等離子體活化水冰對純培養(yǎng)及三文魚片表面單增李斯特菌殺菌效果研究

焦 湞， 朱育攀， 許航博， 馬若男

(鄭州大學(xué) 物理工程學(xué)院 河南省離子束生物工程重點實驗室 河南 鄭州 450052)

0 引言

食物的品質(zhì)極易受微生物影響，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,L.monocytogene)，簡稱單增李斯特菌，是國際上公認(rèn)的四大食源性致病菌之一[1]，該菌在自然界中分布廣泛，容易污染食品，其中在水產(chǎn)品及肉制品中的污染最為嚴(yán)重[2].

三文魚，又名大馬哈魚或鮭魚，因其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，口感好，是制作刺身的良好材料，也是最成功的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一[3]，但三文魚容易因微生物酶和脂質(zhì)自氧化而變質(zhì)[4].目前最常見的三文魚保鮮技術(shù)是低溫、輻照、保鮮劑、真空包裝等[5].在這些保鮮技術(shù)中，冰的貯藏被廣泛應(yīng)用，除了經(jīng)濟(jì)效益以外，冰還能提供低溫和高濕環(huán)境，然而細(xì)菌在普通自來水冰中不能被有效滅活[6].因此，改進(jìn)三文魚冰鮮貯藏方法是一個亟待解決的問題.

大氣壓低溫等離子體作為一種新型的物理殺菌技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域.等離子體活性成分復(fù)雜，其中活性氧(reactive oxygen species, ROS)被認(rèn)為是殺菌的主要成分，它可以對細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類等生物大分子造成氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7].此外，研究發(fā)現(xiàn)大氣壓低溫等離子體中的電子、激發(fā)態(tài)原子、紫外線、自由基等成分在液面下可以和水分子相互作用產(chǎn)生更多種類的活性物質(zhì)，這種被等離子體處理后富含活性成分的水溶液被稱為大氣壓低溫等離子體活化水(plasma-activated water, PAW)[8].近年來，PAW對多種食源性致病菌的殺滅效果也逐漸被發(fā)現(xiàn)[9-10]，具有高效、簡單、便攜、安全等特點，極有可能替代和輔助傳統(tǒng)食品殺菌技術(shù).隨著對PAW殺菌研究的不斷深入，人們普遍認(rèn)為PAW的殺菌能力歸因于溶液的高氧化還原電位(oxidation-reduction potential, ORP)、低pH值以及過氧化氫的積累[8-10].PAW在低溫環(huán)境下制備成的冰被稱為等離子體活化水冰(PAW-ice)，這是一個全新的概念.與自來水冰相比，PAW-ice不但具有冰的特性，可以提供低溫環(huán)境，而且還具有PAW的特性，能夠殺滅多種細(xì)菌.因此，PAW-ice有望成為一種全新的冰鮮殺菌技術(shù).據(jù)文獻(xiàn)所知，目前還沒有關(guān)于PAW-ice在水產(chǎn)品殺菌保鮮方面的報道.

因此，本文首次探究PAW-ice對純培養(yǎng)及接種于新鮮三文魚片表面單增李斯特菌的殺滅效果.首先研究不同制備體系PAW-ice的殺菌效率和ORP、pH值、電導(dǎo)率等物理化學(xué)特性；并通過發(fā)射光譜技術(shù)檢測等離子體中主要激發(fā)態(tài)活性物質(zhì)；同時檢測染菌三文魚片在冷藏過程中總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)含量和pH值的變化.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1材料準(zhǔn)備 實驗所用菌株為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,L.monocytogene)，菌種購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌株編號為ATCC 19115.

供試材料為新鮮三文魚.三文魚在當(dāng)?shù)丶覙犯３匈徺I，運回實驗室后放置于4 ℃的冰箱儲藏，直至使用.

1.1.2細(xì)菌培養(yǎng)與三文魚接種 細(xì)菌培養(yǎng)：取0.1 mL甘油保藏的單增李斯特菌接種到30 mL胰蛋白胨大豆肉湯(tryptone soya broth, TSB)培養(yǎng)基中，37 ℃、180 rpm搖床培養(yǎng)24 h，之后平板劃線，37 ℃恒溫箱倒置孵育24 h.挑取單菌落到30 mL的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 rpm搖床培養(yǎng)16 h，測定OD值，稀釋若干梯度后，最終得到菌液濃度為1×106CFU/mL，以備下面處理菌懸液和浸染三文魚片使用.

三文魚片表面接種單增李斯特菌：將三文魚從冰箱中取出，并切成約為2 cm×4 cm的片狀(約5 g).并置于超凈工作臺紫外燈管下正反面照射20 min.然后將三文魚片置于無菌培養(yǎng)皿中，在其兩側(cè)均勻涂抹1 mL上述準(zhǔn)備好的菌懸液，置于超凈工作臺中充分晾干，每側(cè)30 min.

1.1.3大氣壓低溫等離子體發(fā)生裝置及PAW-ice的制備 大氣壓低溫等離子體發(fā)生裝置：本研究采用一種空心電極介質(zhì)阻擋放電裝置產(chǎn)生大氣壓低溫等離子體.該裝置由高壓交流電源(電壓峰值為25 kV，頻率為20 kHz)、銅制電極和絕緣介質(zhì)石英管構(gòu)成.本實驗所用工作氣體為空氣，氣體流速為300 slm，放電電壓為100 kV，放電電流為0.48 mA.

PAW-ice制備：將等離子體射流末端置于無菌水液面下20 mm處進(jìn)行放電處理制備PAW，然后再用改良過的制冰機將PAW制成PAW-ice.PAW-ice1是100 mL無菌水經(jīng)等離子體活化30 min后制成冰；PAW-ice2、PAW-ice3分別是500 mL無菌水經(jīng)等離子體活化30 min、60 min后制成冰.

1.2 PAW-ice處理

1.2.1PAW-ice處理純培養(yǎng)的單增李斯特菌懸液 取0.5 mL上述準(zhǔn)備好的菌懸液分別與9.5 mL的SW-ice、PAW-ice1、PAW-ice2和 PAW-ice3分別作用0 min、5 min、15 min、30 min，其中SW-ice處理組設(shè)為對照組.

1.2.2PAW-ice處理染菌三文魚片 因處理三文魚片所需的冰較多，考慮到PAW-ice的制備成本，選用PAW-ice2用于后續(xù)實驗.將人工染菌的三文魚片分別置于1 500 mL PAW-ice(分3批制備，每批500 mL)和SW-ice上，每組5片，置于4 ℃保存5天，貯藏期間保證冰盒中的冰每天更換一次，其中SW-ice處理組設(shè)為對照組.

1.3 發(fā)射光譜診斷等離子體中的活性物質(zhì)

發(fā)射光譜法(optical emission spectrum, OES)是診斷等離子體中活性物質(zhì)的常用方法[10].采用光譜儀(AvaSpec-2048-8, Avantes, 荷蘭)檢測等離子體在100～900 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜信號.

1.4 PAW-ice主要理化特性測定

本研究通過測定ORP、pH值和電導(dǎo)率來評估PAW-ice的物理化學(xué)特性.將制備好的PAW-ice在50 ℃水浴鍋中快速融化，采用pH/ORP測量儀(Mettler-Toledo, LE501, 瑞士)和電導(dǎo)率儀(DDB-303A，上海雷磁)對剛制備好的PAW-ice的ORP、pH值及電導(dǎo)率進(jìn)行即時檢測.

1.5 PAW-ice的殺菌效果測定

采用平板菌落計數(shù)法對細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行測定.純培養(yǎng)單增李斯特菌殺菌效果評價：PAW-ice對細(xì)菌懸液處理結(jié)束后立即將混合物置于40 ℃水浴鍋中融化2 min，取100 μL混合液用無菌水進(jìn)行稀釋涂布、計數(shù).每組3個平行實驗，結(jié)果以菌落總數(shù)的對數(shù)lg CFU/mL表示.

人工染菌三文魚片殺菌效果評價：PAW-ice處理染菌三文魚片5天，期間每天同一時間點取5 g三文魚片于無菌均質(zhì)袋中，加入45 mL無菌水，用均質(zhì)器處理3 min，制成勻漿液，然后取100 μL勻漿液用無菌水進(jìn)行稀釋涂布、計數(shù).每個時間點5個平行實驗，結(jié)果以菌落總數(shù)的對數(shù)lg CFU/g表示.

1.6 三文魚總揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)測定

總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)是評價魚類品質(zhì)的重要指標(biāo).本實驗采用Lin等的方法測定三文魚的TVB-N含量[11].每個時間點5個平行實驗，結(jié)果以mg N/100 g表示.

1.7 三文魚pH測定

取5 g三文魚片剪碎，加入90 mL蒸餾水漩渦震蕩15 min后靜置5 min，過濾后測定濾液pH.

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗指標(biāo)進(jìn)行3次獨立重復(fù)實驗.數(shù)據(jù)以平均值±方差表示，并采用分析軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.冰的ORP、電導(dǎo)率、pH值、純培養(yǎng)單增李斯特菌數(shù)以及同一處理組在不同貯藏時間的三文魚表面單增李斯特菌數(shù)、魚片pH值、TVB-N值數(shù)據(jù)的分析方法為Student-Newman-Keul’s法，P≤0.05表示數(shù)據(jù)間具有顯著性差異；不同處理組在相同貯藏時間的三文魚表面單增李斯特菌數(shù)量、魚片TVB-N值、pH值數(shù)據(jù)的分析方法為配對t檢驗(paired-samplet-test)，顯著性差異表示為*P≤0.05、**P≤0.01、***P≤0.001.實驗數(shù)據(jù)圖均采用Origin 8.0作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)射光譜診斷等離子體活性成分結(jié)果

圖1 空氣等離子體放電的發(fā)射光譜圖.Fig.1 End-on optical emission spectra of air plasma discharge

2.2 PAW-ice物理化學(xué)性質(zhì)檢測結(jié)果

強氧化性(高ORP值)可以破壞細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)菌的氧化損傷[10]，因此ORP是評估PAW-ice是否具有殺菌能力的一個重要指標(biāo).如圖2(a)所示，最初SW-ice的ORP為187 mV，經(jīng)過等離子體處理后，PAW-ice1、PAW-ice2、PAW-ice3的ORP分別顯著上升至539 mV、571 mV、575 mV(P≤0.05)，呈現(xiàn)強氧化性.其次，隨著PAW制備時間延長，PAW-ice3的ORP僅略高于PAW-ice2，兩者并沒有顯著差異(P>0.05)，這說明對于500 mL制備體系而言，PAW-ice中的氧化性物質(zhì)在等離子體處理30 min后就會達(dá)到飽和水平.

如圖2(b)所示，SW-ice的pH值為6.72，經(jīng)過等離子體處理后，PAW-ice1、PAW-ice2、PAW-ice3的pH值分別顯著下降至2.32、2.91、2.60(P≤ 0.05).推測pH降低主要是由于大氣壓低溫等離子體中帶正電荷的離子與水分子發(fā)生置換反應(yīng)產(chǎn)生H+(M++H2O→H2O++M;H2O++H2O→H+(H2O)+·OH)[15]或者由于以空氣為工作氣體產(chǎn)生硝酸和亞硝酸等酸性物質(zhì)[14].對于相同的等離子體處理時間(PAW-ice1、PAW-ice2)，隨著PAW-ice制備體積增大，PAW-ice的pH值顯著提高(P≤0.05)，說明增大制備體積會導(dǎo)致酸性物質(zhì)濃度降低；對于相同的制備體積(PAW-ice2、PAW-ice3)，隨著等離子體處理時間的延長，PAW-ice的pH值顯著降低(P≤0.05)，說明酸性物質(zhì)含量隨著處理時間的增加而累積.

電導(dǎo)率能反應(yīng)溶液傳導(dǎo)電流的能力，溶液中的帶電離子越多，電導(dǎo)率越大[8].如圖2(c)所示，與SW-ice(電導(dǎo)率為1.96 μS/cm)相比，PAW-ice1、PAW-ice2、PAW-ice3的電導(dǎo)率均顯著上升至2.8 mS/cm、0.58 mS/cm、1.6 mS/cm(P≤0.05).此結(jié)果表明大氣壓低溫等離子體在PAW-ice中產(chǎn)生大量帶電離子，推測這些帶電離子可能是由于水分子和自由電子或帶電粒子相互作用產(chǎn)生RONS或其他活性成分，在PAW-ice殺菌過程中發(fā)揮重要作用.對于相同的制備體積，PAW-ice3電導(dǎo)率明顯高于PAW-ice2(P≤0.05)，說明隨著處理時間的增加，帶電離子在PAW-ice中不斷積累；對于相同的制備時間，PAW-ice1電導(dǎo)率明顯高于PAW-ice2(P≤0.05)，說明隨著處理體積的增大，PAW-ice中的帶電離子濃度降低.

A～D表示不同處理組數(shù)值具有顯著性差異(P≤0.05).圖2 不同處理組氧化還原電位、pH、電導(dǎo)率的數(shù)值Fig.2 The values of ORP, pH and electrical conductivity in different groups

2.3 PAW-ice對單增李斯特菌的殺菌效果

2.3.1PAW-ice對純培養(yǎng)李斯特菌的殺菌效果 單增李斯特菌經(jīng)過不同處理組(SW-ice、PAW-ice1、PAW-ice2、PAW-ice3)處理不同時間(0 min、5 min、15 min、30 min)的菌落總數(shù)結(jié)果如圖3所示.菌落的初始數(shù)量為6.2 lg CFU/mL，SW-ice處理5 min后，菌落數(shù)量下降至6.0 lg CFU/mL.隨著處理時間的延長，菌落數(shù)量幾乎維持不變(P>0.05)，表明冰提供的低溫環(huán)境并不能有效抑制細(xì)菌生長.但經(jīng)PAW-ice處理后的細(xì)菌總數(shù)可以降低1～3 lg CFU/mL，顯著低于SW-ice組(P≤0.05)，說明PAW-ice對單增李斯特菌的殺菌效果主要是因為PAW具有較強的殺菌性能，而非冰提供的低溫環(huán)境.

對于PAW-ice2、PAW-ice3組，與細(xì)菌作用5 min后，菌落數(shù)分別降低至5.2 lg CFU/mL和4.9 lg CFU/mL，具有顯著性差異(P≤0.05).但隨著處理時間增加，菌落總數(shù)維持不變(P>0.05).說明兩者殺菌效果接近，且與細(xì)菌作用5 min后，PAW-ice的殺菌成分耗盡，因此殺菌效率并未隨處理時間的增加而提高.

對于PAW-ice1組，細(xì)菌總量隨處理時間的增加而顯著下降(P≤0.05)，在5 min、15 min、30 min處的細(xì)菌數(shù)量分別為4.7 lg CFU/mL、4.1 lg CFU/mL、3.3 lg CFU/mL.因此，PAW-ice處理時間相同時，PAW-ice1的殺菌效率顯著高于PAW-ice2、PAW-ice3的殺菌效率(P≤0.05).推測可能是由于PAW-ice1的pH值與電導(dǎo)率明顯高于PAW-ice2、PAW-ice3(圖2(b)、(c))，說明pH值與電導(dǎo)率是評估PAW-ice殺菌效率的重要指標(biāo).

以上結(jié)果表明PAW-ice對單增李斯特菌具有較強的殺菌效果，其殺菌效率依賴于PAW的制備體積、制備時間和PAW-ice與細(xì)菌的作用時間.PAW制備體積越小、制備時間越長，PAW-ice處理細(xì)菌越久，PAW-ice的殺菌效果越好，這為PAW-ice在今后的殺菌應(yīng)用提供了理論參考.

鑒于研究PAW-ice對接種于三文魚片表面單增李斯特菌的殺菌效果需要制備大量的PAW-ice，因此采用大的制備體積(PAW-ice2、PAW-ice3)將會更加節(jié)能，并且PAW-ice2、PAW-ice3在5 min時能夠降低1 lg CFU/mL(殺菌率為90%)，在實際應(yīng)用中也是具有價值的；此外PAW-ice2與PAW-ice3的殺菌效率接近，因此選用短的制備時間(PAW-ice2)將會更加節(jié)能.綜合以上兩點，在接下來研究PAW-ice對接種于三文魚片表面單增李斯特菌殺菌效果及三文魚片在冷藏過程中TVB-N與pH值的影響時均采用PAW-ice2.

2.3.2PAW-ice對接種于三文魚片表面單增李斯特菌的殺菌效果 圖4為兩組三文魚片在4 ℃貯藏5天過程中單增李斯特菌菌落總數(shù)的變化情況.兩組三文魚片單增李斯特菌數(shù)量初始值為2.7 lg CFU/mL.隨著貯藏時間的延長，SW-ice處理組單增李斯特菌數(shù)量顯著提高(P≤0.05)，到第5天時，菌落總數(shù)已經(jīng)達(dá)到5.1 lg CFU/mL.PAW-ice處理組單增李斯特菌數(shù)量在前3天緩慢下降至2.5 lg CFU/mL，之后顯著提高(P≤0.05)，到第5天時，菌落總數(shù)為3.6 lg CFU/mL，遠(yuǎn)低于SW-ice組(P≤0.001).此結(jié)果表明，PAW-ice對接種于三文魚片表面的單增李斯特菌也有很好的殺菌效果，在5天的貯藏時間內(nèi)，能夠有效抑制細(xì)菌增殖.

a～d表示在相同處理時間下不同處理組的殺菌效率具有顯著性差異(P≤0.05)；A～D表示在相同處理組中不同處理時間的殺菌效率具有顯著性差異(P≤0.05).圖3 PAW-ice對純培養(yǎng)的單增李斯特菌殺菌效率Fig.3 PAW-ice inactivation efficacy against pure cultured L.monocytogenes

A～F表示在相同處理組中不同貯藏時間的殺菌效率具有顯著性差異(P≤0.05).在相同的貯藏時間下，PAW-ice與SW-ice的數(shù)據(jù)顯著性差異表示為*P≤0.05、** P≤0.01、*** P≤0.001.圖4 PAW-ice對接種于三文魚片表面單增李斯特菌在4 ℃、5天貯藏過程中的殺菌效果Fig.4 PAW-ice inactivation efficacy against L.monocytogenes inoculated on salmon strips during storage at 4 ℃ for 5 days

2.4 PAW-ice對三文魚片總揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的影響

在微生物和內(nèi)源酶的作用下，蛋白質(zhì)被分解為三甲胺、二甲胺、氨、氮類及其他堿性小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)統(tǒng)稱為揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)[16].三文魚片在4 ℃貯藏5天過程中TVB-N值的變化情況如圖5所示.兩組三文魚片TVB-N的初始值為5.77 mg N/100 g，隨著貯藏時間的延長，兩組TVB-N值均呈現(xiàn)上升趨勢(P≤0.05)，但PAW-ice組TVB-N值始終低于SW-ice組，主要是PAW-ice能有效抑制三文魚表面單增李斯特菌的增殖，從而減少微生物對蛋白質(zhì)的分解.到第5天時，SW-ice組的TVB-N值為13.2 mg N/100 g，而PAW-ice組則遠(yuǎn)低于SW-ice組(P≤0.01)，為8.43 mg N/100 g，仍屬于一級鮮度[17].此結(jié)果表明，PAW-ice可以顯著減少三文魚片中TVB-N的形成，提高三文魚的新鮮程度.

2.5 PAW-ice對三文魚片pH值的影響

pH值是評判魚肉品質(zhì)高低的重要指標(biāo)之一，魚肉的腐敗程度和pH值成正比[16].兩組三文魚片在4 ℃貯藏5天過程中pH值的變化情況如圖6所示，隨著貯藏時間的延長，樣品pH值呈現(xiàn)增長趨勢(P≤0.05).結(jié)合TVB-N的結(jié)果分析可知，這主要是由于隨著貯藏時間的延長，細(xì)菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨和胺類等堿性物質(zhì)使pH值升高.由于PAW-ice起到抑制細(xì)菌繁殖的作用，使得PAW-ice組的pH值整體顯著低于SW-ice組(P≤0.001).這與龐彩霞[18]等用銀杏葉提取物處理金線魚魚丸后pH值的變化結(jié)果相似.

3 結(jié)論

人們對水產(chǎn)品品質(zhì)和安全性的要求越來越高，目前常用的低溫貯藏等方法已不能滿足水產(chǎn)品加工保鮮的要求.因此，本文首次提出了一種新型冷殺菌保鮮技術(shù)——大氣壓低溫等離子體活化水冰(PAW-ice)，并研究了PAW-ice對純培養(yǎng)與接種于三文魚片表面單增李斯特菌的殺菌效果，以及對在冷藏過程中的三文魚片TVB-N及pH值的影響.結(jié)果表明：PAW-ice能夠有效殺滅單增李斯特菌，其殺菌效率與PAW的制備時間、制備體積以及PAW-ice處理時間密切相關(guān)；其次，PAW-ice能夠有效抑制接種于三文魚片表面單增李斯特菌的生長繁殖，同時顯著減緩三文魚片pH值、TVB-N值的升高，提高三文魚片的新鮮程度.因此，PAW-ice有望成為一種應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域的新型殺菌技術(shù).本研究僅對PAW-ice在水產(chǎn)品殺菌領(lǐng)域進(jìn)行初步探索，今后將對PAW-ice殺菌機理、PAW-ice對水產(chǎn)品感官品質(zhì)以及營養(yǎng)成分的影響進(jìn)一步探索，并研發(fā)適用于大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的大氣壓低溫等離子體裝置，從而加快PAW-ice在食品工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)程.

A～E在表示在相同處理組中不同貯藏時間的TVB-N值具有顯著性差異(P≤0.05).在相同的貯藏時間下，PAW-ice與SW-ice的數(shù)據(jù)顯著性差異表示為*P≤0.05、** P≤0.01、***P≤0.001.圖5 PAW-ice對三文魚片在4 ℃、5天貯藏過程中TVB-N值的影響Fig.5 Effects of PAW-ice treatments on TVB-N value of salmon strips during storage at 4 ℃ for 5 days

A～D表示在相同處理組中不同貯藏時間的pH值具有顯著性差異(P≤0.05).在相同的貯藏時間下，PAW-ice與SW-ice的數(shù)據(jù)顯著性差異表示為*P≤0.05、** P≤0.01、*** P≤0.001.圖6 PAW-ice對三文魚片在4℃、5天貯藏過程中pH值的影響Fig.6 Effects of PAW-ice treatments on pH value of salmon strips during storage at 4 ℃ for 5 days