人類輔助生殖技術(shù)中評估胚胎發(fā)育潛能的四種方法

王浩原，王崴然，白春梅，劉甜甜，土增榮

(山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030000)

自1978年世界首例試管嬰兒誕生以來，行體外受精(IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕治療的不孕癥患者逐年增多。據(jù)人類受精和胚胎學(xué)管理局統(tǒng)計，1991年至2019年歐洲行IVF/ICSI-ET治療的周期數(shù)目從6 700個增加到69 000個，已有超過39萬例嬰兒通過輔助生殖技術(shù)(ART)出生。但是，截止到2019年IVF的妊娠率最高只有32%左右[1]，許多患者需接受多次IVF治療才能成功妊娠，這不僅增加了患者的精神和經(jīng)濟(jì)成本，也增加了一定的健康風(fēng)險。選擇性單胚胎移植(eSET)可較大程度改善IVF妊娠結(jié)局，避免多胎妊娠的發(fā)生[2]，并降低患者的經(jīng)濟(jì)費(fèi)用及社會負(fù)擔(dān)，緩解患者心理壓力。因此，如何高質(zhì)量的選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，以最少備孕時間獲得健康新生兒成為目前亟待解決的重要問題。隨著eSET大范圍的推廣，需要快速、精確、無創(chuàng)、簡便、實(shí)用、低成本、低樣本需求量、低檢測限的胚胎發(fā)育潛能評估方法。本文對胚胎形態(tài)學(xué)觀察、胚胎活檢、囊胚液檢測、胚胎培養(yǎng)基檢測等人類胚胎發(fā)育潛能評估方法作以下綜述。

一、胚胎形態(tài)學(xué)觀察方法及其特點(diǎn)

胚胎形態(tài)學(xué)觀察是指通過顯微鏡對胚胎的形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，主要觀察胚胎的形態(tài)特征和發(fā)育速率，自ART技術(shù)誕生后該技術(shù)被用于選擇優(yōu)質(zhì)移植胚胎。

1.胚胎形態(tài)學(xué)觀察方法：(1)傳統(tǒng)顯微鏡觀察。在胚胎的整個體外孵化期間內(nèi)，于特定的時間點(diǎn)將胚胎從培養(yǎng)箱的受控環(huán)境中移出，并在光學(xué)顯微鏡下評估胚胎發(fā)育的形態(tài)特征(圖1)。胚胎的靜態(tài)觀察階段主要包括受精卵、卵裂期和囊胚期，主要觀察指標(biāo)包括數(shù)量、大小、均一性、碎片比例、胞漿顏色、卵周間隙、多核現(xiàn)象、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)等。(2)延時成像(TLI)監(jiān)測系統(tǒng)。TLI監(jiān)測系統(tǒng)通常由標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱和集數(shù)碼相機(jī)于一體的顯微鏡組成，它能夠自動定時收集圖像并形成動態(tài)影像，可以收集大量的卵裂時間、卵裂模式、卵裂同步性等傳統(tǒng)顯微鏡無法記錄的胚胎發(fā)育動力學(xué)數(shù)據(jù)，TLI在一定程度上優(yōu)于傳統(tǒng)靜態(tài)顯微鏡觀察。Coticchio等[3]運(yùn)用TLI深入研究受精過程及受精錐、胞質(zhì)波、原核出現(xiàn)消失時間和位置移動等。通過TLI人們還發(fā)現(xiàn)了直接卵裂和逆卵裂等異常卵裂模式，比較發(fā)現(xiàn)直接卵裂胚胎的種植率顯著優(yōu)于逆卵裂胚胎，但仍顯著低于正常卵裂胚胎[4]。有研究表明，異常卵裂胚胎的整倍體率及活產(chǎn)率均顯著低于正常卵裂胚胎，因此，建議異常卵裂胚胎應(yīng)進(jìn)行非整倍體胚胎著床前遺傳學(xué)檢測(PGT-A)[5]。(3)人工智能(AI)系統(tǒng)。目前，TLI系統(tǒng)越來越多地利用先進(jìn)的計算技術(shù)進(jìn)行視覺靜態(tài)圖像處理，并開發(fā)出基于AI的胚胎發(fā)育潛能預(yù)測模型，提出以算法作為胚胎分類的工具，提高無創(chuàng)選擇正常胚胎的概率[6]。AI的優(yōu)點(diǎn)是它們評價體系穩(wěn)定，不會受到不同胚胎學(xué)家之間評估偏差的影響[2]。Bormann等[7]開發(fā)的AI系統(tǒng)，在9例病人的742枚胚胎中進(jìn)行選擇發(fā)育潛能較高的胚胎，準(zhǔn)確率可達(dá)到90%，AI系統(tǒng)的準(zhǔn)確率顯著優(yōu)于來自5個不同機(jī)構(gòu)的15名胚胎學(xué)家的評估結(jié)果。

圖1 胚胎發(fā)育潛能的形態(tài)示意圖

2.胚胎形態(tài)學(xué)觀察的干擾因素：形態(tài)學(xué)觀察方法的主要干擾因素是觀察者的主觀性。Paternot等[8]集結(jié)了4個ART中心的5位胚胎學(xué)家，每位胚胎學(xué)家針對不同發(fā)育階段胚胎圖片進(jìn)行獨(dú)立的評估和決策，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾位學(xué)家評估的多項指標(biāo)的一致性較差。由于胚胎學(xué)家對形態(tài)學(xué)分類的主觀認(rèn)識存在差異，使得觀察者間的評估差異也很大[9]。TLI結(jié)合AI通過自動圖像分析可以識別62%的卵裂胚和71.8%的囊胚，識別假陽性率為28.2%，以上結(jié)果證明雖然AI能夠提高胚胎發(fā)育潛能評價的客觀性和一致性，但是，就目前階段該技術(shù)只能作為人工檢查的補(bǔ)充[10]，胚胎形態(tài)學(xué)觀察依舊存在主觀干擾的影響。

3.胚胎形態(tài)學(xué)觀察的利弊：由于人類胚胎發(fā)育遵循特定的時間規(guī)律，而形態(tài)學(xué)觀察以發(fā)育階段為基礎(chǔ)，因此形態(tài)學(xué)觀察在一定程度上能夠識別具有優(yōu)質(zhì)發(fā)育潛能的胚胎，通過這種方法篩選胚胎可以使妊娠率有顯著提高[11]。目前胚胎評估的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是使用顯微鏡技術(shù)在胚胎發(fā)育特定階段進(jìn)行靜態(tài)觀察[2]。然而，形態(tài)學(xué)觀察評估胚胎發(fā)育潛能的方法目前仍然主要是依靠人工進(jìn)行的，具有觀察的時間依賴性和分類的潛在主觀性[12]，此為其主要劣勢。

4.胚胎形態(tài)學(xué)觀察的安全性：盡管形態(tài)學(xué)觀察對胚胎安全性影響較小，并且礦物油能夠在一定程度上減輕環(huán)境變化對胚胎的影響。但大量研究表明，反復(fù)將胚胎從培養(yǎng)箱中取出，開箱后溫度、濕度、燈光、氣體濃度、pH等因素發(fā)生變化，可獨(dú)立于對胚胎倍性的影響而干擾胚胎生化、代謝和表觀遺傳[13-14]。

二、胚胎活檢技術(shù)及其特點(diǎn)

胚胎活檢是指獲取胚胎細(xì)胞并進(jìn)行胚胎著床前遺傳學(xué)檢測(PGT)，包括極體活檢、卵裂球活檢和TE活檢，分析胚胎細(xì)胞DNA并進(jìn)行人類白細(xì)胞抗原(HLA)分型或基因異常檢測，如PGT-A、單基因病胚胎著床前遺傳學(xué)檢測(PGT-M)以及染色體結(jié)構(gòu)重排胚胎著床前遺傳學(xué)檢測[15]。

1.胚胎活檢技術(shù)：(1)極體活檢。與其他細(xì)胞活檢的方法相比，極體活檢侵入性更小，無嵌合體干擾，但是極體沒有提供胚胎遺傳物質(zhì)中關(guān)于父方的信息，且因需要檢測大量不成熟卵母細(xì)胞而浪費(fèi)勞力[16]。(2)卵裂球活檢。卵裂球活檢的方法是去除卵裂期胚胎的1～2個卵裂球進(jìn)行PGT，因?yàn)檫@一時期的胚胎細(xì)胞通常被認(rèn)為具有細(xì)胞全能性，即可以獨(dú)自發(fā)育成一個完整的個體，具有高度的發(fā)育可塑性，能夠耐受細(xì)胞移除的操作[16]。然而，胚胎在最開始的3次有絲分裂中最易發(fā)生錯誤[17]，50%～80%卵裂期胚胎具有1個或者多個非整倍體卵裂球[18]，此時活檢不僅對檢測結(jié)果的影響較大，且胚胎存在產(chǎn)生神經(jīng)退行性疾病和表觀遺傳改變等風(fēng)險[16]。(3)TE活檢。TE活檢是目前PGT的主要檢測方法，通常是在胚胎發(fā)育的第5、6天對5～10個TE進(jìn)行活檢。TE活檢與卵裂球活檢相比，能在去除相對較低胚胎質(zhì)量等級的情況下獲得較多的遺傳物質(zhì)以供檢測，因而具有更強(qiáng)的恢復(fù)能力且更耐受顯微操作過程的影響[16]，使得每個周期可移植的整倍體胚胎數(shù)目更多，累積活產(chǎn)率更高[19]。

2.胚胎活檢技術(shù)的干擾因素：胚胎活檢主要受到嵌合體和等位基因脫扣(ADO)的干擾。嵌合體定義為胚胎中產(chǎn)生一個以上具有不同核型細(xì)胞群的狀態(tài)[15]。行IVF時卵裂期和囊胚期胚胎中嵌合體發(fā)生率分別高達(dá)70%和90%[20]，但是在臨床中，囊胚嵌合體只能根據(jù)一次TE活檢的結(jié)果進(jìn)行診斷，再加上由于抽樣誤差的存在，真實(shí)嵌合體發(fā)生率仍可能被低估。從移植結(jié)果來看，嵌合體或節(jié)段嵌合體胚胎確實(shí)有一定程度的發(fā)育潛力和健康活產(chǎn)案例，但與整倍體胚胎相比其移植率顯著降低、流產(chǎn)率顯著升高。一般來說，PGT檢測發(fā)現(xiàn)嵌合體發(fā)生率小于40%時，胚胎移植成功率較高；嵌合體發(fā)生率40%～80%時，胚胎移植成功率較低；如果PGT檢測發(fā)現(xiàn)存在1條以上復(fù)雜嵌合染色體時，胚胎移植成功率最低[21]。ADO干擾定義為雜合細(xì)胞的兩個等位基因中的一個在PCR后擴(kuò)增失敗，單個細(xì)胞的分析具有很高的基因分型錯誤率。在極端情況下，40%的PGT擴(kuò)增都存在ADO[22]。TE活檢中DNA數(shù)量高于卵裂球活檢，從而降低了TE活檢的擴(kuò)增失敗率和ADO風(fēng)險。

3.胚胎活檢技術(shù)的利弊：胚胎活檢是目前評估胚胎發(fā)育潛能的最佳指標(biāo)，多年來研究表明，以此方法評估胚胎發(fā)育潛能后進(jìn)行eSET的總體植入率顯著升高[23]。但是，這種方法需要購買和維護(hù)價格昂貴的專業(yè)設(shè)備，需要聘請和培訓(xùn)技藝精湛的胚胎學(xué)家和相關(guān)人員，易受限于每天所能檢測的最大數(shù)量，導(dǎo)致一些機(jī)構(gòu)可能無法開展PGT[16]。胚胎活檢這種有創(chuàng)性操作的安全性，以及嵌合體和ADO對檢測結(jié)果造成的干擾，都是胚胎活檢的主要劣勢因素。

4.胚胎活檢技術(shù)的安全性：目前仍缺乏關(guān)于人類胚胎活檢生物安全性的長期隨訪數(shù)據(jù)[24]，早期胚胎發(fā)育未完全破解，過多的人為干預(yù)可能反而會損害胚胎發(fā)育潛能。胚胎活檢技術(shù)基礎(chǔ)依賴于活檢細(xì)胞的遺傳物質(zhì)能夠代表整個胚胎[25]，但是TE活檢沒有直接檢測ICM細(xì)胞，活檢細(xì)胞代表性的問題將不可避免地導(dǎo)致假陽性和假陰性的產(chǎn)生[24]。TE活檢的假陽性結(jié)果可能高達(dá)40%，導(dǎo)致原本可以正常出生的胚胎被丟棄[26]，假陰性結(jié)果也可能導(dǎo)致移植失敗甚至孕育不正常的胎兒，從而給家庭和社會帶來重大影響。

三、囊胚液檢測技術(shù)及其特點(diǎn)

囊胚液檢測技術(shù)分為取樣和檢測兩部分，囊胚液取樣過程又稱囊胚穿刺術(shù)，是將1個ICSI移液管穿過位于囊胚ICM對側(cè)的滋養(yǎng)外胚層，仔細(xì)抽出囊胚液致囊胚腔完全皺縮[27](圖2)，從而分離出0.01 μl左右的囊胚液[28]，然后將獲得囊胚液用于檢測蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)和代謝物質(zhì)來評估胚胎發(fā)育潛能。

圖2 囊胚穿刺術(shù)獲得囊胚液示意圖

1.囊胚液檢測技術(shù)：(1)囊胚液檢測蛋白質(zhì)。Poli 等[11]利用囊胚液檢測技術(shù)從每個囊胚腔中提取4～6 nl囊胚液，通過串聯(lián)質(zhì)譜檢測到288種蛋白質(zhì)，其中182種為囊胚來源蛋白，并且發(fā)現(xiàn)囊胚液中H2A和GAPDH水平能夠預(yù)測胚胎核型，其準(zhǔn)確性為100%。以上研究證明，使用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以在單個囊胚液中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定量檢測，囊胚中靶蛋白的豐富度與整個胚胎的染色體狀態(tài)之間存在潛在關(guān)聯(lián)。(2)囊胚液檢測遺傳物質(zhì)。在囊胚液中的胚胎源性DNA能夠提供適合遺傳分析的DNA模板[16]。研究表明，在整倍體方面，囊胚液檢測與TE活檢、全囊胚活檢、極體活檢和卵裂球活檢的一致率分別為97.4%、100%、93.3%和100%；在單條染色體方面，囊胚液檢測與TE活檢、全囊胚活檢、極體活檢和卵裂球活檢的一致率分別為96.6%、98.1%、93.5和94%[29]，說明囊胚液是一種很有前途的PGT替代來源。(3)囊胚液檢測代謝物質(zhì)。人們已經(jīng)可以利用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)從低至5 nl的囊胚液中高靈敏度檢測出乳酸、葡糖-6-磷酸、酮戊二酸、磷酸葡萄糖酸三鈉鹽、谷氨酸、ATP、NAD+、NADH、NADPH等代謝產(chǎn)物，囊胚液的代謝產(chǎn)物檢測可以成為評估胚胎發(fā)育潛能的輔助工具[27]。

2.囊胚液檢測技術(shù)的干擾因素：囊胚液檢測的檢測量較小且容易被穿刺、降解和污染所干擾。據(jù)報告顯示，囊胚液樣品體積從0.3 nl(純囊胚液)到1 μl(包括培養(yǎng)基或其他液體)不等[16]，可用于檢測的體積過小，檢測難度顯著升高。囊胚液污染的來源可能是漂浮的ICM或TE細(xì)胞碎片，也可能是穿刺引入的TE細(xì)胞質(zhì)[11]。此外，Capalbo等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在行PGT-M檢測時囊胚液檢測和TE活檢的一致性很低，這可能是由于受到來自母系的卵丘細(xì)胞或極體的DNA被污染所引起的。這些都需要人們優(yōu)化分離技術(shù)，解決擴(kuò)增難題，使囊胚液檢測常規(guī)化成為可能。

3.囊胚液檢測技術(shù)的利弊：隨著冷凍囊胚技術(shù)的普及，囊胚液檢測可伴隨囊胚冷凍進(jìn)行，副產(chǎn)物囊胚液的收集無需額外操作，與胚胎活檢技術(shù)相比，節(jié)省人員培訓(xùn)周期，費(fèi)用更少，較易開展普及。囊胚腔內(nèi)有ICM，外被單層的TE細(xì)胞，可與外界環(huán)境隔開，是胚胎分泌和代謝物質(zhì)釋放和積累的獨(dú)立空間，且分子轉(zhuǎn)運(yùn)受到高度調(diào)控[11]，受外界干擾較小。但是至今沒有長期隨訪數(shù)據(jù)證明囊胚液檢測的安全性，且由于囊胚液樣本量過小增加了檢測難度和誤差幾率[31]，這是其主要的劣勢因素。

4.囊胚液檢測技術(shù)的安全性：理論上吸出囊胚液對囊胚無害且操作簡便，皺縮囊腔是囊胚玻璃化冷凍前提高胚胎復(fù)蘇率的常規(guī)措施。但是，獲取囊胚液需要推遲胚胎移植，同樣存在一些缺點(diǎn)。首先，體外環(huán)境不如體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，可能導(dǎo)致一些在卵裂階段移植成功的胚胎在培養(yǎng)過程中不能形成囊胚，減少可移植胚胎數(shù)量；其次，在體外培養(yǎng)環(huán)境下發(fā)生胚胎基因組激活，可能會對胚胎造成潛在影響，導(dǎo)致表觀遺傳改變或產(chǎn)生同卵雙生等[32]。為實(shí)施囊胚液檢測而特意冒風(fēng)險推遲胚胎移植的策略是否最終有利于活產(chǎn)率提升尚需證明。此外，與囊胚液穿刺技術(shù)相比，使用激光脈沖對于囊胚皺縮可以顯著提高移植率、生化妊娠率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率[33]。因而，還需進(jìn)一步研究囊胚液檢測所能提高的胚胎選擇效率與微侵入操作和延長培養(yǎng)時間導(dǎo)致的胚胎潛在傷害，綜合分析囊胚液檢測技術(shù)是否可以提高ART成功率。

四、培養(yǎng)基檢測技術(shù)及其特點(diǎn)

培養(yǎng)基檢測技術(shù)指在胚胎體外培養(yǎng)過程中，收集被更換的培養(yǎng)基部分，以檢測蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)和代謝物質(zhì)來評估胚胎發(fā)育潛能，廣義上包括非更換培養(yǎng)基時間段獲取的培養(yǎng)基用于檢測[13]。

1.培養(yǎng)基檢測技術(shù)：(1)培養(yǎng)基檢測蛋白質(zhì)。Bori等[34]利用距離擴(kuò)展分析技術(shù)從1 μl的培養(yǎng)基中檢測出了92種蛋白，其中IL-6、uPA和IL-8與妊娠結(jié)局顯著相關(guān)。Montskó 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與僅使用形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)相比，利用培養(yǎng)基檢測技術(shù)與形態(tài)學(xué)觀察相結(jié)合的胚胎發(fā)育評估方法可以顯著降低假陽性率并提高妊娠率。新發(fā)現(xiàn)的培養(yǎng)基檢測指標(biāo)包括可溶性的白細(xì)胞抗原-G、載脂蛋白A1、胰島素樣生長因子、血小板活性因子及白細(xì)胞介素等，但其能否真正提高胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測能力仍存在爭議[12-13]。(2)培養(yǎng)基檢測遺傳物質(zhì)。培養(yǎng)基比囊胚液存在更多的DNA，可以作為真正意義上的非侵入性基因檢測手段的材料來源[31]。而對于人們關(guān)注的嵌合體干擾，Leaver等[16]認(rèn)為，培養(yǎng)基是整個胚胎的一個更有代表性的樣本，它排除了人類胚胎鑲嵌現(xiàn)象的干擾。Pais等[36]通過飛行時間質(zhì)譜在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了整倍體與非整倍體的特征性基因頻譜，這是快速評估胚胎發(fā)育潛能方法的又一突破。研究表明，培養(yǎng)基檢測結(jié)合TE活檢與常規(guī)TE活檢在整倍體方面的一致率分別為87.2%和85.0%，在染色體方面的一致率分別為98.8%和98.3%[37]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，利用培養(yǎng)基進(jìn)行PGT-A鑒定50個整倍體胚胎在移植后有27個胚胎能夠正常發(fā)育并成功分娩[38]。(3)培養(yǎng)基檢測代謝物質(zhì)。Ribeiro等[39]利用微流控芯片電泳質(zhì)譜法，能夠在2 min內(nèi)分離出16種氨基酸，并同時可進(jìn)行胚胎培養(yǎng)狀態(tài)的監(jiān)測與評估。研究發(fā)現(xiàn)，與非妊娠組相比，妊娠組培養(yǎng)基中丙酮酸濃度顯著增高，乳酸濃度顯著降低，并且培養(yǎng)基中丙酮酸濃度對預(yù)測妊娠的敏感性為90.9%，特異性為75%[40]。不僅如此，人們還發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)胚胎的表觀遺傳狀態(tài)在培養(yǎng)基中的代謝變化有可能預(yù)示未來子代的健康[41]。

2.培養(yǎng)基檢測技術(shù)的干擾因素：培養(yǎng)基檢測方法易受樣本量、商品化培養(yǎng)基組分、擴(kuò)增和污染等因素干擾，評估胚胎發(fā)育潛能時應(yīng)該綜合考量。(1)樣本量。ART中胚胎培養(yǎng)基體積為10～50 μl，胚胎分泌蛋白濃度一般小于1 pg/ml，因而只能利用擴(kuò)增方法檢測培養(yǎng)基的核酸，而檢測蛋白質(zhì)的難度較大[42]。最常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)要求樣本容量至少需為50 μl，然而常規(guī)單個胚胎的培養(yǎng)基僅為5～20 μl，所以部分實(shí)驗(yàn)室將數(shù)個胚胎的培養(yǎng)基合并以獲得足夠的樣本量，但這樣得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能是平均值，這對統(tǒng)計妊娠結(jié)局有不小的難度。此外，有的實(shí)驗(yàn)室通過稀釋培養(yǎng)基來獲得足夠的樣本量，但這樣對于檢測方法精度的要求就隨之增加[43]。(2)商品化培養(yǎng)基組分?，F(xiàn)有的商品化培養(yǎng)基的組分可能會顯著影響以培養(yǎng)基為媒介評估胚胎發(fā)育潛能的檢測方法。Dyrlund等[12]檢測了3個不同供應(yīng)商提供的8種胚胎培養(yǎng)基組分發(fā)現(xiàn)，除了培養(yǎng)基說明書中證實(shí)添加的人血清白蛋白(HSA)外，還檢測到110種蛋白質(zhì)，其中8種曾被誤認(rèn)為是胚胎自身產(chǎn)生的，但實(shí)際這幾種蛋白質(zhì)很有可能是伴隨HSA添加到胚胎培養(yǎng)基中的。不同批次的胚胎培養(yǎng)基間伴隨HSA添加到胚胎培養(yǎng)基中的Afamin和Haptoglobin這兩種蛋白的添加量相差70%和95%，這很容易誤導(dǎo)檢測結(jié)果。(3)擴(kuò)增和污染。Hanson等[44]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的擴(kuò)增失敗率為37.3%，而Li等[37]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基擴(kuò)增成功率高達(dá)97.6%，培養(yǎng)基擴(kuò)增成功率間的差異可能是由于實(shí)驗(yàn)方法及技術(shù)不同所致，也可能由于培養(yǎng)基中的DNA數(shù)量較少或被降解所致[31]。Lledo等[45]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基檢測結(jié)果與TE活檢結(jié)果的差異55.6%是由母體DNA污染所致且與檢測技術(shù)無關(guān)，表明污染可獨(dú)立于擴(kuò)增問題影響檢測結(jié)果。

3.培養(yǎng)基檢測技術(shù)的利弊：培養(yǎng)基檢測為無創(chuàng)性評估胚胎發(fā)育潛能的方法，因而不需限定評估時胚胎的發(fā)育階段，且樣本量較囊胚液多，使得檢測方式較為靈活、多樣。有大量研究表明，培養(yǎng)基中的檢測指標(biāo)可作為評價指標(biāo)參與胚胎發(fā)育潛能的選擇評估[2]。但是，由于培養(yǎng)基缺乏透明帶的保護(hù)，直接暴露處于胚胎外部環(huán)境，如溫度、濕度、CO2濃度、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)皿質(zhì)量等都可能影響檢測結(jié)果。

4.培養(yǎng)基檢測技術(shù)的安全性：由于胚胎具有自我校正能力，而培養(yǎng)基中游離DNA的主要來源是被排出的非整倍體細(xì)胞及其碎片，可能導(dǎo)致假陽性率升高[46]。培養(yǎng)基的取得同樣需要在特定時間段開箱，雖然對胚胎而言為非侵入性，但是該技術(shù)若應(yīng)用于臨床仍需關(guān)注移液器和槍頭的無菌和質(zhì)控等問題。去除部分培養(yǎng)基后使得胚胎周圍液體量減少，在胚胎不斷自分泌和旁分泌的前提下，不論是否對培養(yǎng)中胚胎的培養(yǎng)基加以補(bǔ)充都可能造成濃度相應(yīng)變化，這些都需要研究證實(shí)是否對胚胎進(jìn)一步發(fā)育造成影響。

五、總結(jié)與展望

我們總結(jié)了4種評估胚胎發(fā)育潛能的方法，分別為胚胎形態(tài)學(xué)觀察、胚胎活檢技術(shù)、囊胚液檢測技術(shù)和培養(yǎng)基檢測技術(shù)。胚胎形態(tài)學(xué)觀察包括傳統(tǒng)顯微鏡觀察、TLI監(jiān)測系統(tǒng)和AI系統(tǒng)；胚胎活檢技術(shù)包括極體活檢、卵裂球活檢和TE活檢；囊胚液檢測技術(shù)包括檢測蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)和代謝產(chǎn)物；培養(yǎng)基檢測技術(shù)包括檢測蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)和代謝產(chǎn)物。形態(tài)學(xué)觀察和培養(yǎng)基檢測為非侵入性方法，囊胚液檢測為微侵入性方法，而TE活檢屬于侵入性方法；形態(tài)學(xué)觀察和培養(yǎng)基檢測可在胚胎發(fā)育期間的全階段進(jìn)行，胚胎活檢主要在囊胚期進(jìn)行，囊胚液檢測必須在囊胚期進(jìn)行；形態(tài)學(xué)觀察是定性檢測方法，囊胚液檢測和培養(yǎng)基檢測都是定量檢測方法。

囊胚液檢測和培養(yǎng)基檢測的物質(zhì)都為液體，不論是擴(kuò)增還是稀釋，可操作性強(qiáng)，檢測方法多。其囊胚液和培養(yǎng)基檢測結(jié)果量化后可建立公式和模型來計算胚胎發(fā)育潛能的參考值和異常值范圍，較定性分析而言，不論是對單個指標(biāo)相互比較還是多個指標(biāo)綜合比較都更為方便，有利于科研統(tǒng)計和臨床工作。Kuznyetsov等[47]研究發(fā)現(xiàn)，囊胚液檢測和培養(yǎng)基檢測相結(jié)合與單獨(dú)TE活檢結(jié)果的一致率為87.5%，與單獨(dú)全囊胚活檢結(jié)果的一致率為96.4%，而單獨(dú)TE活檢與單獨(dú)全囊胚活檢結(jié)果的一致率為91.7%，比較后發(fā)現(xiàn)囊胚液檢測和培養(yǎng)基檢測相結(jié)合的檢測方法比單獨(dú)TE活檢與全囊胚活檢的一致率顯著升高。然而，囊胚液檢測和培養(yǎng)基檢測的特點(diǎn)并不是完全相同，囊胚液檢測以胚胎內(nèi)環(huán)境為檢測媒介，培養(yǎng)基檢測以胚胎外環(huán)境為檢測媒介，囊胚液直接接觸ICM和TE，即直接反映胚胎發(fā)育潛能，而培養(yǎng)基檢測則不能直接反映ICM發(fā)育情況。囊胚液檢測中樣本濃度高于培養(yǎng)基檢測，但是囊胚液檢測體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于培養(yǎng)基檢測，由于囊胚液檢測的高濃度優(yōu)勢未抵消因體積過小導(dǎo)致的檢測難度過大的劣勢，使得囊胚液檢測研究的開展顯著少于培養(yǎng)基檢測。囊胚液檢測和培養(yǎng)基檢測作為新興技術(shù)，都是不錯的定量檢測媒介，但卻由于檢測難度大未進(jìn)入臨床。全時間段評估優(yōu)勢是培養(yǎng)基檢測推向臨床的重要基礎(chǔ)，培養(yǎng)基檢測以非侵入性和樣本量較囊胚液大的優(yōu)勢，在短期內(nèi)是較優(yōu)的胚胎發(fā)育潛能評估方法。

通過綜合比較發(fā)現(xiàn)，每種胚胎發(fā)育潛能評估技術(shù)均因自身特點(diǎn)有其優(yōu)勢。因而，以形態(tài)學(xué)觀察為基礎(chǔ)，TLI監(jiān)測結(jié)合AI系統(tǒng)為提升，培養(yǎng)基檢測和囊胚液檢測為輔助，TE活檢為診斷的綜合評價體系，可能是未來一段時間內(nèi)評估胚胎發(fā)育潛能的發(fā)展方向。