河川沙塘鱧GH基因及側(cè)翼的克隆與生物信息學(xué)分析

劉加林，劉士力，蔣文枰，程 順，遲美麗，鄭建波，賈永義，趙金良，尹紹武，顧志敏

(1.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210000；2.浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313001；3.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；4.上海海洋大學(xué) 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)隸屬于鱸形目(Perciformes)鰕虎魚(yú)亞目(Gobioidei)塘鱧科(Eleotridae)沙塘鱧屬(Odontobutis)，主要分布于長(zhǎng)江中、下游及沿江各支流，錢塘江水系，閩江水系，偶見(jiàn)于黃河水系[1]。河川沙塘鱧需要攝食活餌，可以與蝦蟹一起養(yǎng)殖，能夠提高水體利用率；其味道鮮美，隨著苗種培育技術(shù)的突破，沙塘鱧已成為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ乃a(chǎn)養(yǎng)殖新品種[2]。沙塘鱧的價(jià)格隨著規(guī)格的增加而提高，對(duì)其進(jìn)行選育具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。

生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)與催乳素(prolactin，PRL)和胎盤催乳素(placentallactogen，PL)屬于同一個(gè)基因家族[3]，是主要影響動(dòng)物生長(zhǎng)相關(guān)性狀的基因[4]，可以促進(jìn)骨骼、內(nèi)臟的生長(zhǎng)以及蛋白質(zhì)的合成[5-6]，在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育中起著關(guān)鍵性作用，并且該基因可以人工合成。近年來(lái)，對(duì)于生長(zhǎng)激素基因研究在不斷增加，已在禽畜物種上做過(guò)很多研究[7-8]，對(duì)魚(yú)類GH基因的報(bào)道也層出不窮，已對(duì)鯉形目[9]、鰈形目[10]、鲀形目[11]、鰻鱺目[12]、鯰形目[3]等魚(yú)類進(jìn)行了該基因的序列分析以及其多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的關(guān)聯(lián)分析。大部分魚(yú)類研究中，僅發(fā)現(xiàn)一種GH基因，但在鮭鱒及羅非魚(yú)中發(fā)現(xiàn)GH基因以兩種形式存在，可能是由于其祖先中發(fā)生了四倍體事件所導(dǎo)致[13]。本研究采用T-A克隆技術(shù)克隆了河川沙塘鱧GH基因全序列，通過(guò)對(duì)其核苷酸序列的比較分析，以期為河川沙塘鱧人工選育奠定技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)為塘鱧科魚(yú)類起源及進(jìn)化機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用河川沙塘鱧采自浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合實(shí)驗(yàn)基地，剪取少量尾鰭，用無(wú)水乙醇于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：PCR反應(yīng)試劑、Genome Walking Kit試劑盒和pMD19-T載體購(gòu)自寶生物技術(shù)(北京)有限公司；膠回收試劑盒、大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α、氨芐和異丙基硫代半乳糖苷購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；用于DNA提取的試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用苯酚-氯仿法提取樣本DNA。用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取DNA完整性，DNA原液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室獲得河川沙塘鱧轉(zhuǎn)錄組中GH的mRNA序列進(jìn)行分析，在開(kāi)放閱讀框兩側(cè)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。這樣既可以擴(kuò)增出內(nèi)含子，同時(shí)也可對(duì)mRNA序列進(jìn)行驗(yàn)證。按照Genome Walking Kit試劑盒的要求在兩端分別設(shè)計(jì)兩條特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 河川沙塘鱧GH基因克隆PCR引物序列

Table1Primers used forGHgene cloning ofOdontobutispotamophila

引物Primer序列Sequence (5′-3′)產(chǎn)物長(zhǎng)度Length/bp用途UsageGH-FAGACCCAACATAAACTAA3325擴(kuò)增GH內(nèi)含子 Amplification of GH intronGH-RTAGGGTTAACATACAGAGGGH-5 (SP1)GACACGGCTCACAGCAATGG≈12005′端步移5′-terminal walkingGH-5 (SP2)AAACGCTGGCTGTCAGTGH-3 (SP1)TTGCCTTTGGTCCCTTTGAA≈8003端步移3′-terminal walkingGH-3 (SP2)AGGTGGAGACATACTTGACG

1.2.3 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系為25 μL∶10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTPs(各2.5 mmol·L-1)2.0 μL，模板DNA(50 ng·μL-1)1 μL，上游、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，滅菌超純水補(bǔ)足體系。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

操作步驟：以所研究目的片段設(shè)計(jì)巢式PCR特異性引物SP1和SP2。首先以純化后的河川沙塘鱧基因組DNA為模板，根據(jù)試劑盒PCR反應(yīng)體系，以試劑盒中提供的兼并引物AP與目的片段特異性引物SP1進(jìn)行第一輪巢式PCR，再取第一輪巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物1 μL作為第二輪巢式PCR反應(yīng)的模板，利用相同的AP引物和特異性引物SP2進(jìn)行第二輪巢式PCR，將兩次PCR產(chǎn)物按順序分別進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 克隆及測(cè)序

PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，如序列中包含微衛(wèi)星和Poly結(jié)構(gòu)導(dǎo)致測(cè)序不完整，克隆后再進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 序列分析

利用軟件ContigExpress將所獲得的DNA片段和已知的mRNA序列拼接在一起，利用NCBI中BLAST軟件進(jìn)行序列對(duì)比，確定河川沙塘鱧GH基因正確性。GH基因的mRNA及編碼的氨基酸序列按照劉士力等[14]的方法進(jìn)行分析。內(nèi)含子的相似度通過(guò)GenBank的BLAST功能計(jì)算。微衛(wèi)星和小衛(wèi)星的查找分別通過(guò)SSRhunter 1.3和在線軟件Repfind進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GH基因及側(cè)翼的克隆、測(cè)序及鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶清晰，無(wú)雜帶，片段長(zhǎng)度在3 340 bp左右，經(jīng)測(cè)序后與本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組中GH的mRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，可確定獲得的為正確目的片段，與通過(guò)基因組步移法獲得的5′端和3′端序列進(jìn)行拼接共獲得5 120 bp的序列，其堿基組成為：A+T占53.26%，C+G占46.74%。將該序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)MH717101。

河川沙塘鱧GH基因轉(zhuǎn)錄單元長(zhǎng)3 518 bp，5′端側(cè)翼序列長(zhǎng)度為920 bp，包含(AC)12(AC)14的微衛(wèi)星序列，3′端側(cè)翼序列長(zhǎng)度682 bp，包含(TA)5(A)6(TA)10的微衛(wèi)星序列。包含4個(gè)內(nèi)含子、5個(gè)外顯子。其內(nèi)含子均以GT開(kāi)始，以AG結(jié)束，符合真核生物外顯子與內(nèi)含子之間的剪接規(guī)律。其中4個(gè)內(nèi)含子大小分別為75、333、2 070和121 bp，5個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為150、131、117、138和373 bp；mRNA序列全長(zhǎng)為909 bp，5′-非翻譯區(qū)(5′-UTR)為140 bp，3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)為175 bp，開(kāi)放閱讀框區(qū)(ORF)為594 bp，編碼由197個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)多肽，其所編碼氨基酸序列信息如圖1所示。

相對(duì)于外顯子，GH基因內(nèi)含子存在相對(duì)較大的差異。河川沙塘鱧GH基因中第3內(nèi)含子長(zhǎng)達(dá)2 070 bp，其長(zhǎng)度是翹嘴鲌第3內(nèi)含子的4倍以上，且沒(méi)有任何相似性。河川沙塘鱧GH基因內(nèi)含子和外顯子中沒(méi)有微衛(wèi)星序列。

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，河川沙塘鱧GH蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為22.57 ku，理論等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)為6.43，分子式：C1022H1610N272O294S5。其中，亮氨酸(Lue，L)含量最高，為10.7%，其次是絲氨酸(Ser，S)，含量為12.2%；半胱氨酸(Cys，C)含量最低，為1.0%；帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)22個(gè)，帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)21個(gè)；不穩(wěn)定指數(shù)(instability index，II)為48.66；脂肪族氨基酸指數(shù)(aliphatic index)為107.36。經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)序列分析，河川沙塘鱧GH基因氨基酸預(yù)測(cè)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)；河川沙塘鱧生長(zhǎng)激素成熟肽序列中包含一個(gè)信號(hào)肽，由16個(gè)氨基酸組成；用NCBI的Conserved Domains(CD-Search)程序分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，分析表明，河川沙塘鱧GH基因具有1個(gè)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，位于第25-179位氨基酸處，可信度(E-value)為2.42e-58。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，河川沙塘鱧二級(jí)結(jié)構(gòu)含57.87%的螺旋(helix，包括α-、pi-和 3.10-helix)、38.07%的環(huán)(loop)及4.06%的鏈(strand)。

*為終止密碼子；下劃線上氨基酸序列表示信號(hào)肽；陰影部分氨基酸序列表示保守的蛋白結(jié)構(gòu)域；黑體核苷酸表示多聚腺苷酸加尾信號(hào)(AATAAA)。* was the termination codon; The amino acid sequence on the underline represented the signal peptide; The shaded amino acid sequences represented the conserved protein domain; The blackbody nucleotide denoted polyadenylate plus tail signal (AATAAA).圖1 河川沙塘鱧GH基因CDS區(qū)氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence in the CDS region of O. potamophila GH gene

2.2 GH側(cè)翼區(qū)的分析

利用DNA Star軟件進(jìn)行分析，獲得的河川沙塘鱧GH基因的啟動(dòng)子。如圖2所示，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)A在翻譯起始密碼子ATG上游140 bp。所得到的河川沙塘鱧的GH的5′側(cè)翼序列中啟動(dòng)子含有TATA-box，卻未發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的其余兩個(gè)核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄元件：CAAT-box和CArG motif。以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)A為+1位，-400～-394處有一個(gè)TATA-box，此外，在-647～-641處也存在TATA-box。河川沙塘鱧GH基因5端序列在GenBank中沒(méi)有比對(duì)到同源序列。

經(jīng)alggen(http://alggen.lsi.upc.es)在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，GH啟動(dòng)子含有MF3、GAGA factor、HNF-3alpha、C/EBP、R2、GATA-1等多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。

推測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)用單下劃線和陰影表示；轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)用粗體表示；翻譯起始密碼子ATG用粗體表示。Putative transcription factor binding sites were single-underlined and shaded; The transcription initiation site was in bold; The translation start codon ATG was in bold.圖2 河川沙塘鱧GH基因5′側(cè)翼區(qū)序列及部分潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 Sequence of the 5′-flanking region of O.potamophila growth hormone (GH) gene and partial prediction of transcription factor binding sites

2.3 GH基因外顯子、內(nèi)含子及其編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)比較

將河川沙塘鱧與其他魚(yú)類的GH基因比較發(fā)現(xiàn)(表2)，其編碼區(qū)序列長(zhǎng)度相差9～39 bp，除鱸形目魚(yú)類點(diǎn)帶石斑魚(yú)和翹嘴鱖含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子外，其余均含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。前4個(gè)外顯子的長(zhǎng)度河川沙塘鱧與點(diǎn)帶石斑魚(yú)和翹嘴鱖幾乎一致，但第5外顯子的長(zhǎng)度與兩種魚(yú)類第5外顯子和第6外顯子長(zhǎng)度之和相似；除第4內(nèi)含子長(zhǎng)度具有一致性外，河川沙塘鱧與點(diǎn)帶石斑魚(yú)和翹嘴鱖在其余內(nèi)含子的長(zhǎng)度上均有很大程度的差異性。

由表2可知，河川沙塘鱧與除石斑魚(yú)和翹嘴鱖外其他魚(yú)類外顯子長(zhǎng)度幾乎相同，第1內(nèi)含子長(zhǎng)度均小于翹嘴鲌等魚(yú)類，除翹嘴鲌外第2內(nèi)含子均大于黃顙魚(yú)等鲇形目魚(yú)類，第3內(nèi)含子長(zhǎng)度皆遠(yuǎn)大于翹嘴鲌等魚(yú)類，約是其平均長(zhǎng)度的3.5倍，第4內(nèi)含子長(zhǎng)度明顯小于黃顙魚(yú)。經(jīng)NCBI中BLAST分析發(fā)現(xiàn)，河川沙塘鱧與這幾種魚(yú)類的內(nèi)含子均沒(méi)有相似性。

將河川沙塘鱧同鱸形目魚(yú)類：彼氏冰鰕虎魚(yú)(Leucopsarionpetersii)、點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)、黃金鱸(Percaflavescens)、褐石斑魚(yú)(Epinephelusbruneus)、翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)；鲉形目魚(yú)類：西刺杜父魚(yú)(Cottuskazika)；鯉形目魚(yú)類：草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)、翹嘴鲌(Culteralburnus)；鲇形目魚(yú)類：黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)、南方大口鲇(Silurusmeridionalis)、蘭州鲇(Siluruslanzhouensis)、斑點(diǎn)叉尾鮰(IctalurusPunctatus)，通過(guò)NCBI經(jīng)BLAST進(jìn)行GH基因編碼區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列同源性分析，如表3及圖3所示，河川沙塘鱧與鱸形目(Perciformes)鰕鯱魚(yú)亞目(Gobioidei)的彼氏冰鰕虎魚(yú)GH氨基酸序列同源性最高，為83.8%，有35個(gè)氨基酸殘基的差異和一個(gè)氨基酸殘基的缺失；其次與翹嘴鱖、點(diǎn)帶石斑魚(yú)的同源性相近，分別為78.6%和78.0%；與草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)同源性最低，為49.1%。河川沙塘鱧與黃顙魚(yú)編碼區(qū)核苷酸序列同源性最低，為46.2%，同其他魚(yú)類的相似性與氨基酸序列同源性分析結(jié)果基本一致。在河川沙塘鱧GH所編碼的氨基酸序列中，只有兩個(gè)半胱氨酸殘基(Cys68和Cys171)，比其他魚(yú)類少，但是非常保守，參與了二硫鍵；另外，該序列中無(wú)N-糖基化位點(diǎn)。

表2 河川沙塘鱧與其他魚(yú)類GH基因外顯子和內(nèi)含子大小的對(duì)比

Table2Size comparison of exon and intron ofGHgene amongO.phiocephalusand other fish species

區(qū)域Region河川沙塘鱧OdontobutispotamophilaMH717101點(diǎn)帶石斑魚(yú)EpinepheluscoioidesKR269816翹嘴鱖SinipercachuatsiEF205280黃顙魚(yú)PelteobagrusfulvidracoKU323395蘭州鲇SiluruslanzhouensisKM215221斑點(diǎn)叉尾鮰IctalurusPunctatusAF267989翹嘴鲌CulteralburnusKX9259765′側(cè)翼5′flanking14005374526854第一外顯子ExonⅠ10101010101010第一內(nèi)含子IntronⅠ75107406302229309271第二外顯子ExonⅡ131134134140140140140第二內(nèi)含子IntronⅡ33393292385103114454第三外顯子Exon Ⅲ117117117117117117117第三內(nèi)含子IntronⅢ20707191138642565716437第四外顯子ExonⅣ138144144132132132162第四內(nèi)含子IntronⅣ1219986835103340136第五外顯子Exon Ⅴ198147147204204204204第五內(nèi)含子Intron Ⅴ196494第六外顯子Exon Ⅵ63633′側(cè)翼3flanking175022348541849651CDS 序列 CDS sequence594615616603603603633

圖3表明，河川沙塘鱧在1～179氨基酸序列處十分保守，表現(xiàn)為氨基酸數(shù)量十分保守和超過(guò)半數(shù)的氨基酸排列相同，但在180～197氨基酸序列處，河川沙塘鱧表現(xiàn)出高度不保守性，與所列魚(yú)類氨基酸排列均完全不一致，該段序列為TIDSDLVLVWTWFWSGLI，與該段序列對(duì)應(yīng)的鱸形目魚(yú)類氨基酸序列為ETYLTVAM/KCRLSPEANCTL，鲉形目魚(yú)類氨基酸序列為ETYLTVAKCRLSPEANCTL，鯉形目氨基酸序列為ETYLRVANCRRSLDSNCTL，鲇形目氨基酸序列為ETYLSVAKCRRSLDSNCTL。這一現(xiàn)象表明河川沙塘鱧GH基因所編碼的蛋白質(zhì)具有獨(dú)特性，對(duì)其進(jìn)行深入研究具有重要意義。

2.4 河川沙塘鱧GH氨基酸序列和其他物種的比較分析

利用MEGA 7.0等軟件，對(duì)本實(shí)驗(yàn)所獲得的河川沙塘鱧GH氨基酸序列及從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的包括鱸形目、鲉形目、鯉形目、鲇形目在內(nèi)的13種魚(yú)類GH氨基酸序列，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。在圖4中可以看出，河川沙塘鱧先與彼氏冰鰕鯱魚(yú)聚集在一起，然后與鲉形目的西刺杜父魚(yú)聚成一小支，最后與其他鱸形目魚(yú)類聚成單獨(dú)的一大支，點(diǎn)帶石斑魚(yú)是鱸形目魚(yú)類中與河川沙塘鱧關(guān)系最遠(yuǎn)的魚(yú)類。用作參考的鯉形目和鲇形目魚(yú)類聚成一支。

3 討論

GH基因是胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的發(fā)育調(diào)控因子， 包括肢體的發(fā)育、細(xì)胞的定向分化、信號(hào)傳導(dǎo)等[15]，魚(yú)生長(zhǎng)激素是魚(yú)類腦垂體中分泌的促進(jìn)生長(zhǎng)的單一亞基的蛋白激素，它參與魚(yú)的生長(zhǎng)代謝，能夠加速蛋白質(zhì)合成和脂類降解[16-17]，據(jù)報(bào)道，溫海深等[18]已經(jīng)建立了用來(lái)測(cè)定鯉科魚(yú)類的鯉魚(yú)生長(zhǎng)激素(cGH)RIA的實(shí)驗(yàn)方法，效果較佳。本實(shí)驗(yàn)室已克隆出翹嘴鲌的GH基因[19]與IGF-I基因[20]，在翹嘴鲌GH基因的5′端側(cè)翼區(qū)具有2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，將該2個(gè)位點(diǎn)與翹嘴鲌的體長(zhǎng)、體質(zhì)量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)與生長(zhǎng)性狀具有關(guān)聯(lián)性，且這2個(gè)位點(diǎn)中優(yōu)勢(shì)等位基因所占的比例較高，可在翹嘴鲌近緣物種或者不同地理種群中做下一步分析；在IGF-I基因的第一、二內(nèi)含子中共發(fā)現(xiàn)6個(gè)微衛(wèi)星，且其中一個(gè)微衛(wèi)星序列(CT)8在所進(jìn)行比對(duì)的鯉科魚(yú)類中具有同源序列。本實(shí)驗(yàn)中，在河川沙塘鱧的5′端側(cè)翼區(qū)也存在(AC)12(AC)14的微衛(wèi)星序列，并在3′端側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)了包含(TA)5(A)6(TA)10的微衛(wèi)星序列，對(duì)于其與生長(zhǎng)相關(guān)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析試驗(yàn)還未進(jìn)行，預(yù)測(cè)位于兩端的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有多態(tài)性。

半胱氨酸用“”和斜體表示；加粗下劃線表示N-糖基化位點(diǎn)。Cysteine was expressed as “” and italicized; bold underlining indicated N-glycosylation sites.圖3 河川沙塘鱧與其他魚(yú)類GH氨基酸序列對(duì)比分析Fig.3 Comparative analysis of GH amino acid sequence between O. phiocephalus and other fish species

表3 河川沙塘鱧與其他魚(yú)類GH基因編碼區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列的同源性分析

Table3Homology analyses of nucleotide sequences of encoding region and amino acid sequences ofO.phiocephalusandGHgenes in other fish species

魚(yú)類FishO.potamophilaL.petersiiE.coioidesP.flavescensC.kazikaE.bruneusS.chuatsiC.idellaD.rerioC.alburnusP.fulvidracoS.meridionalisS.lanzhouensisI.punctatusO. potamophila100.080.775.574.071.970.374.862.048.263.446.271.773.050.5L. petersii83.8100.071.871.868.066.070.951.552.052.047.547.046.548.0E. coioides78.073.3100.087.086.571.091.163.067.563.559.062.562.562.5P. flavescens76.273.393.1100.084.471.489.368.571.567.553.062.562.560.0C. kazika75.971.894.189.7100.069.989.663.564.063.055.044.561.057.5E. bruneus59.358.267.264.266.7100.072.056.048.555.050.549.549.050.5S. chuatsi78.674.398.592.693.667.6100.066.568.063.058.046.061.571.0C. idella49.148.154.254.554.846.054.2100.088.898.375.076.075.577.1D. rerio49.748.153.753.454.346.053.791.0100.089.479.378.874.775.2C. alburnus50.350.354.254.255.447.154.298.191.9100.075.576.376.377.1P. fulvidraco52.152.854.654.654.448.654.674.373.875.2100.091.491.592.5S. meridionalis50.551.053.952.952.947.553.975.273.876.296.0100.099.591.0S. lanzhouensis50.551.053.952.952.947.553.975.273.876.296.0100.0100.091.2I. punctatus50.052.353.452.952.547.153.974.874.375.794.594.594.5100

對(duì)角線上方為編碼區(qū)核苷酸序列的同源性，下方為氨基酸序列的同源性。

Above the diagonal is the homology of the nucleotide sequences of encoding region and below is the homology of the amino acid sequence.

圖中枝上的數(shù)據(jù)代表置信度。Numbers on nodes indicate bootstrap values.圖4 基于GH氨基酸序列構(gòu)建的河川沙塘鱧及其他魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of O. potamophila and other fish species based on GH amino acid sequences

通過(guò)對(duì)草魚(yú)[21]、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)[22]、鯰魚(yú)(Silurusasotus)[23]GH基因外顯子與內(nèi)含子的研究及對(duì)比發(fā)現(xiàn)，含有5個(gè)外顯子及4個(gè)內(nèi)含子的魚(yú)類占據(jù)大多數(shù)，也有少部分魚(yú)類具有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子[24-26]，如本文所提及的點(diǎn)帶石斑魚(yú)和翹嘴鱖。本實(shí)驗(yàn)采用T-A克隆得到河川沙塘鱧GH序列全長(zhǎng)，具有5個(gè)外顯子及4個(gè)內(nèi)含子，同點(diǎn)帶石斑魚(yú)和翹嘴鱖比較發(fā)現(xiàn)，前4個(gè)外顯子的長(zhǎng)度幾乎一致，但河川沙塘鱧第5外顯子的長(zhǎng)度約等于該兩種魚(yú)類第5外顯子和第6外顯子長(zhǎng)度之和，除第4內(nèi)含子長(zhǎng)度具有一致性外，其余內(nèi)含子的長(zhǎng)度均有很大程度的差異性，且第3內(nèi)含子長(zhǎng)度皆遠(yuǎn)大于同鱸形目魚(yú)類在內(nèi)的其他魚(yú)類。因此表明外顯子的保守性比內(nèi)含子高，從而可能導(dǎo)致GH基因在不同物種進(jìn)化速率的差異[27]。

劉士力等[28]對(duì)翹嘴鲌GH基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列與團(tuán)頭魴完全一致，且與草魚(yú)只有一個(gè)氨基酸殘基的差異，對(duì)此所建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)符合基本的分類地位。本研究對(duì)4個(gè)目的14種魚(yú)類進(jìn)行GH基因氨基酸序列的比較，發(fā)現(xiàn)河川沙塘鱧和鱸形目魚(yú)類的同源性為59.3%～83.8%，其中河川沙塘鱧與同為鰕鯱魚(yú)亞目的彼氏冰鰕虎魚(yú)同源性最高；作為參考的鲉形目、鯉形目及鲇形目魚(yú)類，同鲉形目的同源性為75.9%，同鯉形目魚(yú)類的同源性為49.1%～50.3%，同鲇形目魚(yú)類的同源性為50.0%～52.1%。鲉形目魚(yú)類較部分鱸形目魚(yú)類與河川沙塘鱧之間的同源性高，可能因?yàn)榈乩矸植技捌渌陀^原因形成，所以對(duì)河川沙塘鱧生長(zhǎng)激素基因的研究是很有必要的。

傳統(tǒng)的物種分類方法是以形態(tài)學(xué)和生化特征作為基礎(chǔ)的，而以基因序列為基礎(chǔ)的可以通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)分析物種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，這有助于對(duì)不同魚(yú)類之間進(jìn)化關(guān)系有更加深刻的認(rèn)識(shí)[29]。通過(guò)構(gòu)建N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)對(duì)14種魚(yú)類進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鱸形目與其他兩個(gè)目的魚(yú)類各聚為一支，在鱸形目中，河川沙塘鱧最先與彼氏冰鰕鯱魚(yú)聚為一支，然后與西刺杜父魚(yú)再聚為一支，最后與褐石斑魚(yú)等魚(yú)類聚成一大支。在傳統(tǒng)分類學(xué)上，彼氏冰鰕鯱魚(yú)與河川沙塘鱧同屬于鰕鯱魚(yú)亞目，褐石斑魚(yú)等屬于鱸亞目，而西刺杜父魚(yú)卻屬于鲉形目，從分類學(xué)上講，褐石斑魚(yú)等魚(yú)類要比西刺杜父魚(yú)與河川沙塘鱧親緣關(guān)系近。但從地理分布分析，西刺杜父魚(yú)分布于亞洲日本淡水及半咸水域，要比點(diǎn)帶石斑魚(yú)、黃金鱸距河川沙塘鱧地理分布近，與翹嘴鱖和褐石斑魚(yú)地理分布相似。僅憑單個(gè)基因的分析不足以客觀判斷出二者的親緣關(guān)系， 還需要綜合分析更多的基因序列以及其他方面的證據(jù)。由于目前公開(kāi)的文獻(xiàn)或基因數(shù)據(jù)庫(kù)中尚缺乏這些種類的生長(zhǎng)激素基因序列，要深入探討鱸形目魚(yú)類之間的進(jìn)化關(guān)系和分類地位還有待于繼續(xù)研究。