硫辛酸對炎性痛小鼠脊髓背角c-Fos 和Iba-1 的影響*

許祥影 沈晶晶 朱 賀 劉 倩 陶怡嘉 逯 晨△

（1徐州醫(yī)科大學(xué) 江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，徐州221004；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，徐州221004）

硫辛酸(α-lipoic acid, ALA)化學(xué)名稱為1，2-二硫戊環(huán)-3-戊酸，分子式為C8H14O2S2。在1950年由Reed 等美國學(xué)者合成[1]。硫辛酸屬于維生素B類化合物，二硫鍵的存在使其容易反應(yīng)生成還原型產(chǎn)物二氫硫辛酸(ihydmlipoic acid, DHLA)，因而具有較強(qiáng)的抗氧化作用。硫辛酸既可以在水溶性環(huán)境，也在脂溶性環(huán)境中發(fā)揮抗氧化功能，有學(xué)者甚至將其譽(yù)為“萬能抗氧化劑”[2]。硫辛酸作為一個(gè)強(qiáng)抗氧化劑已廣泛應(yīng)用于糖尿病及糖尿病慢性并發(fā)癥的預(yù)防和治療[3]，研究表明硫辛酸對糖尿病性神經(jīng)病性神經(jīng)病理性疼痛有明顯作用，近年來研究表明硫辛酸與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，如阿爾茨海默病等[4]，具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。

此外最新研究表明其對臨床常見的坐骨神經(jīng)痛[5]、偏頭痛[6]以及女性盆腔痛[7]和產(chǎn)后疼痛[8]等也有一定的改善作用，目前硫辛酸已經(jīng)列入治療疼痛可能的替代藥物，但目前其緩解疼痛的具體機(jī)制尚未完全明確。

慢性炎性痛是臨床上最常見的病理性疼痛之一，小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的關(guān)鍵。慢性炎性痛條件下，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化、數(shù)量增加，通過分泌細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)使脊髓背角神經(jīng)元興奮性增加，促進(jìn)中樞敏化的維持[9]。c-Fos 蛋白是由即刻早期基因c-fos 的編碼產(chǎn)物，常被作為反應(yīng)神經(jīng)元興奮性的良好指標(biāo)。炎性痛條件下脊髓背角淺層神經(jīng)元c-Fos 蛋白表達(dá)增加，神經(jīng)元的興奮性明顯增強(qiáng)[10]。

研究表明硫辛酸能明顯降低內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的 NF-κB 的活性，影響小膠質(zhì)細(xì)胞的活化[11]，硫辛酸作為重要的抗炎抗氧化劑以及神經(jīng)保護(hù)作用，推測其可以逆轉(zhuǎn)慢性炎性痛的病理生理過程，通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低脊髓背角中樞炎癥反應(yīng)，降低慢性炎性痛脊髓背角神經(jīng)元的異常興奮，從而對炎性痛具有明顯的抑制作用?；诖耍ㄟ^在小鼠足底注射完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant, CFA)模擬慢性炎性痛，首先觀察硫辛酸對慢性炎性痛小鼠痛行為的影響，繼而從小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量變化觀察硫辛酸對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，并檢測脊髓背角神經(jīng)元興奮性從而探討硫辛酸對慢性炎性痛的作用及可能的機(jī)制，從而為臨床上應(yīng)用硫辛酸治療或緩解慢性炎性痛提供理論依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動物與分組

SPF 級雄性昆明小鼠，18 ～20 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物置于室溫和12 h/12 h明暗交替的安靜環(huán)境中，自由進(jìn)食進(jìn)水，所有動物遵守《實(shí)驗(yàn)動物使用規(guī)范》。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將40 只小鼠隨機(jī)分成4 組(n= 10)：對照組（Control 組）、炎性痛組（CFA 組：足底注射30 μl完全弗氏佐劑）、硫辛酸組[ALA 組：腹腔注射ALA 100 mg/kg (Sigma, USA)]和炎性痛+硫辛酸組（CFA + ALA 組：足底注射30 μl 完全弗氏佐劑3 d后腹腔注射ALA 100 mg/kg）。術(shù)后3 d，分別于ALA 注射后 0、10、30、60、90、120 min (T0-T6)檢測熱縮足潛伏期(PWL)。T4 時(shí)間點(diǎn)行免疫組織化學(xué)法檢測脊髓背角Iba-1 和c-Fos 表達(dá)。

2.炎性痛模型的建立

用微量注射器將30 μl 完全弗氏佐劑(Sigma,USA)注入小鼠左側(cè)后肢足底中心皮下，從而建立炎性痛模型[12,13]。

3.給藥、小鼠右后足趾腫脹程度及行為學(xué)測定

造模后第3 天，在給予硫辛酸100 mg·kg-1后120 min 后使用游標(biāo)卡尺測量各組右側(cè)后爪跖底的厚度。

造模后第3 天，各組小鼠測量熱縮足反射潛伏期 PWL 后，分別在給予硫辛酸 100 mg·kg-1后 0、10、30、60、90、120 min 進(jìn)行 PWL 的檢測。

將小鼠放到有機(jī)玻璃箱(7 cm×9 cm×11 cm)置于3 mm 厚的玻璃板上適應(yīng)2 h，用熱輻射刺激儀照射小鼠足底固定部位，照射開始至小鼠出現(xiàn)抬腿回避時(shí)間為PWL。熱刺激強(qiáng)度調(diào)整為基礎(chǔ)值12 ～15 s，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中維持一致，自動切斷時(shí)間為20 s，以免造成熱輻射損傷。為避免或減少前一次刺激對隨后刺激效應(yīng)造成的影響，同一部位刺激的間隔時(shí)間為3 min,連續(xù)測定5 次，去掉最大值和最小值，取3 次平均值進(jìn)行計(jì)算。

4.樣本制備

戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射將小鼠麻醉后，經(jīng)升主動脈用生理鹽水快速灌注沖洗血液直至液體清亮，然后用4%多聚甲醛的0.1 mol.L-1磷酸緩沖液 (PB, PH7.4)先快后慢進(jìn)行滴注30 min。灌注完取脊髓腰膨大，放入上述固定液內(nèi)4℃后固定6 h，然后移入30%蔗糖溶液直到組織沉底。然后對脊髓腰膨大做冰凍切片，片厚30 μm。

5.免疫組織化學(xué)染色

切片經(jīng) 0.01 M PBS 漂洗，5 分鐘 /次 × 3 次，隨后滴入3%H2O2溶液，室溫下孵育10 min，以清除內(nèi)源性過氧化物酶；PBS 漂洗，5 分鐘/次 × 3 次，加入含1%BSA 和0.3%的Trixton X-100 封閉液室溫下封閉1 h，加入兔源c-Fos 一抗(1:200, Santa Cruz)；加入羊源Iba-1 一抗(1:200, Abcam) 4℃孵育24 h。PBS 漂洗，5 分鐘/次 × 3 次，分別加入生物素標(biāo)記的二抗(1:200, Vector)室溫孵育30 min；PBS 漂洗，5 分鐘/次×3 次，然后加入ABC 復(fù)合物中室溫孵育30 min，PBS 漂洗，5 分鐘/次×3 次，DAB 顯色后用PBS 漂洗終止反應(yīng)。將切片貼于防脫玻片室溫風(fēng)干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

6.攝片及計(jì)數(shù)

使用光學(xué)顯微鏡(Leica, Germany)進(jìn)行攝片。所得圖像使用Image- Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行脊髓背角c-Fos 和Iba-1 陽性細(xì)胞的定量分析，每組6 只動物進(jìn)行比較，其中每只小鼠隨機(jī)選取L4-6三張切片，計(jì)數(shù)脊髓背角淺層Iba-1 和c-Fos 的表達(dá)，取平均值。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.硫辛酸對炎性痛小鼠痛行為的影響

圖1 腹腔注射硫辛酸對炎性痛小鼠熱縮足潛伏期的影響(±SD)Fig.1 Effects of ALA on PWT in mice with inflammatory pain (±SD)

Control 組小鼠痛閾(12.98±0.50 s)一直保持在基礎(chǔ)痛閾水平。CFA 組小鼠足底注射CFA 后第3 天，痛閾較Control 組相比明顯降低，維持在(5.10±0.88 s)，差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05)。CFA + ALA 組小鼠腹腔注射ALA 可以明顯逆轉(zhuǎn)炎性痛的痛閾降低(P＜ 0.05)。給予ALA 后，約10 min 開始起效 (P＜0.05)，30 min 痛閾繼續(xù)上升，60 min 痛閾達(dá)到最高，和Control 組無明顯差異,隨后痛閾逐漸下降，藥效持續(xù)約120 min，而正常組小鼠腹腔注射ALA 后前后痛閾無明顯差異（見圖1）。以上表明腹腔注射ALA 可以明顯提高炎性痛小鼠的疼痛閾值。

2.硫辛酸對炎性痛小鼠足趾腫脹程度的影響

CFA 造模3 天后，CFA 組小鼠右后足均明顯紅腫，測量右后足足趾厚度和Control 組相比明顯變厚，差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在ALA 注射120 min 后，與CFA 組相比CFA + ALA 組足趾腫脹程度顯著降低，足趾厚度明顯減小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖2），表明ALA 可以有效減輕CFA 誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)引起的足趾腫脹。

3.硫辛酸對炎性痛小鼠脊髓背角Iba-1 表達(dá)的影響

Control 組小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少，形態(tài)為樹枝狀，胞體較小，有多根細(xì)長的突起 （見圖3A，B）；CFA 炎性痛小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P＜0.05)，轉(zhuǎn)化為“活化態(tài)”，胞體變大變圓，去分支化分支變短變少呈阿米巴樣（見圖 3C）；腹腔注射ALA 后（見圖3D），可以明顯逆轉(zhuǎn)炎性痛小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增多和形態(tài)學(xué)變化(P＜0.05)，胞體呈小分支細(xì)長狀。腹腔注射ALA 后,小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量明顯減少44.1%（P＜0.05，見圖3E），胞體區(qū)域面積平均比CFA組減小了 54% （P＜0.05，見圖 3F）。而 ALA組脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)均無明顯差異。腹腔注射ALA 可明顯降低CFA 誘導(dǎo)的炎性痛小鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活性，表現(xiàn)為數(shù)量和形態(tài)的改變。

圖2 腹腔注射硫辛酸120min對炎性痛小鼠足趾厚度的影響(±SD)Fig.2 Effects of ALA on the thickness of paw in mice with inflammatory pain (±SD)

4.硫辛酸對炎性痛小鼠脊髓背角c-Fos 蛋白表達(dá)的影響

Control 組脊髓背角c-Fos 蛋白表達(dá)量很少（見圖4A），CFA 組c-Fos 蛋白表達(dá)量明顯增多，呈強(qiáng)陽性分布在脊髓背角淺層（見圖 4C），CFA + ALA組小鼠腹腔注射硫辛酸后60 min脊髓背角淺層c-Fos蛋白量明顯減少（見圖4D），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)，而ALA 組脊髓背角c-Fos 蛋白表達(dá)量無明顯變化（見圖 4B）。因此，腹腔注射ALA 抑制了炎性痛小鼠脊髓背角神經(jīng)元的活性。

討 論

硫辛酸因其具有非常強(qiáng)的抗氧化性及神經(jīng)保護(hù)作用，被廣泛用于治療糖尿病神經(jīng)病變等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。慢性炎性痛時(shí)外周炎癥部位受化學(xué)性刺激，以及局部產(chǎn)生的組胺、5-羥色胺等使傷害性感受器持續(xù)性激活，導(dǎo)致脊髓背角神經(jīng)元持續(xù)興奮。脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞炎癥反應(yīng)加重了脊髓背角神經(jīng)元的異常興奮，促進(jìn)了慢性炎性痛的產(chǎn)生和維持。所以，阻斷或干預(yù)慢性炎性痛的病理過程對緩解疼痛的產(chǎn)生和維持至關(guān)重要。

小鼠足底注射CFA 后，局部腫脹明顯，熱縮足潛伏期明顯降低，且持續(xù)約兩周時(shí)間，常被用來模擬慢性炎性痛。在給予硫辛酸后，可以明顯逆轉(zhuǎn)小鼠注射CFA 后的炎性痛反應(yīng)，熱縮足潛伏期明顯延長, 改善小鼠足趾腫脹程度。硫辛酸可能通過降低外周炎癥部位的氧自由基，清除局部的氧化代謝產(chǎn)物，降低外周傷害性感受器的持續(xù)性激活，從而抑制慢性炎性痛的發(fā)生發(fā)展。除此之外，硫辛酸對脊髓背角神經(jīng)元的興奮性及中樞炎癥反應(yīng)有無改善呢？為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，我們對炎性痛小鼠脊髓背角中神經(jīng)元活性標(biāo)志物小膠質(zhì)細(xì)胞c-Fos 蛋白[10]以及Iba-1[9]的表達(dá)進(jìn)行了檢測。

圖3 腹腔注射硫辛酸對炎性痛小鼠脊髓背角Iba-1 表達(dá)的影響（圖片取自L5 節(jié)段）Scale bar = 100 μm；左上角小圖為大圖虛線框的放大部分Fig.3 Changes of Iba-1 in dorsal horn of spinal cord after injecting ALA in mice with inflammatory pain (picture taken from L5 segment) Scale bar = 100 μm

圖4 腹腔注射硫辛酸對炎性痛小鼠脊髓背角c-Fos 蛋白表達(dá)的影響 (圖片取自L5 節(jié)段) Scale bar = 100 μm；右上角小圖為大圖虛線框的放大部分Fig.4 Changes of c-Fos expression levels in dorsal horn of spinal cord neurons after injecting LA in mice with inflammatory pain （picture taken from L5 segment）Scale bar = 100 μm

慢性炎性痛小鼠給予硫辛酸后，可以明顯降低小鼠脊髓背角c-Fos 蛋白的表達(dá)，從而緩解脊髓背角神經(jīng)元的異常興奮。1965 年Melzack 和Wall 等人提出的閘門控制學(xué)說指出，脊髓背角的神經(jīng)元興奮性是疼痛發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一。外周炎癥刺激導(dǎo)致脊髓背角神經(jīng)元活化，從而進(jìn)一步通過脊髓丘腦束等活化高位中樞，如丘腦腹后核、大腦感覺皮層等。硫辛酸抑制脊髓背角神經(jīng)元的異常興奮，可能是其發(fā)揮抑制慢性炎性痛的機(jī)制之一。

除此之外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，從而介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，是慢性炎性痛發(fā)展及維持的重要原因。慢性炎性痛條件下，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加[9,15]，以及形態(tài)由靜息狀態(tài)的分支狀變成活化狀態(tài)的“阿米巴”樣，表現(xiàn)為胞體面積的增加[14]，是反應(yīng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要指標(biāo)。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化可以緩解慢性疼痛的產(chǎn)生和維持[15]。慢性炎性痛小鼠在給予硫辛酸后可以抑制脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加以及形態(tài)學(xué)變化，提示硫辛酸可以抑制脊髓背角的中樞炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，硫辛酸對慢性炎性痛具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，一方面可能通過降低外周炎癥局部的炎性反應(yīng)，另一方面可能通過降低脊髓背角神經(jīng)元的興奮性以及脊髓背角中樞炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。硫辛酸抑制慢性炎性痛脊髓背角神經(jīng)元的興奮性可能是直接效應(yīng)，也可能是同時(shí)通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低中樞炎癥反應(yīng)，從而間接抑制脊髓背角神經(jīng)元的興奮性。使用硫辛酸治療慢性炎性痛，尚未發(fā)現(xiàn)阿片類藥物的成癮性、依賴性，也沒發(fā)現(xiàn)有其他鎮(zhèn)痛藥物嚴(yán)重的不良反應(yīng)，從而為臨床上治療慢性炎性痛的治療提供新的方法與思路提供理論依據(jù)。