differentially expressed genes in response toinfection in maize., 2014, 4: 4815.

[4] MICHAILIDES T, THOMIDIS T. First report ofcausing fruit rots of peaches in Greece., 2007, 56(2): 352.

[5] WILLIAMS J H, PHILLIPS T D, JOLLY P E, STILES J K, JOLLY C M, AGGARWALD. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions., 2004, 80(5): 1106-1122.

[6] WU F. Global impacts of aflatoxin in maize: trade and human health., 2015, 8(2): 137-142.

[7] 周守長. 鴨飼料中黃曲霉毒素B1污染的流行病學調查、致病作用及其防治方法研究[D]. 揚州: 揚州大學, 2016.

ZHOU S Z. Epidemiological investigation, pathogenicity and prevention of contamination of aflatoxin B1in duck feeds[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2016. (in Chinese)

[8] LEE H J, RYU D. Worldwide occurrence of mycotoxins in cereals and cereal-derived food products: Public health perspectives of their co-occurrence., 2017, 65(33): 7034-7051.

[9] CHEN J G, EGNER P A, NG D, JACOBSON L P,MUNOZ A, ZHU Y R, QIAN G S, WU F, YUAN J M, GROOPMAN J D, KENSLER T W. Reduced aflatoxin exposure presages decline in liver cancer mortality in an endemic region of China., 2013, 6(10): 1038-1045.

[10] The European Commission. Commission regulation (EU) No. 165/2010 of 26 February 2010, amending Regulation (EC) No. 1881/2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs as regards aflatoxin., 2010: L50/8-L50/12.

[11] TORRES A M, BARROS G G, PALACIOS S A, CHULZE S N, BATTILANI P. Review on pre- and post-harvest management of peanuts to minimize aflatoxin contamination., 2014, 62: 11-19.

[12] WAGACHA J M, MUTEGI C, KARANJA L, KIMANI J, CHRISTIE M E. Fungal species isolated from peanuts in major Kenyan markets: Emphasis onsection., 2013, 52: 1-9.

[13] LEONG Y H, ISMAIL N, LATIF A A, AHMAD R. Aflatoxin occurrence in nuts and commercial nutty products in Malaysia., 2010, 21(3): 334-338.

[14] 宮安東. 鐮刀菌和黃曲霉菌生防菌的分離及拮抗機理的研究[D]. 武漢: 華中農業(yè)大學, 2015.

GONG A D. Isolation and antagonistic mechanism analyses of biocontrol agents againstandspecies[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2015. (in Chinese)

[15] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國家標準. 食品中真菌毒素限量: GB 2761—2017. (2017-09-17) [2019-04-18].

China Food and Drug Administration. national standards for food safety. Mycotoxin limits in food: GB 2761—2017. (2017-09-17) [2019-04-18]. (in Chinese)

[16] BEDIAKO K A, OFORI K, OFFEI S K, DZIDZIENYO D, ASIBUO J Y, AMOAH R A. Aflatoxin contamination of groundnut (L.): Predisposing factors and management interventions., 2019, 98: 61-67.

[17] PASSONE M A, ETCHEVERRY M. Antifungal impact of volatile fractions ofandonsectionand residual levels of these oils in irradiated peanut., 2014, 168/169: 17-23.

[18] KEDIA A, PRAKASH B, MISHRA P K, DUBEY N K. Antifungal and antiaflatoxigenic properties of(L.) seed essential oil and its efficacy as a preservative in stored commodities., 2014, 168/169: 1-7.

[19] PRAKASH B, KEDIA A, MISHRA P K, DUBEY N K. Plant essential oils as food preservatives to control moulds, mycotoxin contamination and oxidative deterioration of agri-food commodities–Potentials and challenges., 2015, 47: 381-391.

[20] EHRLICH K C. Non-aflatoxigenicto prevent aflatoxin contamination in crops: advantages and limitations., 2014, 5: 50.

[21] KONG Q, CHI C, YU J J, SHAN S H, LI Q Y, LI Q T, GUAN B, NIERMAN W C, BENNETT J W. The inhibitory effect ofon aflatoxin and cyclopiazonic acid biosynthetic pathway gene expression in., 2014, 98(11): 5161-5172.

[22] GONG A D, LI H P, SHEN L, ZHANG J B, WU A B, HE W J, YUAN Q S, HE J D, LIAO Y C. Thestrain YM8 produces volatiles with strong inhibition activity againstpathogens and aflatoxins., 2015, 6: 1091.

[23] WARTH B, SULYOK M, FRUHMANN P, MIKULA H, BERTHILLER F, SCHUHMACHER R, HAMETNER C, ABIA W A, ADAM G, FROHLICH J, KRSKA R. Development and validation of a rapid multi-biomarker liquid chromatography/tandem mass spectrometry method to assess human exposure to mycotoxins.,2012, 26(13): 1533-1540.

[24] 宮安東, 韓萌真, 孔憲巍, 魏彥博, 王磊, 程琳. 茶樹內生菌的應用性研究進展. 信陽師范學院學報(自然科學版), 2017, 30(1): 168-172.

GONG A D, HAN M Z, KONG X W, WEI Y B, WANG L, CHENG L. Application analysis of endophytic microbes in., 2017, 30(1): 168-172. (in Chinese)

[25] BOUKAEW S, PLUBRUKAM A, PRASERTSAN P. Effect of volatile substances fromRM-1-138 on growth ofon rice leaf., 2013, 58(4): 471-482.

[26] GOTOR-VILA A, TEIXIDó N, DI FRANCESCO A, USALL J, UGOLINI L, TORRES R, MARI M. Antifungal effect of volatile organic compounds produced byCPA-8 against fruit pathogen decays of cherry., 2017, 64: 219-225.

[27] MACíAS-RUBALCAVA M L, SáNCHEZ-FERNáNDEZ R E, ROQUE-FLORES G, Lappe-Oliveras P, Medina-Romero Y M. Volatile organic compounds fromendophytic strains as postharvest mycofumigation alternative for cherry tomatoes., 2018, 76: 363-373.

[28] 王靜, 曹建敏, 陳德鑫, 邱軍, 王曉強, 馮超, 王文靜. 短小芽孢桿菌AR03揮發(fā)性有機物的抑菌活性及其組分分析. 中國農業(yè)科學, 2018, 51(10): 1908-1919.

WANG J, CAO J M, CHEN D X, QIU J, WANG X Q, FENG C, WANG W J. Antimicrobial effect and components analysis of volatile organic compounds fromAR03., 2018, 51(10): 1908-1919. (in Chinese)

[29] ZHANG Y, LI T J, LIU Y F, LI X Y, ZHANG C M, FENG Z Z, PENG X, LI Z Y, QIN S, XING K. Volatile organic compounds produced bysubsp.SPS-41 as biological fumigants to controlin postharvest sweet potatoes., 2019, 67(13): 3702-3710.

[30] ROJAS-ROJAS F U, SALAZAR-GOMEZ A, VARGAS-DIAZ M E, VASQUEZ-MURRIETA M S, HIRSCH A M, DE MOT R, GHEQUIRE M G K, IBARRA J A, ESTRADA-DE LOS SANTOS P. Broad-spectrum antimicrobial activity byTAtl-371, a strain isolated from the tomato rhizosphere, 2018, 164(9): 1072-1086.

[31] LEMTUKEI D, TAMURA T, NGUYEN Q T, UENO M. Inhibitory activity ofsp.isolated from soil in Gotsu City, Shimane, against., 2017, 7(2): 137-148.

[32] REN J H, YE J R, LIU H, XU X L, WU X Q. Isolation and characterization of a newstrain JK-SH007 as a potential biocontrol agent., 2011, 27(9): 2203-2215.

[33] WALLACE P, MAHAFFEE W F, PRESS C M, LARSEN M M, NEILL T M. The relationship of biofilm production to biocontrol activity ofFP62//, 2009: 569.

[34] 劉肖. 花生儲藏過程中水活度、溫度對黃曲霉生長和產毒的影響[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2016.

LIU X. Impact of water activity and temperature ongrowth and aflatoxin production in stored peanuts[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2016. (in Chinese)

[35] KAI M, EFFMERT U, BERG G, PIECHULLA B. Volatiles of bacterial antagonists inhibit mycelial growth of the plant pathogen., 2007, 187(5): 351-360.

[36] MA W B, ZHAO L L, XIE Y L. Inhibitory effect of ()-2-hexenal as a potential natural fumigant onin stored peanut seeds., 2017, 107: 206-210.

[37] HUA S S T, BECK J J, SARREAL S B L, GEE W. The major volatile compound 2-phenylethanol from the biocontrol yeast,, inhibits growth and expression of aflatoxin biosynthetic genes of., 2014, 30(2): 71-78.

[38] PAPAZLATANI C, ROUSIDOU C, KATSOULA A, KOLYVAS M, GENITSARIS S, PAPADOPOULOU K K, KARPOUZAS D G. Assessment of the impact of the fumigant dimethyl disulfide on the dynamics of major fungal plant pathogens in greenhouse soils., 2016, 146(2): 391-400.

[39] PIECHULLA B, LEMFACK M C, KAI M. Effects of discrete bioactive microbial volatiles on plants and fungi., 2017, 40(10): 2042-2067.

Inhibitory effect of dimethyl disulfide fromWY6-5 onand aflatoxins in peanuts during storage Period

GONG AnDong, DONG FeiYan, WU NanNan, KONG XianWei, ZHAO Qian, YAN JianLi, Cheelo Dimuna

(College of Life Science, Xinyang Normal University/Henan Key Laboratory of Tea Plant Biology, Xinyang 464000, Henan)

【】The objective of this study is to verify the antifungal effect ofWY6-5, evaluate its control efficacy againstand aflatoxins in peanuts during storage period, analyze the inhibitory mechanism, identify antifungal volatiles and detect the minimal inhibitory concentration to, so as to provide novel strategies for the prevention and control of fungal diseases and mycotoxin during storage period.【】Face-to-face dual cultural test was conducted to analyze the antifungal activity of volatiles from WY6-5. Active charcoal as volatile adsorbent was added into the tests to verify the antifungal activity of volatiles. Dimethyl disulfide (DMDS) emitted form strain WY6-5 was challenged with peanut kernels inoculated withconidia in sealed airspace without physical contact.cells on peanut coat were collected, fixed in osmic acid, and analyzed through scanning electron microscope (SEM). Transmission electron microscope (TEM) was used to test the inner structure ofcell affected by volatiles from WY6-5. The commercial DMDS was purchased, serially diluted, and co-cultured withconidia and mycelia to detect the minimal inhibitory concentration, respectively.【】WY6-5 isolated from rhizosphere soil of tea plants could produce volatile DMDS, prevent the growth ofmycelia, the inhibition rate was over 95%. Additionally, under the condition of high water activity (aw), WY6-5 could also inhibit theinfection and aflatoxins production in peanuts during storage period. In peanuts of control treatment, the disease incidence was 100%, and the total concentration of aflatoxins was 399.32 μg?kg-1(aw0.859) and 3 143.19 μg?kg-1(aw0.923), respectively. When WY6-5 was added in the treatment, the disease incidence decreased to 2% (aw0.859) and 21% (aw0.923), respectively. The concentration of aflatoxins decreased to 4.86 μg?kg-1(aw0.859) and 121.37 μg?kg-1(aw0.923), respectively. The inhibition rate of WY6-5 against aflatoxins contamination was 98.78% and 96.14% compared to the control treatment. SEM analysis proved that DMDS from WY6-5 inhibited the germination ofconidia. TEM analysis further proved that the inner cell structures ofconidia were not severely damaged by volatiles. Volatile DMDS showed great antifungal activity. The minimal inhibitory concentration against mycelia growth was 100 μL?L-1(compound volume/airspace volume). The minimal inhibitory concentration against conidia germination was 50 μL?L-1(compound volume/airspace volume). 【】WY6-5 can produce valid antifungal volatile DMDS, which can completely inhibit the mycelia growth and conidia germination ofat low concentration, and greatly prevent the development ofdisease and aflatoxins contamination in peanuts during storage period. WY6-5 and the produced DMDS provide novel bio-active agents for fungal diseases control and mycotoxins during storage period.

;; aflatoxin; dimethyl disulfide; antifungal; storage period

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.17.006

2019-04-18；

2019-05-13

國家自然科學基金（31701740）、河南省科技攻關項目（172102110260，182102110018）、河南省科學技術研究重點項目（16A180036）

宮安東（通信作者），E-mail：gongad@xynu.edu.cn

（責任編輯 岳梅）