• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    熒光素酶標(biāo)記小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞建立活體成像移植瘤模型①

    2019-09-20 10:38:24羅華灶朱乃碩
    中國免疫學(xué)雜志 2019年17期
    關(guān)鍵詞:活體細(xì)胞株熒光素酶

    羅華灶 李 雪 依 含 謝 君 朱乃碩

    (復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物感染與分子免疫學(xué)實驗室,上海200438)

    結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤,發(fā)病率目前全球排名第四,死亡率高居第五位[1]。預(yù)計2030年,CRC病例將增加60%,新病例達(dá)到220萬,死亡人數(shù)達(dá)110萬[2]。其主要治療方式為手術(shù),但惡性程度高,術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,近年來興起的免疫療法正掀起腫瘤治療的革命[3,4]。小鼠由于與人類存在可比較的基因組大小,繁殖周期短,產(chǎn)仔數(shù)大,實驗成本低且易于操作[5],因此小鼠模型仍然是藥物發(fā)現(xiàn)和新興療法的臨床前評估的主要支柱[6,7]。開發(fā)用于研究的腫瘤異種移植動物模型的主要目的是聯(lián)系基礎(chǔ)和臨床研究,也是對體外模型系統(tǒng)運用的很好補充[8]。結(jié)腸癌動物模型的建立是研究結(jié)腸癌體內(nèi)發(fā)生、進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移及免疫治療PD-L1抗腫瘤藥物效果評估的重要手段[9]。盡管已有學(xué)者利用生物發(fā)光成像技術(shù)建立腫瘤移植模型,但諸多小鼠腫瘤模型尚缺乏動態(tài)連續(xù)追蹤及量化分析[10]。理想的小鼠模型將一致地模擬人CRC的進(jìn)展,應(yīng)該在整個結(jié)腸和直腸中自發(fā)發(fā)展,在潛伏期短的動物中具有高發(fā)病率,遵循相同的轉(zhuǎn)移模式,在具有免疫能力的動物中發(fā)生轉(zhuǎn)移,允許無創(chuàng)監(jiān)測疾病進(jìn)展并具有相同的人類疾病分子特征[10]。目前的動物模型不能滿足所有這些要求,但隨著先進(jìn)的成像模式,許多細(xì)胞系和先進(jìn)的轉(zhuǎn)基因建模方法可供選擇。慢病毒可將目的外源基因整合進(jìn)靶細(xì)胞基因組,實現(xiàn)靶細(xì)胞長期而穩(wěn)定表達(dá)目的基因[11,12],因此本研究采用三質(zhì)粒慢病毒系統(tǒng)建立穩(wěn)定整合及表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的結(jié)腸癌細(xì)胞株,進(jìn)行體外生長特性和PD-L1表達(dá)量的分析,并進(jìn)行BALB/c鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建,運用活體成像系統(tǒng)進(jìn)行整體動態(tài)觀察,從而為研究結(jié)腸癌的發(fā)生、進(jìn)展機制及判斷藥物治療效果提供全新的技術(shù)手段。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1實驗動物及環(huán)境 CT26細(xì)胞和293T細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。BALB/c雌性小鼠,購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,體重15~20 g,鼠齡 5~8周,飼養(yǎng)在復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物房平臺SPF環(huán)境,按實驗動物使用的“3R”原則給予動物人道的關(guān)懷。

    1.1.2試劑與設(shè)備 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素和PBS購于Thermo公司;LipoFiterTM試劑購自漢恒生物;Polybrene、TritonTMX-100及PI染液購于Sigma;Puromycin購于Gibco;TransDetect Single-luciferase(Firefly)Reporter Assay Kit購于全式金;Luciferase Assay System,Luciferin(In vivo Grade)購自Promega公司;戊巴比妥鈉購于德國默克公司;CCK-8試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;BV421 Rat Anti-Mouse CD274(PD-L1),BV421 Rat IgG2a λ Isotype Control,BD FACS Stain Buffer(FBS)購自BD;流式細(xì)胞儀Beckman Gallios 3L 10C,細(xì)胞計數(shù)儀Z2 coulter購自美國Beckman Coulter公司;Calibur流式細(xì)胞儀購自BD Pharmingen公司。倒置熒光顯微鏡購于德國Carl Zeiss公司;熒光素酶檢測系統(tǒng)(GLOMAX 96 micro plate luminometer)購于Promega公司;活體成像系統(tǒng)(Night OWLⅡ LB983 NC100)購于德國Berthold公司。

    1.2方法

    1.2.1慢病毒的生產(chǎn) 轉(zhuǎn)染前1 d將布滿培養(yǎng)皿50%以上的293T細(xì)胞接種于24孔板中,轉(zhuǎn)染時將完全培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基。將3質(zhì)粒(psPAX2,pMD2.G以及pHBLVTM)與LipoFiterTM試劑按1∶1體積比混勻后加入293T細(xì)胞中,培養(yǎng)6~12 h,去除含LipoFiterTM-DNA的無血清培養(yǎng)基,并換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48~72 h,超速離心后取病毒上清,0.45 μm濾膜過濾,收集慢病毒原液,-80℃保存。

    1.2.2感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選 將生長狀態(tài)良好的結(jié)腸癌細(xì)胞稀釋至細(xì)胞密度為1.5×105ml-1接種于6孔板,每孔接種體積為2 ml,使得第二天細(xì)胞布滿培養(yǎng)皿約60%左右,用收集的慢病毒感染細(xì)胞,感染時棄原有培養(yǎng)基,添加含5%FBS的新鮮培養(yǎng)液2 ml,按MOI=3的比例用慢病毒感染,并添加polybrene使得其最終濃度為7 g/ml。3 d后加12 g/ml 嘌呤霉素篩選。

    1.2.3篩選細(xì)胞的放大培養(yǎng) Puromycin篩完兩代的存活率較好的細(xì)胞株,檢測有過表達(dá)LUC則安排大量擴增細(xì)胞,待細(xì)胞長滿后進(jìn)行凍存,凍存細(xì)胞株后需進(jìn)行復(fù)蘇驗證。

    1.2.4CT26-LUC-1細(xì)胞株LUC活性檢測

    1.2.4.1CT26-LUC-1細(xì)胞克隆體外熒光值檢測 細(xì)胞建株成功后檢測熒光素酶活性。檢測時,按1×104個/50 μl 細(xì)胞裂解液(Cell lysis buffer)裂解10 min,12 000 r/min,4℃離心10 min取上清;取 40 μl 細(xì)胞裂解液(即上述上清)放入黑色不透光96孔板;檢測時每孔加入90 μl Luciferase Reaction Reagent工作液;移液槍吹打混勻2~3次,測定記錄Luciferase值,設(shè)3個復(fù)孔;同時設(shè)置CT26-WT對照。

    1.2.4.2不同數(shù)量的細(xì)胞克隆體外成像檢測 將篩出的熒光素酶表達(dá)細(xì)胞株定名為CT26-LUC1細(xì)胞株,將CT26-LUC1細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)5×105、2.5×105、1.25×105、6.25×104、3.12×104、1.56×104個分別接種到96孔黑板中,將未帶熒光標(biāo)記的CT26-WT細(xì)胞以相同的稀釋倍數(shù)作為對照。另外設(shè)置2個復(fù)孔僅含培養(yǎng)基作為對照,培養(yǎng)貼壁后小心去掉上清,PBS洗一次,每孔加入100 μl PBS,再加入終濃度為150 μg/ml的D-Luciferin,孵育15 min后用活體成像系統(tǒng)檢測,以每秒光子量(ph/s)表示,采用一元線性回歸法分析熒光信號強度與細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。

    1.2.5CT26-LUC1細(xì)胞與CT26-WT細(xì)胞生物學(xué)特性的比較

    1.2.5.1細(xì)胞生長曲線 取生長狀態(tài)良好的CT26-LUC1細(xì)胞和CT26-WT 細(xì)胞,接種于24孔板,接種密度為2×104個/孔。細(xì)胞接種后第1天到第7天,胰蛋白酶每天消化其中3孔細(xì)胞,用細(xì)胞計數(shù)儀Z2 coulter測定細(xì)胞數(shù),繪制兩種細(xì)胞生長曲線。

    1.2.5.2CCK-8細(xì)胞增殖實驗 將生長狀態(tài)良好的CT26-LUC1細(xì)胞和CT26-WT細(xì)胞接種于96孔板中(2 000個/孔),每孔含100 μl培養(yǎng)基。鋪板后第1、2、3、4天每孔加入10 μl的CCK-8溶液,37℃孵育2~3 h后用酶標(biāo)儀測定其OD450值,繪制增殖曲線。

    1.2.5.3細(xì)胞周期檢測 取生長狀態(tài)良好的CT26-LUC1細(xì)胞和CT26-WT細(xì)胞,0.25%胰酶消化,離心棄上清液,PBS洗后加入PBS稀釋的0.03% TritonTMX-100固定穿孔15 min后,將細(xì)胞離心棄Trixon 100后用PBS洗兩次,加入PI染液,室溫避光孵育15 min后,使用Calibur流式細(xì)胞儀檢測,Modfit軟件進(jìn)行周期分析。

    1.2.5.4表面PD-L1的流式分析 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞,將100 μl FACS Stain Buffer中1×106個細(xì)胞與BV421 Rat Anti-Mouse PD-L1和BV421 Rat IgG2a λ Isotype Control同種型對照抗體在冰上避光孵育30 min后,將細(xì)胞重懸于500 μl FACS染色緩沖液中。使用Beckman Gallios 3L 10C儀器進(jìn)行收集細(xì)胞,并使用FlowJo_V10軟件分析結(jié)果。

    1.2.6體內(nèi)結(jié)腸癌模型的建立及生物發(fā)光活體成像 BALB/c鼠,5~6周齡,體重(15± 5)g。取對數(shù)生長期的CT26-LUC1克隆細(xì)胞,用PBS重懸為2.5×106ml-1,BALB/c鼠右背側(cè)近腋部皮下接種200 μl。同時接種CT26-WT作為對照去除生物發(fā)光背景。接種后第7天采用活體成像系統(tǒng)檢測信號強度。觀測前BALB/c鼠先按150 mg/kg體重的量腹腔注射Luciferin,反應(yīng)約5 min后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg),活體成像觀察皮下腫瘤的熒光強度,觀察并記錄小鼠的生長狀態(tài)。

    1.2.7病理形態(tài)學(xué)觀察 CT26-LUC1細(xì)胞BALB/c鼠皮下接種15 d后處死小鼠,取腫瘤組織,制成石蠟切片,切片方向為最大截面,厚度為3 μm,經(jīng)HE染色后觀察細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué),同時對CT26-WT細(xì)胞接種的皮下移植瘤進(jìn)行HE染色觀察。

    2 結(jié)果

    2.1篩選細(xì)胞的擴增培養(yǎng)的復(fù)蘇驗證 嘌呤霉素篩完兩代的細(xì)胞株存活率均較好,檢測有過表達(dá)LUC則安排大量擴增細(xì)胞,凍存細(xì)胞株后進(jìn)行復(fù)蘇驗證,同野生型CT26細(xì)胞(圖1A)對比,CT26-LUC1細(xì)胞系生長形態(tài)和狀態(tài)良好,細(xì)胞存活率高且無污染,未見顯著變化(圖1B)。

    2.2CT26-LUC1細(xì)胞體外熒光素酶(Luciferase)活性的檢測和評估 經(jīng)過嘌呤霉素篩選6 d后,進(jìn)行CT26細(xì)胞體外熒光素酶(Luciferase)活性的檢測,細(xì)胞懸液按1×104cell/50 μl細(xì)胞量濃度進(jìn)行裂解后,發(fā)光強度為1.43×107,極顯著高于CT26-WT細(xì)胞(圖2A)。CT26-LUC1細(xì)胞在96孔板中經(jīng)倍比稀釋后, 熒光強度與細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性(R2=0.972 6)(圖2B、C)??梢娨勋@得能夠穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26-LUC1。

    2.3CT26-LUC-1細(xì)胞模型的檢測靈敏度 體外用活體成像系統(tǒng)Night OWLⅡ LB983 NC100可檢測細(xì)胞數(shù)約為15 000個(圖2A)。而CT26-LUC1細(xì)胞株在BALB/c小鼠體內(nèi)接種2 d后,腫瘤體積約為3 mm3即可檢測到熒光素酶信號(圖2D)。

    2.4穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的CT26細(xì)胞系的生長特性及膜型PD-L1表達(dá)量 兩種細(xì)胞CT26-WT與CT26-LUC1,所繪制的生長曲線基本重合,CT26-WT僅在第2天至第3天生長較CT26-LUC1生長稍快,最后在第5天后生長趨勢趨向一致(圖3A),總體生長增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。類似生長趨勢在CCK-8法繪制的細(xì)胞生長曲線中,在4 d的生長周期中,CT26-LUC1細(xì)胞與CT26-WT細(xì)胞生長趨勢基本一致(圖3B),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明通過慢病毒感染的方法轉(zhuǎn)染熒光素酶基因到細(xì)胞的過程中,并未對細(xì)胞本身的生長特性產(chǎn)生影響。CT26-LUC1組與CT26-WT均以G0/G1期細(xì)胞為主,各期細(xì)胞數(shù)未見顯著性差異(P>0.05)(圖3C)。而CT26結(jié)腸癌模型是腫瘤免疫應(yīng)用于免疫檢查點PD-1/PD-L1信號通路研究的常用腫瘤模型,其PD-L1的表達(dá)量是關(guān)注的重點,CT26-LUC1組與對照組細(xì)胞的PD-L1百分比分別為16.07±0.34、15.53± 0.40,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3D)。

    2.5結(jié)腸癌皮下移植瘤模型的活體成像評估及腫瘤組織病理學(xué)觀察 兩組各3只BALB/c小鼠都成功接種成功,接種CT26-LUC1的小鼠與接種CT26-WT的小鼠相比,小鼠體重、活動情況、進(jìn)食量及外表體征等均無不良影響,皮下荷瘤小鼠存活期長,接種CT26-LUC1的小鼠與接種CT26-WT的小鼠在15 d 觀察期中體重呈小幅增長的趨勢,且無顯著性差異(圖4A)。5×105個CT26-LUC1細(xì)胞皮下接種BALB/c鼠,成瘤率為100%。在接種第5天才能發(fā)現(xiàn)明顯的腫塊,但在接種CT26-LUC1細(xì)胞2 d后,活體成像系統(tǒng)即可檢測到皮下較強的熒光信號,到第7天出現(xiàn)凸起的腫塊時,熒光強度為2.4×104ph/s,而到腫瘤接種21 d后,中晚期腫瘤熒光強度為5.2×104ph/s,與早期腫瘤相比熒光強度已成倍增加(圖4B),腫瘤大小與熒光成像呈現(xiàn)很好的關(guān)系,并且能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤已經(jīng)從接種部位轉(zhuǎn)移至四周,說明穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報告基因的鼠CT26-LUC1細(xì)胞從接種開始就能很好地反映腫瘤的生長,由此成功建立熒光素酶標(biāo)記的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞活體成像移植瘤模型。CT26-LUC1細(xì)胞移植瘤鏡下癌細(xì)胞排列呈團(tuán)索狀,大小形態(tài)各異,胞漿豐富,細(xì)胞核大深染,局部未染色可見壞死。與CT26-WT對照細(xì)胞沒有差別(圖4C),符合結(jié)腸癌組織細(xì)胞特征,可見慢病毒轉(zhuǎn)染熒光素酶基因?qū)δ[瘤細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)無顯著影響。

    圖1 CT26細(xì)胞系中穩(wěn)定過表達(dá)LUC的細(xì)胞株擴增培養(yǎng)后復(fù)蘇驗證(×100)Fig.1 Confirmation of resuscitation after expansion of CT26 cell line stably overexpressing LUC(×100)Note: A.CT26-WT;B.CT26-LUC1.

    圖2 CT26-LUC1細(xì)胞克隆體外熒光活性檢測Fig.2 CT26-LUC1 cell clone in vitro fluorescence acti-vity assayNote: A.Detection of luciferase fluorescence in vitro of CT26 cells imaging of different numbers of CT26-LUC1 live cells in vitro;C.Detection sensitivity of CT26-LUC1 cell line in BALB/c mice;D.Correlation analysis of luminescence signal intensity and cell number.***.P<0.001.

    圖3 CT26-LUC1細(xì)胞與CT26-WT細(xì)胞生長特性的比較Fig.3 Comparison of growth characteristics between CT26-LUC1 cells and CT26-WT cells Note: A.Comparison of cell proliferation curves between two groups (cells counting method);B.Comparison of cell proliferation curves between two groups (CCK-8 method);C.Detection of cell cycle distribution between the two groups;D.Detection of cell membrane type PD-L1 expression between the two groups;NS.Not significant.

    圖4 CT26-LUC1組與CT26-WT組BALB/c鼠皮下移植模型活體成像及病理檢測Fig.4 In vivo images and histopathological detection of BALB/c mouse subcutaneous transplantation model of colon in CT26-LUC1Note: A.Mouse weight vivo imaging to detect the growth of subcutaneously inoculated CT26-LUC1 cells in BALB/c mouse;C.HE staining result of tumor tissue (×400);NS.Not significant.

    3 討論

    運用試驗動物建立腫瘤模型可模擬活體狀態(tài)下疾病的特征,為癌癥的診療和抗腫瘤藥物的研究提供試驗材料[13]。既往動物實驗實行人為肉眼觀察、腫瘤稱重、體積測量及組織切片病理觀察,導(dǎo)致研究缺乏精確定量性、活體觀察和整體性[14],并且存在動物倫理學(xué)、實驗誤差及無法連續(xù)動態(tài)觀察等諸多弊端[15]。生物發(fā)光成像技術(shù)是近年開發(fā)的一種直接測量活體動物中生物發(fā)光信號的新技術(shù),實現(xiàn)了對小動物腫瘤模型實時、連續(xù)及非侵入性觀察,能夠在整體水平上動態(tài)監(jiān)測動物中的腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移等情況[16-18]。理想的移植性腫瘤動物模型應(yīng)該具有高重復(fù)性、高成瘤成功率及穩(wěn)定的特點[19]。

    CRC是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,其發(fā)病率和死亡率每年以3 %~4 %速度上升[20]。目前結(jié)直腸癌仍首推外科治療,但是近年推崇的以PD-1/PD-L1為代表的免疫治療在腫瘤治療中展現(xiàn)了極其重要的作用,抑制/下調(diào) PD-1/PD-L1信號通路能夠有效提高對多種腫瘤的抗瘤效果[21,22],尤其對結(jié)直腸癌效果更佳[23],PD-1/PD-L1檢查點抑制劑在dMMR(錯配基因修復(fù)缺陷)結(jié)直腸癌患者中表現(xiàn)出治療活性,而約95%的微衛(wèi)星穩(wěn)定性(Microsatellite stability,MSS)結(jié)腸癌患者中單獨使用此類抑制劑時療效甚微,但一項Atezolizumab聯(lián)合MEK抑制劑Cobimetinib治療MSS亞型的(非錯配基因修復(fù)缺陷)結(jié)直腸的Ⅰ期臨床試驗被認(rèn)為給不適合免疫治療的結(jié)直腸癌患者帶來了希望[24]。免疫治療極大地改善了患者的生存質(zhì)量和減少病患的痛苦及長期化療放療帶來的身體傷害[25],目前也正在探索奧沙利鉑(OXA)聯(lián)合PD-1/PD-L1抗體治療CRC[26,27]。

    當(dāng)前致癌物誘導(dǎo)和基因工程小鼠模型在CRC發(fā)展和化學(xué)預(yù)防的研究中最有前景,而腫瘤移植模型適用于篩選候選治療劑,皮下移植瘤用于在原位模型中的后續(xù)驗證藥物的高通量評估[10],為每個實驗應(yīng)用選擇最合適的動物模型,轉(zhuǎn)化為與人體治療CRC相似的結(jié)果是所有動物模型的最終目標(biāo)。本研究利用慢病毒載體將熒光素酶基因和嘌呤霉素基因整合進(jìn)入CT26細(xì)胞基因組中,我們通過提高嘌呤霉素篩選濃度,得到了高表達(dá)熒光素酶的陽性混合克隆,構(gòu)建出穩(wěn)定高表達(dá)LUC基因的CT26-LUC1細(xì)胞,重要的是膜型PD-L1表達(dá)量較CT26-WT沒有任何差異,并且在BALB/c鼠接種后第2天就能檢測到熒光信號,有利于腫瘤發(fā)生的早期研究和微小轉(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)[28],且中晚期腫瘤的熒光成像與腫瘤生長情況呈現(xiàn)良好的相似性,而且能夠清晰看到腫瘤的轉(zhuǎn)移,該熒光素酶移植瘤模型具有高重復(fù)性、高成瘤成功率、穩(wěn)定清晰的特點,保證了免疫檢查點抑制劑在該高表達(dá)PD-L1移植瘤的響應(yīng)[29,30],并且能夠及時迅速敏感直接地觀測到腫瘤發(fā)生早期的治療效果。該模型還將為結(jié)腸癌發(fā)生進(jìn)展機制及PD-L1靶向藥物的高通量篩選提供快速穩(wěn)定可靠的動物研究模型,并且在原位模型難以進(jìn)行候選藥物的高通量評估方面提供強有力的支持,為腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)遺傳基因、腫瘤轉(zhuǎn)移機制、新抗癌轉(zhuǎn)移藥物的發(fā)現(xiàn)等提供切實可靠且價格低廉的動物模型[31]。

    猜你喜歡
    活體細(xì)胞株熒光素酶
    NNMT基因啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗證
    不同雙熒光素酶方法對檢測胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    張帆:肝穿刺活體組織學(xué)檢查
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:08
    讓活體肝移植研究走上世界前沿
    華人時刊(2020年21期)2021-01-14 01:33:36
    活體器官移植,你怎么看?
    重組雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
    “汪星人”要打“飛的”——話說活體空運
    穩(wěn)定敲低MYH10基因細(xì)胞株的建立
    Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
    穩(wěn)定抑制PAK2蛋白表達(dá)的HUH—7細(xì)胞株的建立
    亚洲国产精品成人综合色| 两个人看的免费小视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 禁无遮挡网站| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 日本在线视频免费播放| 成人18禁在线播放| 国产精品永久免费网站| 日本在线视频免费播放| 久久人妻av系列| 亚洲天堂国产精品一区在线| 九色国产91popny在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产成人啪精品午夜网站| 久久久久精品国产欧美久久久| 一本精品99久久精品77| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美最黄视频在线播放免费| 99国产精品99久久久久| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 黑人操中国人逼视频| 亚洲国产欧美网| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 不卡av一区二区三区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美日韩精品网址| 色哟哟哟哟哟哟| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 色综合亚洲欧美另类图片| www.999成人在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国内精品美女久久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 午夜a级毛片| 亚洲av日韩精品久久久久久密| www.www免费av| 一级作爱视频免费观看| 99久久精品国产亚洲精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲无线观看免费| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品99久久99久久久不卡| 又紧又爽又黄一区二区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产av在哪里看| 最新中文字幕久久久久 | 禁无遮挡网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美一级毛片孕妇| 两个人看的免费小视频| 少妇的逼水好多| 日本熟妇午夜| 久久香蕉精品热| 久久国产乱子伦精品免费另类| 黄色女人牲交| a级毛片a级免费在线| 亚洲国产精品成人综合色| 好男人在线观看高清免费视频| bbb黄色大片| 老司机午夜福利在线观看视频| 色尼玛亚洲综合影院| 一级毛片高清免费大全| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲国产高清在线一区二区三| 此物有八面人人有两片| 国产不卡一卡二| 丰满的人妻完整版| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲无线在线观看| 色播亚洲综合网| 国产淫片久久久久久久久 | 欧美激情久久久久久爽电影| 网址你懂的国产日韩在线| 色哟哟哟哟哟哟| 国产三级在线视频| 久久这里只有精品中国| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产精品一及| 男女之事视频高清在线观看| 成人午夜高清在线视频| 久久久色成人| 天堂影院成人在线观看| 熟女电影av网| 亚洲,欧美精品.| 母亲3免费完整高清在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 久久伊人香网站| 国产日本99.免费观看| 国产亚洲欧美98| www国产在线视频色| 午夜激情欧美在线| 中出人妻视频一区二区| 国产久久久一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品国产乱子伦一区二区三区| 看黄色毛片网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 在线观看66精品国产| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 十八禁网站免费在线| 91av网站免费观看| 我要搜黄色片| 国产精品女同一区二区软件 | 97超视频在线观看视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 午夜亚洲福利在线播放| 人妻久久中文字幕网| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲国产精品999在线| 精品免费久久久久久久清纯| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 一个人看的www免费观看视频| 久久这里只有精品中国| 国产亚洲精品久久久com| 淫妇啪啪啪对白视频| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产成人aa在线观看| 一级毛片高清免费大全| 2021天堂中文幕一二区在线观| 男女之事视频高清在线观看| 精品久久久久久成人av| 99视频精品全部免费 在线 | 免费看光身美女| 国产不卡一卡二| 精品久久久久久久末码| 亚洲第一电影网av| 国产一区二区三区视频了| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲在线观看片| 中文亚洲av片在线观看爽| 男人舔女人下体高潮全视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 一级毛片女人18水好多| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 我要搜黄色片| 日韩欧美国产在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲九九香蕉| 在线观看免费午夜福利视频| 香蕉国产在线看| 国产一区二区在线av高清观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 舔av片在线| 这个男人来自地球电影免费观看| 麻豆国产av国片精品| 亚洲avbb在线观看| 一本综合久久免费| 午夜福利高清视频| 亚洲av美国av| 亚洲五月天丁香| 免费看日本二区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 1024香蕉在线观看| 国内精品久久久久久久电影| www日本在线高清视频| 婷婷六月久久综合丁香| 1024手机看黄色片| 成人永久免费在线观看视频| 久久99热这里只有精品18| 两性夫妻黄色片| 波多野结衣巨乳人妻| 日本五十路高清| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 99热只有精品国产| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产91精品成人一区二区三区| 99精品久久久久人妻精品| 韩国av一区二区三区四区| 最新中文字幕久久久久 | 白带黄色成豆腐渣| 精品乱码久久久久久99久播| 国内精品久久久久久久电影| 久久国产精品影院| 一个人免费在线观看的高清视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日韩欧美 国产精品| 成在线人永久免费视频| 在线播放国产精品三级| 18禁观看日本| 亚洲国产欧美一区二区综合| 成人精品一区二区免费| 国产主播在线观看一区二区| 在线观看日韩欧美| www日本在线高清视频| 波多野结衣高清作品| 成年免费大片在线观看| av天堂中文字幕网| 亚洲无线在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| av欧美777| 国产淫片久久久久久久久 | av片东京热男人的天堂| 看黄色毛片网站| 日韩精品中文字幕看吧| 国产视频内射| 淫妇啪啪啪对白视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 嫩草影院精品99| 国产美女午夜福利| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产免费av片在线观看野外av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 级片在线观看| 欧美日韩黄片免| 久久天堂一区二区三区四区| 91久久精品国产一区二区成人 | 制服丝袜大香蕉在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 免费高清视频大片| 亚洲一区高清亚洲精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲成人精品中文字幕电影| 毛片女人毛片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产成年人精品一区二区| 99久久综合精品五月天人人| 999精品在线视频| а√天堂www在线а√下载| 久久久精品大字幕| 色噜噜av男人的天堂激情| 99精品久久久久人妻精品| 国产黄片美女视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 日本三级黄在线观看| 国产三级中文精品| 午夜免费激情av| 国产亚洲精品一区二区www| 丰满人妻一区二区三区视频av | 欧美大码av| 无遮挡黄片免费观看| 禁无遮挡网站| 精品福利观看| 欧美日韩乱码在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 男女下面进入的视频免费午夜| 99久久国产精品久久久| 在线观看66精品国产| 天天添夜夜摸| 九色国产91popny在线| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲人与动物交配视频| 麻豆成人av在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 国内精品久久久久精免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久久国产成人免费| netflix在线观看网站| 深夜精品福利| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美乱妇无乱码| 国产午夜精品论理片| 变态另类丝袜制服| 国产高清三级在线| 一区福利在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 日韩欧美 国产精品| 日韩高清综合在线| 网址你懂的国产日韩在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久人妻av系列| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久伊人香网站| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 精品福利观看| 黄片小视频在线播放| 亚洲欧美日韩高清专用| 波多野结衣巨乳人妻| 国产av在哪里看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲成a人片在线一区二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 嫩草影院精品99| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黄色片一级片一级黄色片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产伦精品一区二区三区四那| 1024香蕉在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 村上凉子中文字幕在线| 国产日本99.免费观看| 国产99白浆流出| 久久亚洲真实| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 窝窝影院91人妻| 18禁国产床啪视频网站| 毛片女人毛片| 成年免费大片在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 成人国产一区最新在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月 | 欧美大码av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 俺也久久电影网| 欧美高清成人免费视频www| 香蕉av资源在线| 最近在线观看免费完整版| 99久久精品一区二区三区| 国产三级中文精品| 亚洲黑人精品在线| 真实男女啪啪啪动态图| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久中文字幕人妻熟女| 精品日产1卡2卡| 久久国产精品影院| 国产av一区在线观看免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美乱妇无乱码| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产伦人伦偷精品视频| 日日夜夜操网爽| 深夜精品福利| 午夜精品一区二区三区免费看| 午夜免费成人在线视频| 亚洲九九香蕉| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久久国产a免费观看| 无人区码免费观看不卡| 曰老女人黄片| 天堂√8在线中文| 免费看日本二区| 欧美日韩黄片免| av视频在线观看入口| 久久久久久久久免费视频了| 最好的美女福利视频网| 母亲3免费完整高清在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美中文日本在线观看视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 天堂动漫精品| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久精品国产清高在天天线| 高清毛片免费观看视频网站| 少妇的逼水好多| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产美女午夜福利| 国语自产精品视频在线第100页| 国产三级黄色录像| 国产精品久久电影中文字幕| 熟女电影av网| 偷拍熟女少妇极品色| 日本在线视频免费播放| 日韩人妻高清精品专区| 日日干狠狠操夜夜爽| 黄色丝袜av网址大全| 日本黄大片高清| a级毛片a级免费在线| 欧美3d第一页| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产午夜精品久久久久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲中文字幕日韩| 天堂动漫精品| 色av中文字幕| 男人舔女人的私密视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 午夜影院日韩av| 久久午夜亚洲精品久久| 国产伦在线观看视频一区| 88av欧美| 性欧美人与动物交配| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲av成人av| 美女高潮的动态| 手机成人av网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 可以在线观看毛片的网站| 国产一区在线观看成人免费| 免费观看的影片在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产精品久久久人人做人人爽| 成年免费大片在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产 一区 欧美 日韩| 97碰自拍视频| 18美女黄网站色大片免费观看| netflix在线观看网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 伦理电影免费视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 免费人成视频x8x8入口观看| 99热精品在线国产| 国产主播在线观看一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久人妻av系列| 少妇丰满av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 激情在线观看视频在线高清| 国产蜜桃级精品一区二区三区| av女优亚洲男人天堂 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99久久综合精品五月天人人| 好男人电影高清在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 香蕉久久夜色| 亚洲av免费在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产亚洲精品av在线| 日韩成人在线观看一区二区三区| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久精品综合一区二区三区| 91老司机精品| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲男人的天堂狠狠| 精华霜和精华液先用哪个| 两人在一起打扑克的视频| 大型黄色视频在线免费观看| 日本一二三区视频观看| 亚洲色图av天堂| 90打野战视频偷拍视频| 精品久久久久久久久久久久久| 日本五十路高清| 三级毛片av免费| 午夜两性在线视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品国产高清国产av| 国产精品精品国产色婷婷| 色综合婷婷激情| 久久香蕉国产精品| 国产激情欧美一区二区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| svipshipincom国产片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲人成伊人成综合网2020| 三级国产精品欧美在线观看 | 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲av成人一区二区三| 一进一出好大好爽视频| 久久草成人影院| www.自偷自拍.com| 亚洲人成电影免费在线| 日本黄大片高清| 男插女下体视频免费在线播放| 国产乱人伦免费视频| 性色av乱码一区二区三区2| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品九九99| 一个人看视频在线观看www免费 | 男女那种视频在线观看| 色在线成人网| www.熟女人妻精品国产| 国产一区二区激情短视频| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲18禁久久av| 天堂影院成人在线观看| 最新中文字幕久久久久 | 曰老女人黄片| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产亚洲精品av在线| 99国产综合亚洲精品| 波多野结衣巨乳人妻| 天天添夜夜摸| 日日夜夜操网爽| www.999成人在线观看| 性欧美人与动物交配| 欧美日本亚洲视频在线播放| bbb黄色大片| 97碰自拍视频| 亚洲人与动物交配视频| 日韩人妻高清精品专区| tocl精华| 老汉色∧v一级毛片| 麻豆国产av国片精品| 我的老师免费观看完整版| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲成人久久性| 亚洲成人久久爱视频| 99re在线观看精品视频| 国内精品久久久久精免费| 精品国产乱码久久久久久男人| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 无人区码免费观看不卡| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 757午夜福利合集在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 午夜影院日韩av| 级片在线观看| av在线天堂中文字幕| 女同久久另类99精品国产91| 热99re8久久精品国产| 国产一区二区在线观看日韩 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜福利视频1000在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 观看免费一级毛片| 91av网站免费观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 久久精品91蜜桃| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久中文看片网| 国产午夜精品论理片| 男插女下体视频免费在线播放| 国产男靠女视频免费网站| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久久久久久午夜电影| 一二三四在线观看免费中文在| 热99re8久久精品国产| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人精品一区二区免费| 国模一区二区三区四区视频 | 国产v大片淫在线免费观看| 国产高清视频在线观看网站| 757午夜福利合集在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产激情欧美一区二区| 嫩草影院入口| www.自偷自拍.com| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 中文字幕高清在线视频| 亚洲无线在线观看| 亚洲国产欧美网| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 性色avwww在线观看| 九九在线视频观看精品| 国产精品久久视频播放| 精品国产亚洲在线| 久99久视频精品免费| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美一级毛片孕妇| 久久久成人免费电影| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费大片18禁| 国产午夜福利久久久久久| 精品日产1卡2卡| 久久久久久久午夜电影| 国产亚洲av高清不卡| 在线看三级毛片| 国产成年人精品一区二区| 岛国在线观看网站| 欧美日韩一级在线毛片| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产伦在线观看视频一区| 1024手机看黄色片| 国产精品av视频在线免费观看| 一区二区三区国产精品乱码| 十八禁人妻一区二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 成人欧美大片| 嫩草影院入口| 亚洲美女黄片视频| 日日夜夜操网爽| 国模一区二区三区四区视频 | 最近最新中文字幕大全电影3| 成在线人永久免费视频| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲国产精品久久男人天堂| a级毛片a级免费在线| 欧美三级亚洲精品| 亚洲avbb在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲一区二区三区色噜噜| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲性夜色夜夜综合| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美国产日韩亚洲一区| 免费观看人在逋| 国产乱人视频| 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久精品人妻少妇| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲黑人精品在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美黑人巨大hd| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 男女视频在线观看网站免费| 午夜福利18|