多效生長因子在乳腺癌中的表達及診斷價值

吳立剛 馮慧敏，2 納莉 王丹妮，2 曹佳，2 金曉菲 王立斌，2

1寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院（銀川750001）；2寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院（銀川750001）

乳腺癌是女性腫瘤發(fā)病率和病死率較高的疾病之一，發(fā)病呈現年輕化趨勢［1-2］。目前，臨床上一些血清學標志物如糖類蛋白153（carbohydrate antigen 153，CA153）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類蛋白125（carbohydrate antigen 125，CA125）、糖類蛋白199（carbohydrate antigen 199，CA199）、腫瘤特異性生長因子（tumor-specific growth factor，TSGF）等均可用于協助診斷乳腺癌［3-4］，但對乳腺癌的臨床診斷不具備特異性。

多效生長因子（pleiotrophin，PTN）是一個原癌基因，其表達相對分子質量為18 kDa的蛋白質，對肝素表現出高度親和力［5-6］；有多種生物學功能，如促細胞有絲分裂、促血管生成、促細胞增殖、遷移、浸潤等，在多種癌癥中表達上調［7］。已有研究［8］顯示，PTN 可用于小細胞肺癌的診斷以及預后判斷。但PTN 與乳腺腫瘤的相關性研究目前尚不多見。本研究通過檢測PTN 在乳腺癌患者血清及組織中的表達，探討PTN 在乳腺癌診斷、遠處轉移以及預后中的價值，為進一步研究其具體作用機制，尋找新的乳腺腫瘤診斷標志物提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料采集2016年4月1日至2018年5月10日寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤科收治的113 例女性乳腺癌患者的血樣。患者平均年齡59.5 歲；其中遠處轉移25 例，無遠處轉移88 例；淋巴結轉移77 例，無淋巴結轉移36 例；Ⅰ～Ⅱ期患者組63 例，Ⅲ～Ⅳ期患者組50 例。術后病理結果高分化者76 例，低分化者37 例。組織樣本納入標準：（1）乳腺癌經過術后病理學的證實；（2）標本采集前，患者未接受過放療、化療等。排除標準：（1）患者有其他惡性腫瘤；（2）患者存在免疫性或炎癥性疾?。唬?）患者存在代謝性疾病如高血脂、高血壓、糖尿病等，以及肝腎功能不全；（4）患者存在其他手術禁忌證等。所有樣本在取材前均與患者簽署知情同意書。同時收集乳腺良性病變患者血液樣本32 例，其中乳腺纖維腺瘤24 例，乳腺囊性增生5 例，乳腺導管內乳頭狀瘤3 例，以及同期在醫(yī)院體檢中心體檢的健康女性志愿者血液樣本40 例。同時收集手術切除的乳腺癌組織10 例，以距離癌組織5 cm之內的癌旁乳腺組織標本作為對照。

1.2 主要試劑ELISA檢測試劑盒（武漢基因美科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）；Trizol（美國Invitrogen 公司）；引物（上海生工基因有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；兔抗人PTN 抗體，兔抗人GAPDH 抗體，HRP 標記羊抗兔抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；癌胚抗原定量測定試劑盒，糖類抗原125 測定試劑盒，糖類抗原153 測定試劑盒（上海羅氏診斷產品有限公司）。超凈工作臺（新加坡ESCO 公司），酶標儀（美國Promega 公司），臺式低溫高速型離心機（美國Thermo 公司），微量移液器（美國Eppendorf 公司），熒光定量PCR儀（美國Roche 公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 ELISA 法檢測血清PTN 表達收集受試者空腹靜脈血3 mL，室溫3 500 r/min 離心10 min，分離血清，取PTN 檢測試劑盒，依次加入樣品稀釋液（40 μL）、待測樣本（10 μL）和酶標試劑（50 μL），封板；37 ℃溫浴30 min；小心揭掉封板膜，迅速甩去液體，拍干，加入洗滌液緩慢震蕩，洗去多余的酶標試劑，反復操作5 次后拍干；分別加入顯色劑A 和B 各50 μL，37 ℃避免光照顯色10 min；加入終止液終止反應。用酶標儀測定樣本的吸光度OD值（450 nm 波長下）。梯度稀釋的人重組PTN細胞因子設立標準曲線。

1.3.2 RT-PCR檢測PTN mRNA水平使用TRIzol法提取組織中的總RNA，然后進行反轉錄實驗（PrimeScript RT reagent Kit），獲得cDNA，反轉錄體系20 μL（其中包括1 μL 總RNA，1 μL random primer，10 μL ddH2O，2 μL dntp，1 μL RNA 酶抑制劑，4 μL Reaction buffer，1 μL 反轉錄酶）；反轉錄條件為：25 ℃5 min；42 ℃60 min，70 ℃5 min。取各組cDNA，使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ在Light-Cycler480II 定量平臺以GAPDH 為內參進行Realtime PCR 實驗。PTN 引物：前引物-GCTGCCTTCTTGGCATTCAT，后引物-CACTCCACTGCCATTCTCCA；GAPDH的引物：前引物-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA，后引物-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTG。反應體系為：1 μL 模板cDNA，0.5 μL + 0.5 μL 上下游引物，8 μL ddH2O，10 μL SYBR MIX，總體積20 μL；PCR條件為：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃20 s，40 個循環(huán)；65 ℃5 s。最后計算基因的相對表達量。

1.3.3 Western Blot 檢測PTN 蛋白表達使用總蛋白抽提試劑盒提取各組織總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白質定量，然后取20 μg的蛋白上樣，行SDS-PAGE 電泳分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉印到PVDF 膜上。用含5%脫脂奶粉/1×TBST的封閉液封閉3 h后，加入兔抗PTN抗體一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，1×TBST 清洗3 次，每次15 min，清洗后加入HRP 標記的羊抗兔IgG（1∶10 000），IgG 二抗（1∶500），平板搖床50 r/min 孵育2 h，1×TBST 清洗，ECL 發(fā)光檢測，使用多色熒光凝膠成系統(tǒng)曝光后觀察條帶。實驗得到的蛋白條帶采用Image J 軟件進行定量分析。

1.3.4 電化學發(fā)光法檢測樣本血漿中CEA、CA125和CA153 表達抽取患者禁食12 h 以上的空腹抗凝靜脈血3 ～5 mL，3 500 r/min 離心10 min，分離血漿，使用Cobas E602 全自動免疫分析儀檢測血漿中CEA、CA125 和CA153 含量。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0 軟件對數據進行處理，計量資料采用均數±標準差，采用t-test 以及單因素方差分析；以假陽性率為橫坐標，真陽性率為縱坐標繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線），根據約登指數確定PTN 及CA153、CEA、CA125的最佳截斷值，比較它們診斷乳腺癌的敏感性與特異性高低差異以及四項聯合檢測乳腺癌的能力。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血清PTN 表達水平比較分別測定乳腺癌患者（113 例）、乳腺良性病變患者（32 例）及健康體檢者（40例）血清PTN表達水平，結果顯示：乳腺癌患者組血清PTN 表達水平（573±164.3）pg/mL高于乳腺良性病變組（338.1 ± 130）pg/mL 和健康對照組（296.6 ± 86.5）pg/mL（t=-8.4，P＜0.05；t=13.2，P＜0.05），乳腺良性病變組和健康對照組差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.56，P＞0.05）。

2.2 乳腺癌組織及癌旁正常組織中PTN 基因表達差異運用Real Time-PCR的方法檢測了乳腺癌組和癌旁正常組織中PTN mRNA的表達量，結果顯示：乳腺癌組織PTNmRNA 表達量高于癌旁正常組織，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖1-3）。

圖1 PTN 基因和內參β-actin 基因實時熒光定量PCR 溶解曲線圖Fig.1 Dissolution curve of RT-PCR of the PTN and β-actin gene

圖2 Real Time-PCR 檢測乳腺癌及癌旁正常組織中PTN基因的表達Fig.2 Expression of PTN gene in breast cancer and adjacent normal tissues detected by Real Time-PCR

2.3 乳腺癌組織及癌旁正常組織中PTN 蛋白的表達差異用Western Blot 法分別檢測乳腺癌組織及癌旁正常組織中PTN 蛋白的表達情況，結果顯示：相比于癌旁正常組織，乳腺癌組織中PTN 蛋白表達量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4 ～5）。

2.4 PTN 與乳腺癌患者臨床病例特征相關性分析結合患者臨床病理資料分析，結果發(fā)現，PTN的表達水平與乳腺癌患者TNM 分期、遠處轉移以及腫瘤分化有關（P＜0.05）。但乳腺癌患者血清PTN的表達不受患者的年齡因素、淋巴節(jié)轉移與否、激素（ER、PR、HER2）表達水平高低、瘤體直徑大小、是否三陰性乳腺癌的影響，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

圖3 乳腺癌組織及癌旁組織PTN mRNA 表達差異Fig.3 Differences in PTN mRNA expression in breast cancer tissues and adjacent tissues

圖4 Western Blot 檢測乳腺癌組織及癌旁正常組織中PTN蛋白表達差異Fig.4 Differences in PTN protein expression in breast cancer tissues and adjacent normal tissues detected by Western Blot

圖5 PTN 蛋白灰度值計算統(tǒng)計結果Fig.5 Statistical results of PTN protein grayscale calculation

2.5 比較PTN、CA153、CEA、CA125 對乳腺癌的診斷效能差異以假陽性率為橫坐標，真陽性率為縱坐標繪制ROC 曲線，根據約登指數確定最佳截斷值（PTN：417.5 pg/mL，CA153：22.5 ng/mL，CEA：3.15 ng/mL，CA125：21.7 ng/mL），PTN 對乳腺癌的診斷價值最高，曲線下面積（AUC）為0.893，其敏感度（Sen）和特異度（Spe）分別為76.7%和77.8 %，陽性似然比（PLR）為0.848，陰性似然比（NLR）為0.7 診斷比值比（DOR）為12.98。PTN 蛋白聯合CA153、CEA、CA125 診斷乳腺癌的AUC 為0.99（95%CI：0.98 ～1.00），敏感度為96.1%，特異度為98.6%，均高于單獨檢測價值（圖6、表2）

圖6 各指標診斷乳腺癌的ROC 曲線Fig.6 ROC curve of the diagnosis of breast cancer by each indicator

表1 血清PTN 蛋白表達與乳腺癌患者不同臨床特征的關系Tab.1 Relationship between serum PTN protein expression and different clinical characteristics of breast cancer patients ±s

表1 血清PTN 蛋白表達與乳腺癌患者不同臨床特征的關系Tab.1 Relationship between serum PTN protein expression and different clinical characteristics of breast cancer patients ±s

項目年齡＜50 歲≥50 歲腫瘤大小≤2 cm＞2 cm淋巴轉移有無遠處轉移有無TNM 分期Ⅲ期Ⅳ期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期分化高分化低分化ER 表達陽性陰性PR 表達陽性陰性HER2陽性陰性類型三陰性非三陰性例數60 53 44 69 77 36 88 25 30 20 63 50 76 37 58 55 85 28 59 54 17 96 PTN（pg/mL）653.1±115.7 706.9±123.8 635.5±99.6 584.2±138.1 678.4±141.0 599.7±143.3 728.1±131.5 612.6±109.7 632.7±110.3 749.7±124.6 599.1±119.2 702.9±129.4 572.26±75.72 671.54±106.93 600±126.6 582.5±194.3 605.6±132.1 580±156.5 597.3±146.6 590.1±160.8 691±158.6 672.1±133.5 F/t 值-1.306 1.123 1.481 2.384-1.860-2.487-2.577 0.259 0.442 0.105 0.335 P 值0.200 0.271 0.147 0.020 0.086 0.018 0.017 0.798 0.662 0.918 0.741

3 討論

對乳腺癌的臨床診斷，除了影像學資料之外，血清腫瘤標志物也在一定程度上提高了乳腺癌的臨床診斷準確率。

PTN 作為分泌性的生長因子，除了具有促血管生成、參與胚胎發(fā)育、參與炎癥反應等多種生物學功能，還參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［9］。研究發(fā)現，PTN在胰腺癌組織中呈現高表達，且與嗜神經侵襲、肝轉移、生存時間縮短密切相關［10］。在乳腺癌中PTN不但可以促進乳腺腫瘤血管生成，還可通過重塑腫瘤細胞微環(huán)境來促進乳腺腫瘤細胞的生長而轉移［11-12］。PTN 亦在肝癌、腦膠質瘤等癌癥中呈現出高表達［13-14］。現已證實，PTN主要通過與其受體結合，激活下游多條信號通路，破壞細胞間黏附能力，影響細胞骨架的穩(wěn)定，從而發(fā)揮其生物學功能，促進惡性腫瘤細胞的生長以及遠處轉移［11］。

表2 PTN、CA153、CEA、CA125 對乳腺癌的診斷價值比較Tab.2 The diagnostic value of PTN，CA153，CEA and CA125 in breast cancer

本研究證實乳腺癌患者血清中PTN 蛋白水平高于乳腺良性病變組和健康對照組血清中PTN的含量，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。RT-PCR、Western Blot 實驗結果顯示：與癌旁正常組織相比，在乳腺癌組織中PTN mRNA 呈現高表達，且PTN 蛋白表達水平也同樣較高，差異有統(tǒng)計學意義，說明PTN 可能參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。結合乳臨床病理資料分析顯示：有遠處轉移、Ⅲ+Ⅳ期、分化程度低的患者其血清PTN 濃度越高，說明血清中PTN 蛋白水平與乳腺癌的遠處轉移、TNM 分期、分化程度有關。推測PTN 在乳腺癌的發(fā)生和侵襲中可能發(fā)揮重要作用，檢測血清PTN 水平有助于評估乳腺癌的轉移風險和預后情況。

腫瘤標志物對腫瘤的輔助診斷、治療效果監(jiān)測和預后評估具有重要價值。有報道CA153 在監(jiān)測乳腺癌術后有、無轉移的診斷價值上欠佳，但術前CA153的水平可作為早期乳腺癌預后的獨立因素［15］。CEA單獨檢測乳腺癌時靈敏度較低，常和其他腫瘤標志物聯合檢測［16-17］。CA125 是女性生殖系統(tǒng)常用的腫瘤標志物，其表達水平受很多因素的影響，如異位妊娠、冠心病心力衰竭等。本研究檢測了乳腺癌患者、乳腺良性病變者以及健康體檢者外周血中PTN、CA153、CEA、CA125的表達水平，結果發(fā)現，PTN 診斷乳腺癌的曲線下面積最大，且敏感性較其他3 種腫瘤標志物高，但PTN 診斷乳腺癌的特異度較CA153 低。PTN 聯合CA153、CEA和CA125 診斷乳腺癌的AUC 較單獨檢測時明顯增大。綜上所述，檢測血清PTN 水平有助于評估乳腺癌的轉移風險和預后情況，與CA153、CEA 以及CA125聯合檢測可明顯提高對乳腺癌的診斷價值。

由于樣本量的限制，本研究對乳腺癌組織中PTN 表達與臨床病理學數據之間的關系分析未能進行深入研究。對PTN 與乳腺腫瘤發(fā)展的分子機制的進一步明確，還需后續(xù)開展深入研究及結合大樣本的臨床資料進行分析總結。