硫代嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因多樣性對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病患兒使用糖皮質(zhì)激素耐受性的影響

趙愛玲 丁大領(lǐng) 李雪琴 王江濤

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院小嬰兒病區(qū)（鄭州450018）

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種影響兒童和青少年的腫瘤，其特征為骨髓中過量產(chǎn)生的未成熟白細(xì)胞。糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）在兒科ALL 治療中發(fā)揮重要作用，治療效果十分顯著，但通常伴隨嚴(yán)重的短期和長(zhǎng)期的副作用，并且有約25%的患者會(huì)產(chǎn)生治療失敗的現(xiàn)象，部分原因是因?yàn)镚Cs 使用過程中導(dǎo)致的不良反應(yīng)造成的［1］。

基因的遺傳變異決定個(gè)體對(duì)藥物劑量的耐受性［2］，既往藥物基因組學(xué)研究表明，治療ALL的藥物對(duì)兒童的毒性與單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）有一定的關(guān)系，而硫代嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）基因是其中研究最多的［3-4］。目前指南推薦ALL 患者在使用巰嘌呤前需進(jìn)行TPMT 基因的檢測(cè)，以指導(dǎo)ALL 患兒的合理用藥［5］。然而，GCs 作為治療白血病另一種廣泛使用的有效的藥物，目前還沒有關(guān)于TPMT 基因多樣性對(duì)于ALL 患兒中GCs 使用的副作用影響的研究，尤其是亞洲人群。因此，本研究通過在中國(guó)人群中評(píng)估TPMT 基因的SNPs 對(duì)治療期間發(fā)生的GCs 相關(guān)毒性的影響，了解個(gè)體的基因構(gòu)成與藥物安全性之間的關(guān)系，從而優(yōu)化ALL 患兒的個(gè)體化用藥指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究回顧性納入2008-2013年間被診斷為ALL的兒童患者245例，其中男151例，女94例；10歲以下患兒178例，10歲以上患兒67例。另外選取210 例對(duì)照組患者，按照基線點(diǎn)年齡、性別、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血糖和肝功能情況進(jìn)行匹配，納入條件為之前沒有發(fā)展為ALL 或其他癌癥的患者。該研究得到了鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。入組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)詳細(xì)的病史詢問和常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢查后符合ALL的診斷，同時(shí)滿足以下條件：（1）未滿18歲；（2）骨髓原始細(xì)胞≥20%；（3）基線時(shí)間點(diǎn)無感染癥狀、血糖和肝功能正常；（4）沒有其他活動(dòng)性惡性腫瘤。

1.2 隨訪在基線點(diǎn)收集的數(shù)據(jù)包括完整的血常規(guī)信息，常規(guī)生化檢測(cè)信息和骨髓穿刺結(jié)果。獲得的臨床數(shù)據(jù)在基因型結(jié)果未知的情況下，由兒科腫瘤學(xué)家進(jìn)行盲法評(píng)估。為了排除其他化療藥物對(duì)于臨床表型檢測(cè)的影響，所有的ALL 患兒進(jìn)行常規(guī)治療后，每7 天復(fù)查1 次，并根據(jù)NCI2000毒性標(biāo)準(zhǔn)量表，收集患者毒性數(shù)據(jù)并進(jìn)行回顧性分級(jí)［6］，根據(jù)NCI-CTC 對(duì)患兒進(jìn)行感染發(fā)生率分類，記錄第一次發(fā)生異常和感染的隨訪時(shí)間，終點(diǎn)為發(fā)生相應(yīng)事件和使用6-MP 化療。

1.3 血樣采集和檢測(cè)在基線時(shí)間點(diǎn)，使用含EDTA 鈉采樣管中收集患者大約2 mL的外周血，并使用QIAmp DNA blood kit（Qiagen Inc.）試劑盒按照說明書提取DNA。已知TPMT 基因的3 個(gè)SNP 位點(diǎn)：G238C、G460A 和A719 G，會(huì)導(dǎo)致TPMT缺乏，并根據(jù)YATES 等［7］發(fā)表文獻(xiàn)中的方法來進(jìn)行鑒定。SNP 陽(yáng)性病例使用ABI 3130 遺傳分析儀（Applied Biosystems）通過Sanger 測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)并將其分類為雜合子或純合子。PCR 擴(kuò)增引物序列如下：G238C（Exon 5）野生型P2W：5′-GTATGATTTTATGCAGGTTTG-3′，P2C：5′-TAAATAGGAACCATCGGACAC-3′；突變型P2M：5′-GTATGATTTTATGCAGGTTTC-3′，P2C 5′-TAAATAGGAACCATCGGACAC-3′；G460A（Exon 7）：P460F 5′-ATAACAGAGTGGGGAGGCTGC-3′，P460R 5′-CTAGAACCCAGAAAAAGTATAG-3′；A719 G（Exon 10）：P719NF 5′-GTTACTCTTTCTTGTTTCAGG-3′，P719 NR 5′-TCCTCAAAAACATGTCAGTGTG-3′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有的計(jì)算都在SPSS 23.0 軟件（SPSS，Inc.，Chicago，USA）上進(jìn)行，使用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)比較兩組患兒的基因型分布；使用t檢驗(yàn)比較不同SNP 之間臨床指標(biāo)，用M（P25，P75）表示；使用單因素COX regression 回歸和χ2檢驗(yàn)研究葡萄糖代謝異常、肝毒性和對(duì)感染的易感性同TPMT 基因的SNP 之間的關(guān)聯(lián)；非條件Logistic 回歸中使用雙側(cè)Fisher 精確檢驗(yàn)計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPMT基因的等位頻率和基因型分布GCS的藥物基因組學(xué)主要分析TPMT基因的3種SNP分布。對(duì)于所有TPMT 基因的SNP 位點(diǎn)，如表1 所示ALL患兒和對(duì)照組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與理論上是一致的，因?yàn)門PMT 基因與ALL 疾病的發(fā)生無顯著的相關(guān)性。對(duì)于G238C 位點(diǎn)，等位基因C（野生型）的頻率為92.0%，等位基因G 其為8.0%（突變型）；此外，最常見的基因型是CC（84.0%），不是GC 雜合基因型（16.0%），而病例和對(duì)照的GG純合基因型頻率都是0。對(duì)于G460A 和A719 G 兩種SNP 來說，其基本分布與G238C的情況類似，都是野生型居多，且全部為雜合。

表1 TPMT 基因的SNP 在兒童白血病和對(duì)照組中的等位頻率和基因型分布Tab.1 Allelic frequencies and genotype distribution of TPMT SNPs in childhood ALL participants and control subjects in baseline point

2.2 TPMT 基因的基因型與治療中糖皮質(zhì)激素相關(guān)副作用的關(guān)系在化療后2 周，復(fù)查患者的肝功能、血糖水平和感染情況，與基線水平進(jìn)行比較，并評(píng)估其與TPMT基因型之間的關(guān)系。用白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）和降鈣素原（PCT）代表患者的感染情況，結(jié)果顯示，攜帶G238C和G460A變異的患者，其GC相關(guān)感染指標(biāo)與正常人無明顯區(qū)別，但攜帶A719G患者的其降鈣素原水平顯著升高（P=0.025）。對(duì)于肝功能情況來說，G460A 變異與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和谷門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的升高都有顯著關(guān)系（P= 0.009 和0.010），但G238C 和A719G則無明顯差別。見表2。

Logistics回歸的結(jié)果見表3。將WBC ＞10×109/L或PCT ＞0.5 ng/mL定義為感染，將空腹尿糖（Glu）＞6.1 mmol/L或糖化血紅蛋白（HbA1c）＞6%定義為血糖代謝異常，將ALT ＞80 U/L或AST ＞80 U/L定義為肝功能異常。結(jié)果顯示，G460A 與肝毒性顯著相關(guān)（P=0.014），但3種SNP與血糖代謝都無明顯關(guān)系。對(duì)于感染來說，A719G 變異與感染顯著相關(guān)（P=0.021），但與G238C和G460A變異則無顯著相關(guān)性。

表2 治療14 d 時(shí)白血病患兒不同SNP的臨床指標(biāo)比較Tab.2 Clinical characteristics of ALL children categorized by different SNPs during therapy M（P25，P75）

表3 治療14 d 時(shí)兒童白血病患者基因型和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的肝毒性、血糖代謝異常及感染之間的關(guān)系Tab.3 Genotype in ALL children related to glucocorticoid induced liver toxicity，glucose abnormalities and infection during therapy

2.3 隨訪至誘導(dǎo)期時(shí)TPMT 基因型和糖皮質(zhì)激素相關(guān)副作用之間的COX 回歸分析在化療后半年內(nèi)，定期對(duì)患者進(jìn)行隨訪，復(fù)查患者的肝功能、血糖水平和感染情況，并記錄時(shí)間。對(duì)3 種結(jié)果事件進(jìn)行3 種SNP的多因素分析，見表4。結(jié)果顯示，A719G 變異是GCs 治療后感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P= 0.044），而G238C 和G460A 變異則不是感染的危險(xiǎn)因素。同樣的，對(duì)于肝毒性和血糖異常來說，本研究的數(shù)據(jù)未能說明TPMT的3 種SNP是其發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

既往研究表明，ALL 治療中最重要的預(yù)后因素是前期治療階段患者對(duì)于GCs 使用的反應(yīng)。患者對(duì)于GCs的反應(yīng)差別很大，并伴隨著各種副作用和心理變化，最重要的副作用是脂肪分布改變、暫時(shí)性糖尿病、肝腫大和免疫抑制導(dǎo)致的感染風(fēng)險(xiǎn)的增加［8］，并且兒童患者對(duì)GCs 治療相關(guān)的不良事件更敏感，即使基于體重進(jìn)行劑量調(diào)整也是如此。使用GCs的風(fēng)險(xiǎn)廣為人知，并發(fā)癥包括消化性潰瘍病、下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸抑制、脂肪肝、骨質(zhì)疏松癥和感染易感性增加［9］。盡管如此，糖皮質(zhì)激素仍然是治療急性淋巴細(xì)胞白血病的必需藥物。超生理劑量的GCs 可以抑制HPA軸，并且可能導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)受損和宿主對(duì)感染的防御不足，最終造成發(fā)病和死亡［10］。然而，最近的研究表明低GCs 劑量也與一些不良反應(yīng)有關(guān)，并且這些效應(yīng)在不同患者中是不同的［11］，筆者考慮可能與患者的個(gè)體遺傳特征的差異性有關(guān)。

表4 化療誘導(dǎo)期時(shí)基因型和糖皮質(zhì)激素相關(guān)毒性之間的關(guān)系Tab.4 Relationship of genotype and glucocorticoid induced toxicity during half-a-year′s follow-up by multivariate cox regression

TPMT 基因的SNPs 與患者對(duì)藥物使用的反應(yīng)、抗性、副作用和毒性密切相關(guān)，尤其是ALL 常用藥物6-MP，在很多前期研究中被證實(shí)。然而，目前并沒有關(guān)于TPMT 與GCs 使用副作用之間關(guān)系的研究，考慮到糖皮質(zhì)激素等類固醇類藥物在人體中涉及到諸多代謝途徑，因此探究TPMT 基因與GCs 相關(guān)副作用的關(guān)系是必要的。在ALL的化療過程中，6-MP 是基本用藥，因此本研究在設(shè)計(jì)時(shí)只選取了化療誘導(dǎo)階段，此時(shí)并沒有使用6-MP，因此可以排除是6-MP 藥物帶來的副反應(yīng)。檢測(cè)和調(diào)查人群中的SNP 頻率是檢測(cè)疾病治療結(jié)果和藥物療效的個(gè)體間差異的基礎(chǔ)，基于這點(diǎn)，筆者試圖確定中國(guó)人群中TPMT 基因中G238C、G460A 和A719G 3 種SNPs的等位基因頻率，并確定這些SNP 與GCs 毒性之間的關(guān)聯(lián)。TPMT 基因是常染色體共顯性遺傳，純合等位基因突變個(gè)體是TPMT 缺陷的，而雜合子個(gè)體具有中間酶活性［12］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，TPMT*3A SNP 在高加索人群中的患病率較高［13-14］，而亞洲人群的頻率低于5%［15-16］。在本研究中，共有455 例中國(guó)人群納入研究中，結(jié)果顯示純合CC基因型頻率為84%，雜合GC 頻率為16%，且未發(fā)現(xiàn)突變基因型GG。C的等位基因頻率約為9%，較dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)上報(bào)道的頻率略高［17］。

前期有很多在白血病和正常志愿者患者中關(guān)于TPMT 基因型與表型之間的關(guān)系的研究，其中G238C、G460A 和A719G 是進(jìn)行的最多的。本研究發(fā)現(xiàn)，TPMT 基因的SNP 多態(tài)性確實(shí)與GCs 相關(guān)的副作用存在一定的關(guān)聯(lián)性，其中A719G 與GCs 有關(guān)感染的相關(guān)性最大，并在本研究中是誘導(dǎo)階段使用GCs 后發(fā)生感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但基因多樣性與藥物副作用的關(guān)系并不是單一的，前期鄒澤巧等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，CYP1A1 A4889G 多態(tài)性與ALL 兒童甲氨蝶呤化療后各毒副反應(yīng)無關(guān)，但與血小板減少發(fā)生的可能性相關(guān)。除此之外，在本研究中，攜帶有SNP 突變的患者的肝毒性比例更高，但只有G460A 與肝毒性顯著相關(guān)，而3 種SNP與血糖代謝都無明顯關(guān)系。但齊興菊等［19］研究發(fā)現(xiàn)A719G、G460A 基因型與化療后不良反應(yīng)并無明顯相關(guān)性。造成這種差異的可能性是因?yàn)樵撗芯繘]有完全區(qū)分不同化療藥物的影響，也沒有嚴(yán)格區(qū)分檢測(cè)時(shí)間導(dǎo)致的。

本研究首次在中國(guó)ALL 患兒中研究TPMT 基因與糖皮質(zhì)激素化療后的副反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)，通過排除相關(guān)干擾因素，得出了TPMT A719G 位點(diǎn)與糖皮質(zhì)激素的使用導(dǎo)致兒科ALL 治療期間發(fā)生感染有關(guān)，為臨床上ALL 患兒GCs的使用提供一定的用藥指導(dǎo)。然而，本研究存在一定的不足之處。雖然納入的樣本量較大，但缺乏多中心、多樣化的數(shù)據(jù)，為結(jié)論的進(jìn)一步推廣帶來一定的局限性；其次，本研究雖然揭示了TPMT 基因SNP 位點(diǎn)與不良反應(yīng)之間的關(guān)系，但其背后的機(jī)制未進(jìn)行深入的探討。下一步需要進(jìn)一步的多中心、多人種的樣本來驗(yàn)證其中的關(guān)聯(lián)性，并且需要進(jìn)一步探究臨床聯(lián)系背后的具體機(jī)制。

終上所述，在治療開始前充分預(yù)測(cè)抗白血病藥物反應(yīng)是必要的。TPMT 基因的多態(tài)性，不僅與6-MP 藥物的副作用密切相關(guān)，而且與可能也與GCs 使用的副作用有密切關(guān)系。通過這些調(diào)查，臨床醫(yī)生可以根據(jù)特定基因中遺傳易感性調(diào)整個(gè)體化GCs 劑量，減少嚴(yán)重毒性的風(fēng)險(xiǎn)，提高治療效果。