結(jié)合模擬失重，改進大學(xué)生理學(xué)骨骼肌收縮實驗

暴克堯， 周小慧， 孫溢澤， 馬吉英， 黨凱， 常惠， 王慧平*

(1. 西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，西安710069； 2. 西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，西安710072)

生理學(xué)是一門以實驗為基礎(chǔ)的學(xué)科，實驗在生理學(xué)的科研和教學(xué)中有著不可替代的作用，其中教學(xué)實驗既是教師講授生理學(xué)的重要內(nèi)容和載體，也是學(xué)生學(xué)習(xí)生理學(xué)的重要環(huán)節(jié)和手段。近年來，隨著各高校教學(xué)目標和實驗條件的不斷提升，對生理學(xué)實驗教學(xué)(在高等醫(yī)學(xué)院校里，囊括在機能學(xué)實驗中)的教學(xué)內(nèi)容和實驗方法也提出了新的要求，開設(shè)綜合性強、技術(shù)性高、更能培養(yǎng)學(xué)生能力的實驗項目成為實驗教學(xué)的發(fā)展趨勢(司道文等，2013；羅繼景，2014；李鵬等，2017)。

電刺激骨骼肌，觀察骨骼肌的收縮是生理學(xué)傳統(tǒng)實驗教學(xué)項目，包括改變電刺激強度觀察骨骼肌收縮張力的變化，改變電刺激頻率觀察骨骼肌收縮形式的變化等。這一系列實驗可直觀地體現(xiàn)骨骼肌的收縮特點及其與刺激之間的關(guān)系，且實驗條件和技術(shù)較簡單，易于施行，因此在各實驗指導(dǎo)教材及各高校的教學(xué)實踐中普遍存在。傳統(tǒng)骨骼肌收縮實驗使用普通蛙類動物(多用物種為蛙或蟾蜍)作為實驗材料(莫書榮，2003；裴建明，2011；欒新紅等，2012；解景田等，2016)。但普通蛙類動物并非標準實驗動物，在體質(zhì)量、肌重，甚至品種等方面存在著較大的個體差異，使得不同個體之間的結(jié)果難以對比。同時，實驗中需要制備離體坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本，該標本制作過程包括雙毀髓、股部坐骨神經(jīng)分離、脊柱縱向剪開等步驟，這些步驟要求學(xué)生精確實施，操作失誤會使標本受到不可逆損傷，無法用于后續(xù)實驗，這對初學(xué)者有一定難度。蛙類動物體表的毒腺及黏液也會使初學(xué)者產(chǎn)生一定的排斥心理。蛙類動物的肌肉亦不能完全體現(xiàn)哺乳動物肌肉的收縮特點，如哺乳動物骨骼肌分快縮型和慢縮型，二者收縮速率不同，蛙類動物骨骼肌無快慢之分。另外，在各地的教學(xué)實踐中，尚有使用野生蛙類動物作為實驗動物的情況，長期大量使用野生動物會對當?shù)氐纳镔Y源產(chǎn)生影響，也不利于學(xué)生生態(tài)保護意識的培養(yǎng)。

針對以上使用蛙類動物的不足，我們曾提出使用SD大鼠進行此實驗(王慧平等，2019)。但在實際教學(xué)過程中發(fā)現(xiàn)抓取和麻醉大鼠對初次接觸大鼠的學(xué)生來講有一定的困難和危險。另外，本教研室近年來致力于模擬失重致骨骼肌廢用性萎縮的研究，對模擬失重動物模型的制備方法及骨骼肌的收縮功能進行了深入研究，研究表明將大鼠體軸與地面呈30°尾部懸吊2周以上，其后肢比目魚肌(抗重力肌，SOL)可出現(xiàn)嚴重的萎縮，表現(xiàn)為肌重減少、收縮力下降、肌纖維橫截面積減小、慢縮型肌纖維向快縮型肌纖維轉(zhuǎn)化等現(xiàn)象(Duetal.，2011；馮斑等，2011；Lietal.，2012；Zhangetal.，2017；Gaoetal.，2018)。因此，我們提出在本實驗中使用模擬失重KM小鼠為實驗動物，并在實驗中加入模擬失重小鼠與正常小鼠骨骼肌收縮功能的對比，以豐富實驗內(nèi)容。

1 實驗?zāi)康募霸?/h2>

通過此實驗，使學(xué)生學(xué)習(xí)肌肉實驗的電刺激方法及肌肉收縮的記錄方法，觀察不同刺激強度及刺激頻率引起的骨骼肌收縮形式的改變，同時了解模擬失重對骨骼肌收縮功能的影響。實驗原理包括了刺激強度與骨骼肌收縮反應(yīng)的關(guān)系，骨骼肌收縮的總和，不同刺激頻率引起的骨骼肌收縮形式的改變，及模擬失重致骨骼肌發(fā)生廢用性萎縮時收縮功能的變化等相關(guān)生理學(xué)知識。

2 材料和方法

2.1 實驗動物

成年雌性KM小鼠隨機分為模擬失重組(SWL組)和正常對照組(CON組)，每組8只。動物飼養(yǎng)和實驗過程符合西北大學(xué)動物倫理委員會要求。

2.2 實驗步驟

2.2.1 模擬失重小鼠模型制備參照Du等(2011)的方法，小鼠尾部懸吊，保持后肢懸空，前肢正?；顒?，小鼠體軸與地面呈30°，連續(xù)21 d。在此期間，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

2.2.2 手術(shù)處理25%烏拉坦(5 mL·kg-1體質(zhì)量)腹腔注射麻醉小鼠。將小鼠側(cè)臥位固定于恒溫手術(shù)臺上，剪去一側(cè)后肢脛部外側(cè)被毛。剪開皮膚，暴露脛部肌肉，于脛骨與腓腸肌間找到SOL。將SOL與周邊組織分離后完全暴露，避免周邊組織的附著粘連對SOL收縮過程的影響。SOL下端肌腱處穿線結(jié)扎，并于扎線下方剪斷肌腱，使其下端游離，SOL上端仍與脛部相連，SOL處于半游離狀態(tài)。

2.2.3 生理信號采集系統(tǒng)連接將扎線與張力換能器連接，調(diào)整張力換能器方位使SOL、扎線、張力換能器處于同一水平面上，SOL與扎線在同一直線上，并同張力換能器呈90°，SOL的初始長度與其在體內(nèi)的自然長度一致。電子刺激器的雙針式刺激電極輕置于SOL的上半部分，輸出電刺激引發(fā)SOL收縮。收縮張力信號經(jīng)張力換能器由Powerlab生理信號采集系統(tǒng)(ADInstruments，上海)采集并記錄。實驗過程中，不時在SOL及創(chuàng)口表面滴加K-H液(單位：mmol·L-1，NaCl 118，KCl 4.75，MgSO41.18，NaHCO324.8，KH2PO41.18，CaCl22.54，葡萄糖10，pH7.4)以保持濕潤。

2.2.4 收縮活動記錄單收縮：手動發(fā)出刺激，刺激幅度從0 V開始，逐漸增大刺激強度，每次刺激間隔大于10 s，以避免頻繁刺激引起肌肉疲勞。觀察收縮張力曲線變化，直至出現(xiàn)最大收縮張力曲線。利用信號采集系統(tǒng)配套軟件Chart 5.0在最大收縮張力曲線上測量以下單收縮的功能指標：單收縮最大張力(P0)、從收縮開始達到最大張力所需時間(TPT)、從舒張開始至舒張結(jié)束所需時間(RT)和單收縮所做的功，為單收縮張力曲線與橫軸所圍成的面積，即積分(P0-Output)。強直收縮：固定一個閾上刺激強度，以一個較低的刺激頻率連續(xù)刺激肌肉，出現(xiàn)連續(xù)的多個單收縮曲線。逐漸增大刺激頻率，單收縮逐漸融合，出現(xiàn)不完全強直收縮曲線。繼續(xù)增大刺激頻率直至出現(xiàn)完全強直收縮曲線。疲勞性：固定一個能引發(fā)正常對照小鼠與模擬失重小鼠的SOL均發(fā)生完全強直收縮的閾上刺激強度和刺激頻率(通過實踐，刺激強度設(shè)為3 V，刺激頻率設(shè)為 50 Hz)，持續(xù)刺激5 s為一次，連續(xù)刺激12次，每次中間停歇5 s，得到連續(xù)12個完全強直收縮曲線。在每個完全強直收縮曲線上測量Pt(完全強直收縮最大張力)和Pt-Output(完全強直收縮所做的功)。

2.3 數(shù)據(jù)分析

將各數(shù)據(jù)結(jié)果以Mean±SD表示，使用獨立樣本t檢驗進行顯著性檢驗，顯著性水平設(shè)為0.05。

3 實驗結(jié)果

3.1 單收縮功能分析

逐漸增加刺激強度，CON組與SWL組SOL的單收縮張力均逐漸增加，但CON組增加幅度大，SWL組增加幅度較小(圖1)。與CON組相比，SWL組最大單收縮的P0、P0-Output、TPT和RT均顯著減少。表明模擬失重后，SOL單收縮張力顯著降低，做功顯著減少，收縮與舒張時間明顯縮短(表1)。

圖1 比目魚肌單收縮Fig. 1 The twitch contraction of soleus muscle

A. 逐漸增加刺激強度引發(fā)的單收縮， B. 最大單收縮

A. the twitch contraction induced by increasing intensity stimulus， B. the maximal twitch contraction

表1 單收縮功能指標Table 1 The contractile properties of twitch contraction

注Notes： 與對照組相比compared with CON group，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 下同the same below

3.2 肌肉收縮形式與電刺激頻率的關(guān)系

逐漸增加刺激頻率，CON組、SWL組的SOL均出現(xiàn)不完全強直收縮和完全強直收縮(圖2)。

圖2 逐漸增加刺激頻率引發(fā)的強直收縮Fig. 2 The tetanic contraction induced by increasing frequency stimulus

3.3 完全強直收縮功能分析

SWL組Pt和Pt-Output與CON組相比均顯著性減少。表明模擬失重后，SOL完全強直收縮的張力顯著降低，做功顯著減少(表2)。

表2 首個完全強直收縮功能指標Table 2 The contractile properties of the first completetetanic contraction

3.4 疲勞性分析

隨著連續(xù)完全強直收縮的進行，CON組與SWL組完全強直收縮張力和做功均下降，但SWL組降低的速度更快，幅度更大(圖3，圖4)。

圖3 連續(xù)完全強直收縮Fig. 3 The continuous complete tetanic contraction

圖4 連續(xù)完全強直收縮張力與做功的變化Fig. 4 The changes of tension and output in continuous complete tetanic contraction

4 結(jié)語

骨骼肌收縮實驗是生理學(xué)中的傳統(tǒng)經(jīng)典教學(xué)實驗，在各高校多年的教學(xué)實踐中，已有學(xué)者針對使用普通蛙類動物的不足，使用牛蛙Lithobatescatesbeiana、小鼠、SD大鼠等均能很好地完成此實驗(劉紫荊，陳筱春，2008；沙愛龍等，2017；王慧平等，2019)。用模擬失重小鼠的SOL進行此實驗，發(fā)現(xiàn)隨著刺激強度的增大，其收縮強度增大；隨著刺激頻率的增大，其收縮形式由一連串的單收縮逐步融合成不完全強直收縮，乃至完全強直收縮，這些實驗結(jié)果與實驗原理預(yù)期完全吻合?？梢姡褂媚M失重小鼠替代普通蛙類動物，亦能完成傳統(tǒng)骨骼肌收縮實驗的內(nèi)容。

使用模擬失重小鼠，在完成傳統(tǒng)實驗的同時，還能觀察中長期失重狀態(tài)對骨骼肌收縮功能的影響。我們讓學(xué)生同時測定模擬失重小鼠和正常小鼠的收縮功能，結(jié)果顯示，模擬失重小鼠SOL單收縮張力與做功能力降低，收縮與舒張時間均快于正常小鼠，完全強直收縮張力與做功能力減弱，肌肉抗疲勞能力下降，在連續(xù)收縮過程中更易疲勞。這些結(jié)果與我們的科研結(jié)果一致，體現(xiàn)了骨骼肌在長期模擬失重狀態(tài)下發(fā)生了一定程度的萎縮，從而導(dǎo)致收縮功能下降。通過這個實驗，就可以向?qū)W生直接展示失重狀態(tài)對骨骼肌收縮功能的影響，在傳統(tǒng)骨骼肌收縮實驗中引入了航天生理學(xué)的研究方法，增加了實驗內(nèi)容，使學(xué)生對航天生理學(xué)有了一個初步的了解。目前，我國載人航天事業(yè)正在蓬勃發(fā)展，在生理學(xué)教學(xué)中適機加入航天生理學(xué)的內(nèi)容，不但能拓寬學(xué)生的知識領(lǐng)域，更能激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)本課程的興趣，激發(fā)學(xué)生的愛國情懷。另外，實驗結(jié)束后，SOL或機體的其他組織器官還可用于其他實驗，可使實驗動物得到充分利用，節(jié)約實驗經(jīng)費，提高教學(xué)投入效益。

本實驗簡單易行，所用動物為常規(guī)標準實驗動物，各實驗動物中心均可提供。除小鼠吊尾外，其余均為常規(guī)實驗方法。小鼠吊尾方法可參照文獻進行(Morey-Holton & Ruth，2002；Duetal.，2011；林煜等，2012)。2018年，將這一新的教學(xué)實驗引入我校本科生理學(xué)實驗教學(xué)中，約150名學(xué)生分組進行了該實驗，共測定了20只正常小鼠和20只模擬失重小鼠SOL的收縮功能。實驗總體成功率84%，平均耗時3 h。此次實踐表明本實驗適合作為教學(xué)實驗項目。經(jīng)過實踐，我們認為本實驗過程中有兩點需要注意：第一，多數(shù)學(xué)生實驗前不知道SOL的解剖位置。我們運用解剖圖譜和事先拍好的照片，明確清晰地展示了SOL的具體位置，有助于學(xué)生在進行實驗時迅速準確確定SOL。第二，小鼠的體質(zhì)量較輕，實驗中可以在小鼠身上放置1、2把手術(shù)器械，如剪刀、止血鉗等，這樣的增重可以使SOL近心端更易固定，以免收縮時近心端移動影響張力數(shù)值。

目前國內(nèi)流行的生理學(xué)實驗指導(dǎo)教材，其內(nèi)容多是經(jīng)典傳統(tǒng)的生理學(xué)實驗。雖然這些實驗在幾十年的教學(xué)實踐中已被證明其理論原理清晰、步驟設(shè)計合理、結(jié)果直觀可靠，但在當今，卻顯得內(nèi)容相對陳舊、缺乏時代氣息，與現(xiàn)代生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)的發(fā)展相距甚遠，不能很好地調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣和積極性。大多數(shù)高校教師都承擔(dān)有科研任務(wù)，擁有一定的科研技術(shù)和成果。如能將自身的科研技術(shù)或成果與實驗教學(xué)結(jié)合起來，將可極大提升實驗教學(xué)的前沿性和挑戰(zhàn)性，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，這也是目前教學(xué)改革提倡的方式之一(卜遲武等，2010；房偉等，2013；林躍強等，2015；趙永軍等，2016；周智華等，2017)。本實驗將科研中模擬失重動物骨骼肌收縮功能的測定方法和結(jié)果引入教學(xué)，從而豐富了傳統(tǒng)骨骼肌收縮實驗的內(nèi)容，提升了實驗教學(xué)水平，在實踐中收到了良好的教學(xué)效果。